一种基于萱草花粉管通道导入ems诱变育种的方法
阅读说明：本技术 一种基于萱草花粉管通道导入ems诱变育种的方法 (Method for introducing EMS mutation breeding based on day lily pollen tube channel ) 是由 谭雨馨 倪迪安 张铮 董书琦 于 2021-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于萱草花粉管通道导入EMS诱变育种的方法,包括如下步骤：(1)于田间选取萱草花朵自交进行授粉；(2)将授粉的花剥离雄蕊和花瓣,截取并保留2mm长的花柱,用微量注射器吸取10μl诱变剂,沿花柱柱头纵轴注射,然后用湿棉花包住子房；诱变剂为浓度0.00001-0.00005％的EMS溶液,以磷酸缓冲液作为溶剂；(3)35d后收获种子,将种子在水中浸泡12h后剥去外种皮,在育苗盒中于植物培养间25℃条件下培养,本发明通过花粉管通道注射诱变剂的方法,授粉后使EMS溶液能够沿着花粉管通道形成的途径渗透,经过珠心进入胚囊,最终诱变尚不具备正常细胞壁的合子或早期胚胎细胞,相比于传统的诱变育种方法,该方法操作简单,容易掌握,省时省力。(The invention discloses a method for introducing EMS mutation breeding based on a hemerocallis fulva pollen tube channel, which comprises the following steps: (1) selecting flowers of hemerocallis fulva in the field for selfing and pollinating; (2) stripping stamens and petals of pollinated flowers, cutting and reserving a style with the length of 2mm, sucking 10 mu l of mutagen by using a micro-injector, injecting along the longitudinal axis of the style stigma, and then wrapping ovaries by using wet cotton; the mutagen is EMS solution with concentration of 0.00001-0.00005%, and phosphate buffer is used as solvent; (3) and harvesting seeds after 35d, soaking the seeds in water for 12h, peeling off the episperms, and culturing in a seedling box at the temperature of 25 ℃ in a plant culture room.)
技术领域
本发明涉及植物育种技术领域，尤其涉及一种基于萱草花粉管通道导入EMS诱变育种的方法。
背景技术
萱草为百合科萱草属多年生宿根草本植物，原产于中国南部、欧洲南部和日本，现中国南北方广为栽培。现萱草品种已达万种以上，成为重要的观赏及切花花卉，也是百合科花卉中品种最多的一类。萱草花又被称为“母亲花”、“忘忧草”，在我国的种质资源丰富，栽培历史悠久。萱草自古以来都是雅俗共赏的花卉，历代文人常以其为吟咏的题材。但是，目前萱草在诱变育种方面仍存在诸多缺陷，例如：操作繁琐，费时费力等。因此，急需开发一种基于萱草花粉管通道导入EMS诱变育种的方法以解决上述技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于萱草花粉管通道导入EMS诱变育种的方法，通过花粉管通道注射诱变剂的方法，授粉后使EMS溶液能够沿着花粉管通道形成的途径渗透，经过珠心进入胚囊，最终诱变尚不具备正常细胞壁的合子或早期胚胎细胞。相比于传统的诱变育种方法，该方法操作简单，容易掌握，省时省力，对萱草加倍育种的研究具有重要意义，应用前景广阔，有利于推广应用。
