阅读说明：本技术 含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系及应用 (Hematopoietic stem cell in-vitro culture system containing polymer micro-nano spheres and application ) 是由 钱鹏旭 王琪炜 韩颖丽 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系及应用。所述体系包含聚苯乙烯微纳小球(C<Sub>8</Sub>H<Sub>8</Sub>)n、组合物和StemSpan<Sup>TM</Sup>无血清培养基。所述聚合物微纳小球是粒径范围在25nm-10μm内的聚苯乙烯小球,该小球以一定剂量添加于小鼠造血干细胞培养体系中,能够实现在10天内对LSK(Lin<Sup>-</Sup>Sca1<Sup>+</Sup>c-Kit<Sup>+</Sup>)和SLAM HSC(Lin<Sup>-</Sup>Sca1<Sup>+</Sup>c-Kit<Sup>+</Sup>CD150<Sup>+</Sup>CD48<Sup>-</Sup>)的大量扩增,且无毒副作用。本发明聚合物微纳小球对造血干细胞体外培养、扩增及功能的促进作用,对于造血干细胞移植、体外扩增等临床及科研领域具有极大的应用潜力。(The invention provides an in vitro hematopoietic stem cell culture system containing polymer micro-nano spheres and application thereof. The system comprises polystyrene micro-nano spheres (C) 8 H 8 ) n, compositions and StemBan TM And (3) serum-free culture medium. The polymer micro-nano spheres are polystyrene spheres with the particle size range of 25nm-10 mu m, and the spheres are added into a mouse hematopoietic stem cell culture system in a certain dose, so that the LSK (Lin) can be treated within 10 days ‑ Sca1 + c‑Kit + ) And SLAM HSC (Lin) ‑ Sca1 + c‑Kit + CD150 + CD48 ‑ ) The amplification is carried out in a large amount, and no toxic or side effect exists. The polymer micro-nano spheres have the promotion effects on the in-vitro culture, the amplification and the functions of hematopoietic stem cells, and have great application potential in the clinical and scientific research fields of hematopoietic stem cell transplantation, in-vitro amplification and the like.)

含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系及应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系，以及聚合物微纳小球用于造血干细胞离体高效扩增的方法。

背景技术

干细胞(Stem Cell)是一类具有自我更新能力和多重分化潜能的细胞，这种特性使其成为再生医学和组织功能领域不可缺少的种子细胞来源。干细胞也是众多疾病中，例如血液疾病、神经系统损伤、肿瘤、心脏病等细胞治疗的最佳候选，因此对于干细胞的研究在临床领域意义重大。

造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell,HSC)主要存在于骨髓中，具有自我更新和产生所有造血系统成熟细胞谱系的能力。因此造血干细胞移植在许多恶性血液病治疗中具有广阔的应用前景，例如白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、骨髓异常增生综合征等。临床上获取造血干细胞的途径包括骨髓、脐带血和动员后的外周血，然而造血干细胞有限的来源限制了其在临床治疗上的广泛应用。例如，单份脐带血中CD34⁺造血祖细胞(HSPC)绝对数目不足，难以满足成年或体重较大的儿童患者移植所需的细胞量；骨髓采集由于创伤性大已基本淘汰，且骨髓及动员后外周血来源的造血干细胞必须寻找HLA匹配的供者，也给临床治疗增加了难度和负担。

若能增加移植物中造血干细胞的数量，促进移植后造血系统的重建，必然会增加造血干细胞移植的成功率和应用。因此，探索和发展造血干细胞的体外扩增新方法具有重大需求，而目前促进造血干细胞体外扩增的方法有待改进。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种含聚合物微纳小球的造血干细胞体外培养体系，所述造血干细胞体外培养体系，包含聚苯乙烯微纳小球(C₈H₈)n(聚合度n为500-2500)、组合物和StemSpan^TM无血清培养基，其中聚苯乙烯微纳小球是指已苯乙烯为单体合成的聚合物小球，其粒径范围在50nm至10μm之间，组合物由以下组分组成：干细胞生长因子(Stem Cell Factor,SCF)、血小板生成素(Thrombopoietin,TPO)、肝素，StemSpan^TM无血清培养基购自STEMCELL Technologies Inc，货号为#09650。所述聚苯乙烯微纳小球分散介质为超纯水，保存条件为室温干燥，粒径范围在50nm-10μm，Zeta电位范围在-0.064至-0.306mV。

