阅读说明：本技术 一种棉花染色体加倍的方法 (Cotton chromosome doubling method ) 是由 周宝良 陈于 于 2019-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种棉花染色体加倍的方法,该方法为用滴加了二甲基亚砜的秋水仙碱溶液对从棉花植株上剪下来的嫩芽进行加倍处理,将加倍处理后的嫩芽嫁接到砧木上,嫁接苗长大后,叶片增大增厚者有可能为染色体加倍植株；待棉花长至现蕾时,取其花蕾进行常规的染色体数目观察,从细胞学上直接观察染色体数目,增加一倍者即为加倍植株；如果处理材料是棉花三倍体种间杂种,则育性正常或有提高者可能为染色体加倍植株,通过细胞学进行染色体数目确认得到染色体加倍植株。本发明方法通过该离体处理加倍技术,工作量小、无需组织培养过程,在实验室内处理不易受环境影响,成功率高,不存在原植株死亡的问题,一般当年处理、当年就可获得染色体加倍的植株。(The invention discloses a method for doubling cotton chromosomes, which is characterized in that a colchicine solution dropwise added with dimethyl sulfoxide is used for doubling tender shoots cut from cotton plants, the doubled tender shoots are grafted onto stocks, and after grafted seedlings grow up, leaves are enlarged and thickened to possibly double the plants for the chromosomes; when the cotton grows to bud, taking the bud to carry out conventional chromosome number observation, directly observing the chromosome number in cytology, and obtaining a doubled plant if the chromosome number is doubled; if the treated material is a cotton triploid interspecific hybrid, then a plant with normal or improved fertility may be a chromosome-doubled plant, and chromosome number confirmation is performed cytologically to obtain a chromosome-doubled plant. The method of the invention adopts the in vitro processing and doubling technology, has small workload, does not need a tissue culture process, is not easily influenced by the environment in a laboratory, has high success rate, does not have the problem of death of the original plant, and can obtain the plant with doubled chromosomes in the current year by processing in general.)

一种棉花染色体加倍的方法

技术领域

本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种棉花染色体加倍的方法。

背景技术

棉属的52个种中，45个为二倍体种，2n＝2x＝26，是改良栽培棉的重要基因来源，然而，占世界棉花产量95％以上的栽培棉为异源四倍体，2n＝4x＝52。二倍体与四倍体杂交得到杂种F1为三倍体(2n＝3x＝39)，高度不育。其主要原因有：(1)棉属种间染色体的同源程度低。杂种F1的染色体在减数***时不能配对成正常的二价体，同源性差的染色体多呈单价体存在；(2)棉属种间染色体结构上的差异，如染色体易位，形成多价体和单价体，导致杂种配子的高度不育性、杂合性和细胞学变异性，甚至发生体细胞减数和嵌合体的形成。为了克服三倍体杂种F1的不育性，钱思颖(1988)认为，胚珠的正常程度可能随杂交组合、花器官形成时的日照、温度及宿根保存的年限而有不同，可采用直接回交法进行克服，然而大量棉花种间杂交的研究结果表明，在极大多数情况下直接回交很难取得成功，即便得到回交种子，数量也非常有限，一般只有1到2粒种子，其中的染色体数目可能不完整，难以满足后代研究需要。因此，理想的方法是利用秋水仙碱进行染色体加倍，获得异源多倍体。

利用秋水仙碱处理F₁种子，对于能获得大量杂交种子的组合来说，利用种子加倍处理来克服F₁的不育性是有利的(彭跃进、钱思颖，1989；刘金兰等，1990；王志宁等，1990)，但对于难以获得大量杂种F₁的组合而言，种子处理途径也不现实。梁正兰等则(1978)经过则对杂交铃滴(喷)GA₃和NAA——杂种胚离体培养——试管内染色体加倍三者相结合，获得了染色体加倍的后代，提供了一条染色体加倍的技术途径，但显然技术上较为繁琐，需要借助于组织培养等，目前已较少应用。

因此，前人通常通过处理活体嫩芽从而直接获得染色体加倍的植株，但这种方法存在许多不足：如，活体处理嫩芽存在许多不可控的环境因素，环境条件不易控制；其次，浓度过高处理时间过长，容易导致植株死亡或嫩芽枯死，相反，浓度过低处理时间过短，得不到染色体加倍的植株，难以把握时间和浓度。棉花染色体加倍难，已成为育种利用二倍体棉花基因资源的重要障碍之一。为了克服上述难题，本技术发明利用离体嫩芽进行秋水仙碱处理，通过调试不同浓度和不同时间等，从而成功获得染色体加倍了的植株后代，为育种利用扫除了三倍体杂种F1的技术障碍。

发明内容

本发明所针对的技术问题：传统方法利用秋水仙碱处理大量种子，达到极少数植株染色体加倍的目的；但对于杂交不亲和性强的杂交组合，则很难获得足够的杂交种子用于染色体加倍处理。因此，一般情况下，都是在获得植株的基础上进行染色体加倍处理的。对于植株加倍处理，一般选取其嫩芽直接活体加倍。但活体嫩芽处理，一是存在植株死亡的风险，二是环境不易控制，加倍效率很低或甚至不成功，已成为限制育种利用二倍体棉花基因资源的重要障碍之一。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种棉花染色体加倍的方法。该方法采用嫩芽离体在实验室内加倍处理，有效地克服了前人技术的缺陷。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案为：

