一种提高双单倍体成活率的方法
阅读说明：本技术 一种提高双单倍体成活率的方法 (Method for improving survival rate of double haploids ) 是由 刘艳红 王建民 付建征 韩福祥 付俊清 李娜 张泽伟 于 2021-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高双单倍体成活率的方法,包括以下步骤：步骤一、玉米单倍体种子的筛选；步骤二发芽纸的准备：将所购滤纸折成大小合适的扇形,大小要一致；步骤三、消毒剂的配制；步骤四、叠好的扇形滤纸放入配好的溶液中,适量水分后取出放到托盘上；步骤六、将上述获得的预处理后的单倍体种子播种于营养土中、浇水,遮阳培养至三叶一心；步骤七、染色体加倍的玉米幼苗移栽及管理。本发明所提供的玉米双单倍体幼芽成活率方法能显著地提高玉米单倍体的加倍过程中双单倍体幼芽的成活率,有利于双单倍体植株的选育,解决了单倍体育种过程中单倍体萌发过程中长菌影响单倍体幼芽成活率的技术难题,从而大大提高了双单倍体成活率。(The invention discloses a method for improving the survival rate of a doubled haploid, which comprises the following steps: step one, screening corn haploid seeds; step two, preparation of the germinating paper: folding the purchased filter paper into a fan shape with proper size, wherein the size is consistent; step three, preparation of a disinfectant; step four, putting the stacked fan-shaped filter paper into the prepared solution, taking out the filter paper after a proper amount of water is contained, and putting the filter paper on a tray; step six, sowing the obtained pretreated haploid seeds in nutrient soil, watering, and culturing in a sun-shading mode until three leaves and one heart are obtained; and seventhly, transplanting and managing the maize seedlings with doubled chromosomes. The method for survival rate of the doubled haploid sprouts of the corn can obviously improve the survival rate of the doubled haploid sprouts in the doubling process of the corn haploid, is beneficial to breeding of doubled haploid plants, solves the technical problem that the survival rate of the doubled haploid sprouts is influenced by growth bacteria in the monoploid germination process in the haploid breeding process, and greatly improves the survival rate of the doubled haploid.)
技术领域
本发明涉及育种技术领域，具体是一种提高双单倍体成活率的方法。
背景技术