组合物与StemSpan^TM无血清培养基分开于不同的容器中，放置于-80℃保存。聚苯乙烯微球被配制于IMDM培养基中，放置于4℃一周内使用。

所述组合物中各组分的添加浓度为：SCF(10ng/mL)、TPO(20ng/mL)、肝素(10μg/mL)。

所述聚苯乙烯微纳小球的添加浓度为0.5-20μg/mL。优选添加浓度为1μg/mL。

本发明的另一个目的是提供所述体外培养体系在小鼠造血干细胞离体高效扩增培养中应用。是一种用于小鼠骨髓造血干细胞高效扩增的体外培养方法，通过采用CCK-8法、流式细胞分析技术、克隆形成实验测试了添加不同浓度、粒径的聚苯乙烯微纳小球对造血干细胞数目与功能的促进作用。

本发明体外扩增培养具体通过以下方法实现：

(1)聚苯乙烯微纳小球对小鼠造血干细胞体外扩增的培养体系：分离小鼠骨髓原代细胞，在添加有组合物SCF(10ng/mL)、TPO(20ng/mL)、肝素(10μg/mL)的StemSpan^TM无血清培养基中培养，添加浓度为0.5-20μg/mL与粒径范围在50nm至10μm的聚苯乙烯微纳小球，继续培养7-14天后测试造血干细胞的扩增效果；

(2)应用CCK-8法测定不同浓度聚苯乙烯微纳小球对小鼠骨髓细胞的增殖促进作用：添加浓度为0.5-20μg/mL的聚苯乙烯微纳小球，继续培养后测试增殖效果，结果显示0.5-5μg/mL的聚苯乙烯微纳小球添加浓度能显著促进小鼠骨髓细胞的增殖；

(3)应用流式细胞分析技术检测不同粒径的聚苯乙烯微纳小球对小鼠骨髓细胞中造血干细胞的扩增作用：添加粒径范围在50nm至10μm的聚苯乙烯微纳小球，浓度为1μg/mL；继续培养后收集细胞，使用造血干细胞标志物流式抗体染色后，上机分析造血干细胞比例和数目的变化，结果显示50nm、100nm、500nm、2μm、5μm和10μm的聚苯乙烯微纳小球添加浓度能显著提升小鼠骨髓细胞中造血干细胞的比例与数目；

(4)应用克隆形成实验检测不同粒径的聚苯乙烯微纳小球对小鼠造血干细胞体外功能的作用：添加粒径为50nm、500nm和5μm的聚苯乙烯微纳小球，浓度为1μg/mL；继续培养后收集细胞，在半固体培养基中培养14天后，显微镜下观察造血干细胞克隆形成数目，结果显示50nm、500nm和5μm的聚苯乙烯微纳小球添加浓度能显著提升小鼠造血干细胞的体外功能；

本发明公开了一种聚合物微纳小球对造血干细胞体外培养、扩增及功能的促进作用。所述的聚合物微纳小球以一定剂量添加于小鼠造血干细胞培养体系中，能够实现在10天内对LSK(Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺)和SLAM HSC(Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺CD150⁺CD48^-)的大量扩增，且无毒副作用。本发明同时添加聚苯乙烯微纳小球与组合物(细胞因子)用于小鼠造血干细胞体外培养，对造血干细胞的扩增效果大于只添加细胞因子组合物。本发明对于造血干细胞移植、体外扩增等临床及科研领域具有极大的应用潜力。

附图说明

图1是采用扫描电镜(SEM)和动态光散射(DLS)表征，测定的部分聚苯乙烯微纳小球水合粒径、多分散系数、Zeta电位；

图2是采用细胞活力实验测定不同浓度聚苯乙烯微纳小球对小鼠骨髓细胞的增殖效果；聚苯乙烯微纳小球的使用浓度分别为0.5、1、2、5、10和20μg/mL，培养时间为别为A：3、B：7、C：14天。

