阅读说明：本技术 一种牛奶中革兰氏阴性致病菌的杀菌方法 (Method for sterilizing gram-negative pathogenic bacteria in milk ) 是由 肖性龙 曹怡芳 余以刚 于 2019-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及食品杀菌技术,具体公开了一种牛奶中革兰氏阴性致病菌的杀菌方法,包括以下步骤：在牛奶中加入香芹酚和柠檬醛,再对牛奶辅以加热处理,加热温度为40-55℃,直至致病菌被全部杀灭,停止加热,得到无菌牛奶。本发明将植物源化合物与温和加热处理联合,协同杀菌,能对牛奶中常见的革兰氏阴性致病菌达到理想的杀菌效果；且比巴氏杀菌处理温度低,杀菌时间短。同时还能够最大程度保持牛奶中原有的营养价值和风味。(The invention relates to a food sterilization technology, and particularly discloses a method for sterilizing gram-negative pathogenic bacteria in milk, which comprises the following steps: adding carvacrol and citral into milk, heating the milk at 40-55 deg.C until pathogenic bacteria are completely killed, and stopping heating to obtain sterile milk. According to the invention, the plant source compound is combined with mild heating treatment, and sterilization is performed cooperatively, so that an ideal sterilization effect on common gram-negative pathogenic bacteria in milk can be achieved; and has lower temperature and shorter sterilization time than pasteurization treatment. Meanwhile, the original nutritional value and flavor of the milk can be maintained to the maximum extent.)

一种牛奶中革兰氏阴性致病菌的杀菌方法

技术领域

本发明涉及食品中的杀菌技术，尤其涉及一种牛奶中革兰氏阴性致病菌的杀菌方法。

背景技术

牛奶是最古老的天然饮料之一，含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和矿物质。牛奶营养丰富、容易消化吸收、物美价廉、食用方便，是人类日常膳食的主要食品。但是，牛奶中也容易滋生各种微生物，特别是一些革兰氏阴性致病菌：大肠杆菌、沙门氏菌、阪崎克罗诺杆菌等。因此，对牛奶中致病菌进行控制十分重要。常用于牛奶的杀菌方法是传统的巴氏杀菌法，主要包括三种：低温长时间杀菌法(63℃，30min)、高温短时间杀菌法(72℃，15s)和超高温瞬时杀菌法(138℃，2-4s)。这些杀菌方法可以杀灭牛奶中大部分有害病原菌，但是会对牛奶中的营养物质、质地和风味造成不同程度的不良影响；且巴氏杀菌所需设备较昂贵，并需要进行及时的清洗和监控，耗费较大。近年来，非热杀菌技术已被用于牛奶中食源性致病菌的灭活，例如高压脉冲电场、超高压、超声波和SC-CO₂等，这些技术在最适条件下都能达到良好的抑菌效果，但超高压、高压脉冲电场处理后造成细胞的亚致死损伤，在牛奶的后续储藏过程中会引发潜在危害；超声波的灭菌效果受影响因素较多，是否能在乳制品工业上应用还需进一步的验证；SC-CO₂设备比较贵重，操作复杂，所以在乳制品工业中普及较难。

最近，植物源化合物用于抑菌已成为趋势，植物源化合物被认为是无毒、无害的，许多植物源化合物已被批准用作食品添加剂。但植物源化合物单独作用时往往需要在较高的抑菌浓度时才能达到理想的抑菌效果，因此也会对食物风味造成不良影响。

发明内容

本发明目的是提供一种牛奶中革兰氏阴性致病菌的杀菌方法。本发明所述方法应用具有协同杀菌效果的植物源化合物，再辅以中低温加热处理一段时间，在杀灭牛奶中全部细菌的同时，还能保持牛奶原有的营养品质和风味。本发明能够更为有效的替代或部分替代巴氏杀菌。