为了实现上述目的，本发明提供的一种基于萱草花粉管通道导入EMS诱变育种的方法，包括如下步骤：
(1)于田间选取萱草花朵自交进行授粉；
(2)将授粉的花剥离雄蕊和花瓣，用刀片截取并保留2mm长的花柱，用微量注射器吸取10μl诱变剂，沿花柱柱头纵轴注射，然后用蒸馏水浸泡的湿棉花包住子房；所述诱变剂为浓度0.00001-0.00005％的EMS溶液，以磷酸缓冲液作为溶剂；
(3)35d后收获种子，将种子在水中浸泡12h后剥去外种皮，在育苗盒中于植物培养间25℃条件下培养。
优选地，所述步骤(1)中，自花授粉的时间为早晨7-8时。
优选地，所述步骤(2)中，注射诱变剂的时间在步骤(1)自花授粉24h之后。
优选地，所述步骤(2)中，注射诱变剂的方法为：第一次于子房2/3处注射5μl诱变剂，将微量注射器轻轻拔出至子房1/3处，再注射另外5μl诱变剂。
优选地，所述步骤(2)中，EMS溶液的浓度为0.00001％、0.00002％或0.00005％。
优选地，所述步骤(2)中，磷酸缓冲液的浓度为0.1％mol/L，PH为7，高压灭菌后使用。
优选地，所述步骤(2)中，磷酸缓冲液的配置方法为：取3.852g十二水磷酸氢二钠溶解并定容至100mL，取1.561g磷酸二氢钠二水化合物溶解并定容至100mL，然后从100mL十二水磷酸氢二钠溶液中取61mL作为溶液1，从100mL磷酸二氢钠二水化合物中取39mL作为溶液1，将溶液1和溶液2混合，则配置成100mL磷酸缓冲液。
本发明提供的一种基于萱草花粉管通道导入EMS诱变育种的方法，具有如下有益效果。
本发明通过花粉管通道注射诱变剂的方法，授粉后使EMS溶液能够沿着花粉管通道形成的途径渗透，经过珠心进入胚囊，最终诱变尚不具备正常细胞壁的合子或早期胚胎细胞。相比于传统的诱变育种方法，该方法操作简单，容易掌握，省时省力，对萱草加倍育种的研究具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，以助于理解本发明的内容。
本发明提供的一种基于萱草花粉管通道导入EMS诱变育种的方法，包括如下步骤：
(1)于田间选取萱草花朵自交进行授粉，自花授粉的时间为早晨7-8时；
(2)将授粉的花剥离雄蕊和花瓣，用刀片截取并保留2mm长的花柱，用微量注射器吸取10μl诱变剂，沿花柱柱头纵轴注射，然后用蒸馏水浸泡的湿棉花包住子房；
注射诱变剂的方法为：第一次于子房2/3处注射5μl诱变剂，将微量注射器轻轻拔出至子房1/3处，再注射另外5μl诱变剂。注射诱变剂的时间在步骤(1)自花授粉24h之后。
所述诱变剂为浓度0.00001-0.00005的EMS溶液，以磷酸缓冲液作为溶剂。优选地，所述EMS溶液的浓度为0.00001％、0.00002％或0.00005％。
所述磷酸缓冲液的浓度为0.1％mol/L，配置方法为：取3.852g十二水磷酸氢二钠溶解并定容至100mL，取1.561g磷酸二氢钠二水化合物溶解并定容至100mL，然后从100mL十二水磷酸氢二钠溶液中取61mL作为溶液1，从100mL磷酸二氢钠二水化合物中取39mL作为溶液1，将溶液1和溶液2混合，则配置成100mL磷酸缓冲液。PH为7，高压灭菌后使用。
(3)35d后收获种子，将种子在水中浸泡12h后剥去外种皮，在育苗盒中于植物培养间25℃条件下培养。
实施例1
一种基于萱草花粉管通道导入EMS诱变育种的方法，包括如下步骤：
(1)早晨7-8时于田间选取50朵萱草“斯特拉”品种的花朵自交进行授粉；