一种棉花染色体加倍的方法，该方法为用滴加了二甲基亚砜(DMSO)的秋水仙碱溶液对从棉花植株上剪下来的嫩芽进行加倍处理，将加倍处理后的嫩芽嫁接到砧木上，嫁接苗长大后，叶片增大增厚者有可能为染色体加倍植株；待棉花长至现蕾时，取其花蕾进行常规的染色体数目观察，从细胞学上直接观察染色体数目，增加一倍者即为加倍植株；如果处理材料是棉花三倍体种间杂种，则育性正常或有提高者可能为染色体加倍植株，通过细胞学进行染色体数目确认得到染色体加倍植株。

作为一种优选技术方案，该方法具体包括以下：

(1)种植生长健壮的棉花植株，摘除主茎生长点，使其长出侧枝，形成许多嫩芽；

(2)剪取带2-3张叶片的侧枝嫩芽，去除其上的较大叶片，防止水分蒸发而萎蔫；将剪取的侧枝嫩芽***滴加了二甲基亚砜的秋水仙碱溶液中进行加倍处理；

(3)秋水仙碱加倍处理过的侧枝嫩芽，嫁接到砧木上，管理如常规嫁接法进行；

(4)嫁接苗长大后，叶片增大增厚者有可能为染色体加倍了的植株；待棉花长至现蕾时，取其花蕾进行常规的染色体数目观察，从细胞学上直接观察染色体数目，增加一倍者即为染色体加倍植株；如果处理材料是棉花三倍体种间杂种，则育性正常或有提高者可能为染色体加倍植株，通过细胞学进行染色体数目确认得到染色体加倍植株。

最优选的，所述秋水仙碱溶液的浓度为0.1％(0.1g/100ml)；所述二甲基亚砜原液的滴加量为100ml溶液中5-8滴。所述加倍处理的时间为22～26h，最优选为24h。

本发明的有益效果：

本发明所提供的一种棉花染色体加倍的新方法，与传统的染色体加倍技术相比具有如下优点：传统的染色体加倍技术存在处理的工作量大、成功率低、易受环境影响、棉花植株容易死亡，有时秋水仙碱溶液处理多年没有获得加倍成功的植株等。通过该离体处理加倍技术，工作量小、无需组织培养过程，在实验室内处理不易受环境影响，成功率高，不存在原植株死亡的问题，一般当年处理、当年就可获得染色体加倍的植株。

附图说明：

图1表示棉花染色体离体加倍的流程。

具体实施方式

实施例1

秋水仙碱溶液配制：称取1g秋水仙碱晶体，溶于凉的100ml蒸馏水中，作为母液，用时再稀释10倍，再在100ml溶液中加入5-8滴二甲基亚砜(DMSO)原液。

砧木准备：在准备嫁接前2-3周播种嫁接用的砧木材料于花盆中，以抗病品种作砧木较宜(可避免因土壤带病而嫁接苗不慎感病导致死亡)，砧木长至1片真叶后备用。

棉花嫩芽准备：生长健壮的植株栽于盆钵上，长至6片真叶以上，去除主茎生长点；2-3周后，出现许多侧枝嫩芽；

用小手术剪刀，剪取其带2-3张叶片的侧枝嫩芽，去除其上的较大叶片，防止水分蒸发而萎蔫；立即拿回室内，在实验室室温下，***含有预先配制好的50ml 0.1％秋水仙碱溶液(含二甲基亚砜原液，促进渗透)试管中进行加倍处理，24h后取出；

秋水仙碱处理过的嫩芽，去除细嫩幼叶，将嫩芽修成楔型，切除砧木主茎生长点至第1片真叶着生节位之上，将主茎沿纵轴中间剖开，立即将处理嫩芽***到砧木上，用塑料绳系牢，封好伤口，防止接穗晃动，套上指型套后用绳扎紧，盆中浇足水，嫁接结束后置于阴凉处；5d后观察，注意浇水，防止干旱萎蔫；同时也要防止湿度过大，可以通风降湿，免使接穗发黑死亡；10d接穗成活后即可去除指型套，再过1周后可以去除嫁接处的塑料绳，过晚去绳可能造成茎部缢缩，主茎易折断；

嫁接苗成活长大后，观察植株表型，叶片增大增厚者有可能为染色体加倍了的植株；待棉花长至现蕾时，取其花蕾进行常规的染色体数目观察，从细胞学上可以直接观察染色体数目，增加一倍者即为加倍植株；如果处理材料是棉花三倍体种间杂种，则可发现育性正常或有提高者，即可能为加倍植株，可通过细胞学进行染色体数目确认。

以(陆地棉×亚洲棉)F₁(2n＝ADA＝39)种间杂种为例。通过幼胚拯救，获得了6株三倍体杂种F1植株，当年未经任何处理，表现高度不育，开了500朵花左右，但没有获得一粒后代种子，当年冬天植株在温室中越冬保存。次年夏天，移出温室，取其侧枝嫩芽，离体嫩芽在含有秋水仙碱溶液的试管中，用0.05％、0.10％、0.15％三个浓度的秋水仙碱在实验室内常温下对杂种F₁离体侧枝嫩芽分别处理24h，36h和48h，各处理30个嫩芽，总共处理了约360个侧芽嫩芽，嫁接到砧木上，分批进行染色体加倍处理。结果表明，离体侧枝嫩芽用0.10％的秋水仙素溶液处理24h，30个芽头经处理后成活了18株，经形态学鉴定、育性鉴定和细胞学鉴定，其中有4个植株的染色体成功加倍，育性得到大幅度提高，获得了大量自交种子或回交种子。其余处理存活下来的嫩芽生长缓慢，生长一段时间后大部分嫩芽脱落死亡，没有获得一株染色体加倍的植株，效果不理想。