本发明目的通过以下步骤实现：

一种牛奶中革兰氏阴性致病菌的杀菌方法，包括以下步骤：

在牛奶中加入香芹酚和柠檬醛，再对牛奶辅以加热处理，加热温度为40-55℃，直至致病菌被全部杀灭，停止加热，得到无菌牛奶；当加热温度40≤T＜45℃时，牛奶中香芹酚的浓度≥200μg/mL，柠檬醛的浓度≥1600μg/mL；当加热温度45≤T＜50℃时，牛奶中香芹酚的浓度≥100μg/mL，柠檬醛的浓度≥800μg/mL；当加热温度50≤T≤55℃时，牛奶中香芹酚的浓度≥50μg/mL，柠檬醛的浓度≥400μg/mL。

优选地，当加热温度45≤T＜50℃时，牛奶中香芹酚的浓度≥200μg/mL，柠檬醛的浓度≥1600μg/mL；当加热温度50≤T≤55℃时，牛奶中香芹酚的浓度≥100μg/mL，柠檬醛的浓度≥800μg/mL。

优选地，所述加热时间为5-90min。

优选地，所述加热时间为10-30min。

优选地，所述加热温度50≤T≤55℃，加热时间为15±5min。

本发明所述浓度是指植物源化合物加入到牛奶体系后的最终浓度。

与现有巴氏杀菌技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

(1)本发明将植物源化合物与温和加热处理联合，能达到协同杀菌的效果；且比巴氏杀菌处理温度低，杀菌时间短。

(2)使用简便、成本低、费效比高。

(3)所使用植物源化合物天然、无毒、可食用、可用作食品添加剂。

(4)在达到理想的杀菌效果的同时，能够最大程度保持牛奶原有的营养、质地以及风味。

附图说明

图1是实施例3中不同浓度的香芹酚和柠檬醛在不同加热温度下对牛奶中大肠杆菌的抑菌作用，A、B、C、D分别代表加热温度为40、45、50和55℃。

图2是实施例4中不同浓度的香芹酚和柠檬醛在不同加热温度下对牛奶中沙门氏菌的抑菌作用，A、B、C、D分别代表加热温度为40、45、50和55℃。

图3是实施例5中不同浓度的香芹酚和柠檬醛在不同加热温度下对牛奶中阪崎克罗诺杆菌的抑菌作用，A、B、C、D分别代表加热温度为40、45、50和55℃。

图4是本发明实施例6中最优杀菌条件对牛奶中不同革兰氏阴性致病菌混合菌液的灭活效果。

具体实施方式

为进一步描述本发明，下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。本发明中所使用的试剂和方法，如无特殊规定，均为本领域内常用试剂和常规方法。

实施例1

筛选本发明中具有良好抑菌效果的植物源化合物：

选取十种植物源化合物：香芹酚、百里酚、丁香酚、柠檬醛、原儿茶醛、辛酸、没食子酸、阿魏酸、白藜芦醇和大蒜素。测定不同植物源化合物对常见革兰氏阴性杆菌：大肠杆菌、沙门氏菌和阪崎克罗诺杆菌的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)。使用50％的乙醇水溶液制备十种植物源化合物的母液。在96孔板每孔中加入100μL无菌TSB培养基，再向孔中加入100μL香芹酚母液进行等倍稀释，混合均匀后每孔中加入100μL浓度为10⁶CFU/mL的菌悬液并反复吹打，使得香芹酚的最终浓度依次为6.4、4.8、3.2、2.4、1.6、1.2、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05mg/mL。随后将样品放置在37℃培养箱中培养24h。同理，依照上述步骤测定其余九种化合物对不同细菌的最低抑菌浓度，测定结果详见表1。实验以含有0.1mg/mL氨苄西林的培养基作为阳性对照，不含有植物源化合物化合物的TSB为阴性对照。MIC定义为在肉眼观察下，植物源化合物分别抑制大肠杆菌、沙门氏菌和阪崎克罗诺杆菌生长的最低浓度。