(2)自花授粉24h之后，将授粉的花剥离雄蕊和花瓣，用刀片截取并保留2mm长的花柱，用微量注射器吸取10μl诱变剂，沿花柱柱头纵轴注射，然后用蒸馏水浸泡的湿棉花包住子房；
注射诱变剂的方法为：第一次于子房2/3处注射5μl诱变剂，将微量注射器轻轻拔出至子房1/3处，再注射另外5μl诱变剂。
所述诱变剂为0.00001％浓度的EMS溶液，以磷酸缓冲液作为溶剂。所述磷酸缓冲液的浓度为0.1％mol/L，配置方法为：取3.852g十二水磷酸氢二钠溶解并定容至100mL，取1.561g磷酸二氢钠二水化合物溶解并定容至100mL，然后从100mL十二水磷酸氢二钠溶液中取61mL作为溶液1，从100mL磷酸二氢钠二水化合物中取39mL作为溶液2，将溶液1和溶液2混合，则配置成100mL磷酸缓冲液，PH为7，高压灭菌后使用。
(3)35d后收获种子，记录收获种子数，结实率和发芽率。将种子在水中浸泡12h后剥去外种皮，在育苗盒中于植物培养间25℃条件下培养。
实施例2
一种基于萱草花粉管通道导入EMS诱变育种的方法，包括如下步骤：
(1)早晨7-8时于田间选取50朵萱草“斯特拉”品种的花朵自交进行授粉；
(2)自花授粉24h之后，将授粉的花剥离雄蕊和花瓣，用刀片截取并保留2mm长的花柱，用微量注射器吸取10μl诱变剂，沿花柱柱头纵轴注射，然后用蒸馏水浸泡的湿棉花包住子房；
注射诱变剂的方法为：第一次于子房2/3处注射5μl诱变剂，将微量注射器轻轻拔出至子房1/3处，再注射另外5μl诱变剂。
所述诱变剂为0.00002％浓度的EMS溶液，以磷酸缓冲液作为溶剂。所述磷酸缓冲液的浓度为0.1％mol/L，配置方法为：取3.852g十二水磷酸氢二钠溶解并定容至100mL，取1.561g磷酸二氢钠二水化合物溶解并定容至100mL，然后从100mL十二水磷酸氢二钠溶液中取61mL作为溶液1，从100mL磷酸二氢钠二水化合物中取39mL作为溶液2，将溶液1和溶液2混合，则配置成100mL磷酸缓冲液，PH为7，高压灭菌后使用。
(3)35d后收获种子，记录收获种子数，结实率和发芽率。将种子在水中浸泡12h后剥去外种皮，在育苗盒中于植物培养间25℃条件下培养。
实施例3
一种基于萱草花粉管通道导入EMS诱变育种的方法，包括如下步骤：
(1)早晨7-8时于田间选取50朵萱草“斯特拉”品种的花朵自交进行授粉；
(2)自花授粉24h之后，将授粉的花剥离雄蕊和花瓣，用刀片截取并保留2mm长的花柱，用微量注射器吸取10μl诱变剂，沿花柱柱头纵轴注射，然后用蒸馏水浸泡的湿棉花包住子房；
注射诱变剂的方法为：第一次于子房2/3处注射5μl诱变剂，将微量注射器轻轻拔出至子房1/3处，再注射另外5μl诱变剂。
所述诱变剂为0.00005％浓度的EMS溶液，以磷酸缓冲液作为溶剂。所述磷酸缓冲液的浓度为0.1％mol/L，配置方法为：取3.852g十二水磷酸氢二钠溶解并定容至100mL，取1.561g磷酸二氢钠二水化合物溶解并定容至100mL，然后从100mL十二水磷酸氢二钠溶液中取61mL作为溶液1，从100mL磷酸二氢钠二水化合物中取39mL作为溶液2，将溶液1和溶液2混合，则配置成100mL磷酸缓冲液，PH为7，高压灭菌后使用。
(3)35d后收获种子，记录收获种子数，结实率和发芽率。将种子在水中浸泡12h后剥去外种皮，在育苗盒中于植物培养间25℃条件下培养。
对比例1
一种基于萱草花粉管通道导入EMS诱变育种的方法，包括如下步骤：
(1)早晨7-8时于田间选取50朵萱草“斯特拉”品种的花朵自交进行授粉；
(2)自花授粉24h之后，将授粉的花剥离雄蕊和花瓣，用刀片截取并保留2mm长的花柱，用微量注射器吸取10μl诱变剂，沿花柱柱头纵轴注射，然后用蒸馏水浸泡的湿棉花包住子房；
注射诱变剂的方法为：第一次于子房2/3处注射5μl诱变剂，将微量注射器轻轻拔出至子房1/3处，再注射另外5μl诱变剂。