我国是第二大玉米生产国和消费国，玉米产量和品质的提高需要不断改良发展育种手段。选育高产、高抗、高配合力的自交系是玉米育种中的基础和核心环节。单倍体育种是指利用植物单性生殖的方法，使其形成但被替换通过自然或人为的方式对其染色体进行加倍，成为纯合二倍体（即纯系），再从中选育新品种（系）的方法。
优良纯系的培育是玉米育种核心环节。利用传统的育种方法，一般需经过4-6代的自交才能使品系込到纯合。而且理论上讲，即使自交n代，基因型也不能达到100%的完全纯合状态。因此，选育一个品种通常需要数十年的时间，消耗大量的人力、物力和财力，因此如何缩短育种进程。提高育种效率是育种家们一直追求的目标，而单倍体育种技术通过控制杂种分离，2代便可得到纯合二倍体，加快了自交系的选育，显著缩短了育种周期。
单倍体加倍常用的方法有自然加倍法和药物加倍法。药物加倍是目前普遍利用的单倍体加倍方法，主要利用的药物有秋水仙素和除草剂。在秋水仙素浸芽法中，单倍体幼芽萌发过程中真菌生长严重，使双单倍体成活率低，因此，双单倍体成活率的提高对单倍体加倍具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高双单倍体成活率的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种提高双单倍体成活率的方法， 包括以下步骤： 步骤一、玉米单倍体种子的筛选；
步骤二发芽纸的准备：将所购滤纸折成大小合适的扇形，大小要一致；
步骤三、消毒剂的配制：配制的消毒剂的质量浓度约为0.1-0.5%的二氧化氯，根据以上浓度计算好药剂和蒸馏水的用量，先把二氧化氯加入烧杯中，加入蒸馏水待二氧化氯完全溶解后，摇匀后保存于塑料容器中；
步骤四、叠好的扇形滤纸放入配好的溶液中，适量水分后取出放到托盘上，单倍体种子冲洗干净，种子之间间隔1cm--1.5cm，均匀摆放到适量水分的扇形滤纸底部，用锡箔纸密封，放培养箱中培养；
步骤五、玉米单倍体种子的处理：
（1）切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端；
（2）用秋水仙素混合液处理幼芽；
将上述切去胚芽尖的单倍体幼芽放入容器内．将配置好的秋水仙素混合液倒入容器中，使所有切好的芽全部浸入，同时密封容器口，在23℃避光条件下处理12小时，得到染色体加倍的玉米幼芽；
（3）用清水冲洗浸泡后的单倍体种子1-2小时，得预处理后的单倍体种子；
步骤六、将上述获得的预处理后的单倍体种子播种于营养土中、浇水，遮阳培养至三叶一心；
步骤七、染色体加倍的玉米幼苗移栽及管理：
待步骤六培育的柒色体加倍的王来幼苗移栽到河北冀农种业有限责任公司试验站，同时用遮阳网遮阳5天，田间进行精细管理，确保幼苗正常生长，于幼苗期剔除非单倍体植株，人工授粉，得到单倍体玉米植株。
作为本发明的进一步方案，在步骤一中，所述玉米单倍体种子的筛选是挑选紫色粒顶无色胚的种子，得到单倍体种子；
作为本发明的进一步方案，在步骤二中，配制的消毒剂的质量浓度约为0.1-0.5%的二氧化氯，优选为消毒剂的质量浓度约为0.4%和0.5%。
作为本发明的进一步方案，在步骤四中，培养箱中培养温度为25-26度，培养时间为4天。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所提供的玉米双单倍体幼芽成活率方法能显著地提高玉米单倍体的加倍过程中双单倍体幼芽的成活率，有利于双单倍体植株的选育，解决了单倍体育种过程中单倍体萌发过程中长菌影响单倍体幼芽成活率的技术难题，从而大大提高了双单倍体成活率，使大规模应用单倍体加倍技术更有可能。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 一种提高双单倍体成活率的方法，包括以下步骤： 步骤一、玉米单倍体种子的筛选：
挑选紫色粒顶无色胚的种子，得到单倍体种子；
步骤二发芽纸的准备：将所购滤纸折成大小合适的扇形，大小要一致；
步骤三、消毒剂的配制：配制的消毒剂的质量浓度约为0.5%的二氧化氯，根据以上浓度计算好药剂和蒸馏水的用量，先把二氧化氯加入烧杯中，加入蒸馏水待二氧化氯完全溶解后，摇匀后保存于塑料容器中；