实施例2

筛选本发明中具有协同效应的植物源化合物组合：

根据实施例1的结果，选取4种抑菌效果较好的植物源化合物：香芹酚、柠檬醛、百里酚和辛酸，以测定不同化合物联合使用时的分级抑菌浓度系数。使用50％的乙醇水溶液制备香芹酚、柠檬醛、辛酸和百里酚的浓度为102.4mg/mL的母液。并用TSB培养基稀释，分别得到各个化合物浓度为4×MIC、2×MIC、1×MIC、1/2、1/4、1/8MIC的溶液。制备不同菌浓度为10⁶CFU/mL的菌悬液，在96孔板每孔中加入100μL上述菌液。50μL不同浓度的香芹酚和柠檬醛分别加入到96孔板的横列和纵列孔中以分别得到最终浓度(2×MIC、1×MIC、1/2、1/4、1/8和1/16MIC)，加入后反复吹打，混合均匀后，放置于37℃培养24h。标记抑制阪崎克罗诺杆菌生长的样品，并计算每个样品中不同化合物对应的FIC值。每个样品做三个平行。其他五种组合：香芹酚和辛酸、香芹酚和百里酚、柠檬醛和辛酸、柠檬醛和百里酚、辛酸和百里酚FIC值测定按照香芹酚和柠檬醛的方法进行操作。

FICI(Fractional Inhibitory Concentration Index，FICI)是指每种抑菌化合物(A或B)分级抑菌浓度的综合，计算见下式：

FICI判读标准：当FICI≤0.5时，两种抑菌化合物为协同作用；当0.5＜FICI≤1时，两种抑菌化合物为相加作用；当1＜FICI≤4时，两种抑菌化合物为无关作用；当FICI＞4时，两种抑菌化合物为拮抗作用。

实施例3

两种植物源化合物联合温度对牛奶中大肠杆菌的灭活效果

根据实施例2的结果，选取具有协同效果的组合香芹酚和柠檬醛用于后续实施例。在已灭菌的试管中加入市售牛奶10mL，65℃水浴加热30min进行巴氏杀菌，凉至室温后，加入100μL制备好的浓度为10⁸CFU/mL的大肠杆菌菌悬液，在试管中加入适当量的香芹酚和柠檬醛，使其浓度分别为(0+0、1/3MIC+1/3MIC、1/2MIC+1/2MIC、2/3MIC+2/3MIC、MIC+MIC、2MIC+2MIC)，样品对照组不添加植物源化合物。将接种后的样品置于4个不同的温度(40、45、50、55℃)保温杀菌。将40℃和45℃的样品分别保温杀菌0、20、40、60、80、100、120min，50℃和55℃的样品分别保温杀菌0、5、10、20、40、60、90min后，将样品直接或用PBS 10倍稀释后，涂布到TSA培养基上37℃恒温培养24h，记录细菌总数，实验每组设置3个平行。

图1表明，与香芹酚和柠檬醛组合或温度单独作用相比，香芹酚和柠檬醛结合温度处理能够更明显的抑制大肠杆菌的生长，且温度越高，抑杀效果越明显。香芹酚和柠檬醛1/3MIC、1/2MIC、2/3MIC、MIC、2MIC组合可分别在55℃、55℃、55℃、50℃、50℃作用90、60、40、20、10min后完全杀灭牛奶中的大肠杆菌。

实施例4

两种植物源化合物联合温度对牛奶中沙门氏菌的灭活效果

在已灭菌的试管中加入市售牛奶10mL，65℃水浴加热30min进行巴氏杀菌，凉至室温后，加入100μL制备好的浓度为10⁸CFU/mL的沙门氏菌菌悬液，在试管中加入适当量的香芹酚和柠檬醛，使其浓度分别为(0+0、1/3MIC+1/3MIC、1/2MIC+1/2MIC、2/3MIC+2/3MIC、MIC+MIC、2MIC+2MIC)，样品对照组不添加植物源化合物。将接种后的样品置于4个不同的温度(40、45、50、55℃)保温杀菌。将40℃和45℃的样品分别保温杀菌0、20、40、60、80、100、120min，50℃和55℃的样品分别保温杀菌0、5、10、20、40、60、90min后，将样品直接或用PBS10倍稀释后，涂布到TSA培养基上37℃恒温培养24h，记录细菌总数，实验每组设置3个平行。