所述诱变剂为0.0001％浓度的EMS溶液，以磷酸缓冲液作为溶剂。所述磷酸缓冲液的浓度为0.1％mol/L，配置方法为：取3.852g十二水磷酸氢二钠溶解并定容至100mL，取1.561g磷酸二氢钠二水化合物溶解并定容至100mL，然后从100mL十二水磷酸氢二钠溶液中取61mL作为溶液1，从100mL磷酸二氢钠二水化合物中取39mL作为溶液2，将溶液1和溶液2混合，则配置成100mL磷酸缓冲液，PH为7，高压灭菌后使用。
(3)35d后收获种子，记录收获种子数，结实率和发芽率。将种子在水中浸泡12h后剥去外种皮，在育苗盒中于植物培养间25℃条件下培养。
对比例2
一种基于萱草花粉管通道导入EMS诱变育种的方法，包括如下步骤：
(1)早晨7-8时于田间选取50朵萱草“斯特拉”品种的花朵自交进行授粉；
(2)自花授粉24h之后，将授粉的花剥离雄蕊和花瓣，用刀片截取并保留2mm长的花柱，用微量注射器吸取10μl诱变剂，沿花柱柱头纵轴注射，然后用蒸馏水浸泡的湿棉花包住子房；
注射诱变剂的方法为：第一次于子房2/3处注射5μl诱变剂，将微量注射器轻轻拔出至子房1/3处，再注射另外5μl诱变剂。
所述诱变剂为0.0002％浓度的EMS溶液，以磷酸缓冲液作为溶剂。所述磷酸缓冲液的浓度为0.1％mol/L，配置方法为：取3.852g十二水磷酸氢二钠溶解并定容至100mL，取1.561g磷酸二氢钠二水化合物溶解并定容至100mL，然后从100mL十二水磷酸氢二钠溶液中取61mL作为溶液1，从100mL磷酸二氢钠二水化合物中取39mL作为溶液2，将溶液1和溶液2混合，则配置成100mL磷酸缓冲液，PH为7，高压灭菌后使用。
(3)35d后收获种子，记录收获种子数，结实率和发芽率。将种子在水中浸泡12h后剥去外种皮，在育苗盒中于植物培养间25℃条件下培养。
对比例3
一种基于萱草花粉管通道导入EMS诱变育种的方法，包括如下步骤：
(1)早晨7-8时于田间选取50朵萱草“斯特拉”品种的花朵自交进行授粉；
(2)自花授粉24h之后，将授粉的花剥离雄蕊和花瓣，用刀片截取并保留2mm长的花柱，用微量注射器吸取10μl诱变剂，沿花柱柱头纵轴注射，然后用蒸馏水浸泡的湿棉花包住子房；
注射诱变剂的方法为：第一次于子房2/3处注射5μl诱变剂，将微量注射器轻轻拔出至子房1/3处，再注射另外5μl诱变剂。
所述诱变剂为0.0005％浓度的EMS溶液，以磷酸缓冲液作为溶剂。所述磷酸缓冲液的浓度为0.1％mol/L，配置方法为：取3.852g十二水磷酸氢二钠溶解并定容至100mL，取1.561g磷酸二氢钠二水化合物溶解并定容至100mL，然后从100mL十二水磷酸氢二钠溶液中取61mL作为溶液1，从100mL磷酸二氢钠二水化合物中取39mL作为溶液2，将溶液1和溶液2混合，则配置成100mL磷酸缓冲液，PH为7，高压灭菌后使用。
(3)35d后收获种子，记录收获种子数，结实率和发芽率。将种子在水中浸泡12h后剥去外种皮，在育苗盒中于植物培养间25℃条件下培养。
上述实施例1-3与对比例1-3的收获种子数、结实率和发芽率统计结果如表1所示。
表1不同浓度诱变剂对萱草收获种子数、结实率和发芽率的影响
由上述试验结果可知：随着EMS浓度的增加，萱草的收获种子数、结实率和发芽率逐渐降低，对比例1-3的萱草收获种子数、结实率和发芽率显著低于本发明实施例1-3，即本发明所选取的EMS浓度，使得萱草仍具有较高的结实率和发芽率。因此，可以证明本发明以花粉管通道导入EMS诱变育种的方法是完全可行的。
本发明通过花粉管通道注射诱变剂的方法，授粉后使EMS溶液能够沿着花粉管通道形成的途径渗透，经过珠心进入胚囊，最终诱变尚不具备正常细胞壁的合子或早期胚胎细胞。相比于传统的诱变育种方法，该方法操作简单，容易掌握，省时省力，对萱草加倍育种的研究具有重要意义。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
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