步骤四、叠好的扇形滤纸放入配好的溶液中，适量水分后取出放到托盘上，单倍体种子冲洗干净，种子之间间隔1cm--1.5cm，均匀摆放到适量水分的扇形滤纸底部，用锡箔纸密封，放培养箱，25-26度，培养4天；
步骤五、玉米单倍体种子的处理：
（1）切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端
（2）用秋水仙素混合液处理幼芽
将上述切去胚芽尖的单倍体幼芽放入容器内．将配置好的秋水仙素混合液倒入容器中，使所有切好的芽全部浸入，同时密封容器口，在23℃避光条件下处理12小时，得到染色体加倍的玉米幼芽；
（3）用清水冲洗浸泡后的单倍体种子1-2小时，得预处理后的单倍体种子；
步骤六、将上述获得的预处理后的单倍体种子播种于营养土中、浇水，遮阳培养至三叶一心；
步骤七、染色体加倍的玉米幼苗移栽及管理：
待步骤六培育的柒色体加倍的王来幼苗移栽到河北冀农种业有限责任公司试验站，同时用遮阳网遮阳5天，田间进行精细管理，确保幼苗正常生长，于幼苗期剔除非单倍体植株，人工授粉，得到单倍体玉米植株。
实施例2 一种提高双单倍体成活率的方法，包括以下步骤： 步骤一、玉米单倍体种子的筛选：
挑选紫色粒顶无色胚的种子，得到单倍体种子；
步骤二发芽纸的准备：将所购滤纸折成大小合适的扇形，大小要一致；
步骤三、消毒剂的配制：配制的消毒剂的质量浓度约为0.4%的二氧化氯，根据以上浓度计算好药剂和蒸馏水的用量，先把二氧化氯加入烧杯中，加入蒸馏水待二氧化氯完全溶解后，摇匀后保存于塑料容器中；
步骤四、叠好的扇形滤纸放入配好的溶液中，适量水分后取出放到托盘上，单倍体种子冲洗干净，种子之间间隔1cm--1.5cm，均匀摆放到适量水分的扇形滤纸底部，用锡箔纸密封，放培养箱，25-26度，培养4天；
步骤五、玉米单倍体种子的处理：
（1）切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端
（2）用秋水仙素混合液处理幼芽
将上述切去胚芽尖的单倍体幼芽放入容器内．将配置好的秋水仙素混合液倒入容器中，使所有切好的芽全部浸入，同时密封容器口，在23℃避光条件下处理12小时，得到染色体加倍的玉米幼芽；
（3）用清水冲洗浸泡后的单倍体种子1-2小时，得预处理后的单倍体种子；
步骤六、将上述获得的预处理后的单倍体种子播种于营养土中、浇水，遮阳培养至三叶一心；
步骤七、染色体加倍的玉米幼苗移栽及管理：
待步骤六培育的柒色体加倍的王来幼苗移栽到河北冀农种业有限责任公司试验站，同时用遮阳网遮阳5天，田间进行精细管理，确保幼苗正常生长，于幼苗期剔除非单倍体植株，人工授粉，得到单倍体玉米植株。
实施例3 一种提高双单倍体成活率的方法，包括以下步骤： 步骤一、玉米单倍体种子的筛选：
挑选紫色粒顶无色胚的种子，得到单倍体种子；
步骤二发芽纸的准备：将所购滤纸折成大小合适的扇形，大小要一致；
步骤三、消毒剂的配制：配制的消毒剂的质量浓度约为0.3%的二氧化氯，根据以上浓度计算好药剂和蒸馏水的用量，先把二氧化氯加入烧杯中，加入蒸馏水待二氧化氯完全溶解后，摇匀后保存于塑料容器中；
步骤四、叠好的扇形滤纸放入配好的溶液中，适量水分后取出放到托盘上，单倍体种子冲洗干净，种子之间间隔1cm--1.5cm，均匀摆放到适量水分的扇形滤纸底部，用锡箔纸密封，放培养箱，25-26度，培养4天；
步骤五、玉米单倍体种子的处理：
（1）切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端
（2）用秋水仙素混合液处理幼芽
将上述切去胚芽尖的单倍体幼芽放入容器内．将配置好的秋水仙素混合液倒入容器中，使所有切好的芽全部浸入，同时密封容器口，在23℃避光条件下处理12小时，得到染色体加倍的玉米幼芽；
（3）用清水冲洗浸泡后的单倍体种子1-2小时，得预处理后的单倍体种子；
步骤六、将上述获得的预处理后的单倍体种子播种于营养土中、浇水，遮阳培养至三叶一心；
步骤七、染色体加倍的玉米幼苗移栽及管理：
待步骤六培育的柒色体加倍的王来幼苗移栽到河北冀农种业有限责任公司试验站，同时用遮阳网遮阳5天，田间进行精细管理，确保幼苗正常生长，于幼苗期剔除非单倍体植株，人工授粉，得到单倍体玉米植株。
实施例4 一种提高双单倍体成活率的方法，包括以下步骤： 步骤一、玉米单倍体种子的筛选：
挑选紫色粒顶无色胚的种子，得到单倍体种子；