图2表明，与香芹酚和柠檬醛组合或温度单独作用相比，香芹酚和柠檬醛结合温度处理能够更明显的抑制沙门氏菌的生长，且温度越高，抑杀效果越明显。香芹酚和柠檬醛1/3MIC、1/2MIC、2/3MIC、MIC、2MIC组合可分别在55℃、55℃、55℃、50℃、50℃作用90、60、40、20、10min后完全杀灭牛奶中的沙门氏菌。

实施例5

两种植物源化合物联合温度对牛奶中阪崎克罗诺杆菌的灭活效果

在已灭菌的试管中加入市售牛奶10mL，65℃水浴加热30min进行巴氏杀菌，凉至室温后，加入100μL制备好的浓度为10⁸CFU/mL的阪崎克罗诺杆菌菌悬液，在试管中加入适当量的香芹酚和柠檬醛，使其浓度分别为(0+0、1/3MIC+1/3MIC、1/2MIC+1/2MIC、2/3MIC+2/3MIC、MIC+MIC、2MIC+2MIC)，样品对照组不添加植物源化合物。将接种后的样品置于4个不同的温度(40、45、50、55℃)保温杀菌。将40℃和45℃的样品分别保温杀菌0、20、40、60、80、100、120min，50℃和55℃的样品分别保温杀菌0、5、10、20、40、60、90min后，将样品直接或用PBS 10倍稀释后，涂布到TSA培养基上37℃恒温培养24h，记录细菌总数，实验每组设置3个平行。

图3表明，与香芹酚和柠檬醛组合或温度单独作用相比，香芹酚和柠檬醛结合温度处理能够更明显的抑制阪崎克罗诺杆菌的生长，且温度越高，抑杀效果越明显。香芹酚和柠檬醛1/3MIC、1/2MIC、2/3MIC、MIC、2MIC组合可分别在55℃、55℃、55℃、50℃、50℃作用90、60、40、20、10min后完全杀灭牛奶中的阪崎克罗诺杆菌。

实施例6

根据实施例3、4、5的结果，选取最优条件，测定该条件下，牛奶中三种革兰氏阴性致病菌的存活情况。在已灭菌的试管中加入市售牛奶10mL，65℃水浴加热30min进行巴氏杀菌，凉至室温后，加入100μL制备好的浓度为10⁸CFU/mL的大肠杆菌、沙门氏菌和阪崎克罗诺杆菌的混合菌悬液，在试管中加入适当量的香芹酚和柠檬醛(浓度：MIC+MIC)，对照组不添加植物源化合物。将接种后的牛奶置于50℃下保温杀菌，分别保温0、5、10、15、10、25、30min后，将样品直接或用PBS 10倍稀释后，涂布到TSA培养基上37℃恒温培养24h，记录细菌总数，实验每组设置3个平行。

图4表明，选取的最优处理条件，香芹酚和柠檬醛MIC组合在50℃温热处理下，15min后即可完全杀灭牛奶中6Log CFU/mL的大肠杆菌、沙门氏菌和阪崎克罗诺杆菌的混菌液。

表1是十种植物源化合物对不同革兰氏阴性杆菌的最低抑菌浓度

表1表明，所选十种物质中，白藜芦醇、大蒜素的MIC均高于5mg/mL，抑菌效果最差；香芹酚和百里香酚抑菌效果最好，在醛类中，柠檬醛抑菌效果较好；在酸类中，辛酸抑菌效果较好。

表2表明，四种植物源化合物组成的六组组合中，只有香芹酚和柠檬醛组合对三种致病菌均显示协同效应。