步骤二发芽纸的准备：将所购滤纸折成大小合适的扇形，大小要一致；
步骤三、消毒剂的配制：配制的消毒剂的质量浓度约为0.2%的二氧化氯，根据以上浓度计算好药剂和蒸馏水的用量，先把二氧化氯加入烧杯中，加入蒸馏水待二氧化氯完全溶解后，摇匀后保存于塑料容器中；
步骤四、叠好的扇形滤纸放入配好的溶液中，适量水分后取出放到托盘上，单倍体种子冲洗干净，种子之间间隔1cm--1.5cm，均匀摆放到适量水分的扇形滤纸底部，用锡箔纸密封，放培养箱，25-26度，培养4天；
步骤五、玉米单倍体种子的处理：
（1）切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端
（2）用秋水仙素混合液处理幼芽
将上述切去胚芽尖的单倍体幼芽放入容器内．将配置好的秋水仙素混合液倒入容器中，使所有切好的芽全部浸入，同时密封容器口，在23℃避光条件下处理12小时，得到染色体加倍的玉米幼芽；
（3）用清水冲洗浸泡后的单倍体种子1-2小时，得预处理后的单倍体种子；
步骤六、将上述获得的预处理后的单倍体种子播种于营养土中、浇水，遮阳培养至三叶一心；
步骤七、染色体加倍的玉米幼苗移栽及管理：
待步骤六培育的柒色体加倍的王来幼苗移栽到河北冀农种业有限责任公司试验站，同时用遮阳网遮阳5天，田间进行精细管理，确保幼苗正常生长，于幼苗期剔除非单倍体植株，人工授粉，得到单倍体玉米植株。
实施例5 一种提高双单倍体成活率的方法，包括以下步骤： 步骤一、玉米单倍体种子的筛选：
挑选紫色粒顶无色胚的种子，得到单倍体种子；
步骤二发芽纸的准备：将所购滤纸折成大小合适的扇形，大小要一致；
步骤三、消毒剂的配制：配制的消毒剂的质量浓度约为0.1%的二氧化氯，根据以上浓度计算好药剂和蒸馏水的用量，先把二氧化氯加入烧杯中，加入蒸馏水待二氧化氯完全溶解后，摇匀后保存于塑料容器中；
步骤四、叠好的扇形滤纸放入配好的溶液中，适量水分后取出放到托盘上，单倍体种子冲洗干净，种子之间间隔1cm--1.5cm，均匀摆放到适量水分的扇形滤纸底部，用锡箔纸密封，放培养箱，25-26度，培养4天；
步骤五、玉米单倍体种子的处理：
（1）切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端
（2）用秋水仙素混合液处理幼芽
将上述切去胚芽尖的单倍体幼芽放入容器内．将配置好的秋水仙素混合液倒入容器中，使所有切好的芽全部浸入，同时密封容器口，在23℃避光条件下处理12小时，得到染色体加倍的玉米幼芽；
（3）用清水冲洗浸泡后的单倍体种子1-2小时，得预处理后的单倍体种子；
步骤六、将上述获得的预处理后的单倍体种子播种于营养土中、浇水，遮阳培养至三叶一心；
步骤七、染色体加倍的玉米幼苗移栽及管理：
待步骤六培育的柒色体加倍的王来幼苗移栽到河北冀农种业有限责任公司试验站，同时用遮阳网遮阳5天，田间进行精细管理，确保幼苗正常生长，于幼苗期剔除非单倍体植株，人工授粉，得到单倍体玉米植株。
对照组：除步骤三中用蒸馏水代替消毒剂外，其余步骤与实施例完全相同。
不同浓度消毒剂溶液和水处理后单倍体种子萌发幼芽成活率结果如下：
表1为不同浓度消毒剂溶液处理后单倍体种子萌发幼芽成活率
实验组
单倍体种子总数
消毒剂溶液浓度%
幼芽成活率%
实施例1
600
0.5
93
实施例2
600
0.4
92
实施例3
600
0.3
80
实施例4
600
0.2
70
实施例5
600
0.1
65
对照组
600
水
58
由表1可知，消毒剂溶液对玉米单倍体种子萌发过程有抑制真菌生长的作用，从而提高幼芽成活率，从而提高双单倍体成活率。消毒剂溶液的不同浓度对抑制真菌生长的作用不一样，浓度为0.5%或0.4%时效果最好。本发明所提供的玉米双单倍体幼芽成活率方法能显著地提高玉米单倍体的加倍过程中双单倍体幼芽的成活率，有利于双单倍体植株的选育，解决了单倍体育种过程中单倍体萌发过程中长菌影响单倍体幼芽成活率的技术难题，从而大大提高了双单倍体成活率，使大规模应用单倍体加倍技术更有可能。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
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