图3是采用流式细胞分析技术测定不同尺寸聚苯乙烯微纳小球对小鼠骨髓细胞中造血干细胞的扩增效果，聚苯乙烯微纳小球的使用浓度为1μg/mL、培养时间为10天，从左到右依次为对照组、50nm、500nm和5μm的聚苯乙烯微球。

图4是采用流式细胞分析技术测定对照组、50nm、500nm和5μm的聚苯乙烯微球对小鼠骨髓细胞中LSK(Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺)和SLAM HSC(Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺CD150⁺CD48^-)占总细胞比例的统计结果。其中聚苯乙烯微纳小球的使用浓度为1μg/mL、培养时间为10天，每组三次重复。

图5是采用流式细胞分析技术测定对照组、50nm、500nm和5μm的聚苯乙烯微球对小鼠骨髓细胞中LSK(Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺)和SLAM HSC(Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺CD150⁺CD48^-)总数的计数统计结果。其中聚苯乙烯微纳小球的使用浓度为1μg/mL、培养时间为10天，每组三次重复。

图6采用克隆形成实验(Colony-Formation Unit)测定不同尺寸聚苯乙烯微纳小球对小鼠造血干细胞体外分化功能的作用，其中BFU-E、G、M、GM、GEMM分别代表造血干细胞分化后形成不同谱系血细胞的克隆。

具体实施方式

结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

本发明公开了一种聚合物微纳小球及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1

对聚苯乙烯微纳小球进行相关性质的检测：包括整体颗粒粒径(扫描电子显微镜)，水动力尺寸与Zeta电位(粒径电位分析仪)。结果见图1与表1。

表1 聚苯乙烯微纳小球表征结果

实施例2

SCF(购自上海普欣生物技术有限公司,货号122-01)、TPO(购自上海普欣生物技术有限公司,货号122-06)、肝素(购自Sigma，货号H3149)按照使用浓度的1000倍配置好，分装至离心管，每管40μL，-80℃保存待用。

StemSpan^TM无血清培养基(购自StemCell，货号09650)分装至离心管，每管40mL，-80℃保存待用。

培养基配制前将分装的StemSpan^TM无血清培养基置于4℃过夜融化，随后将组合物按照1/1000体积加入StemSpan^TM无血清培养基，混合均匀待用。

实施例3

取6-8周龄C57BL/6小鼠，二氧化碳窒息麻醉后断颈处死，全身浸泡75％酒精消毒5min。自小腿侧剪开腿部皮肤，分别在股骨和胯骨接缝处、脚踝处剪开，暴漏出腿骨的两端。在膝关节和股骨连接处将韧带剪开，分离出股骨和胫骨，剪干净骨上肌肉和***。将骨两端剪开，用吸有预冷缓冲液(PBS+2％胎牛血清)的3mL注射器将骨髓冲出，反复吹打为单细胞悬液，用300目细胞筛网过滤细胞于离心管中，4℃1500rpm离心5min。吸去上清，按每只腿(股骨+胫骨)1mL加入无菌裂红液(8.3g氯化铵，1g碳酸氢钠，200μL0.5M EDTA，1L超纯水，0.22μm滤膜过滤除菌)，室温裂解红细胞3min，加入2倍体积预冷缓冲液终止裂解。用300目细胞筛网过滤细胞于离心管中，4℃1500rpm离心5min。加入实施例1中配制好的培养体系1mL，重悬并吹打为单细胞悬液，计数后，用配制好的培养体系将细胞数量调整为1-2×10⁶/mL，种入U底96孔板(购自BD falcon，货号353077)，每孔100μL，37℃细胞培养箱内培养48h。

实施例4

待细胞聚集在96孔板形成肉眼可见小球时，加入不同粒径、不同浓度的聚苯乙烯微纳小球，共孵育不同时间后采用CCK-8法测定细胞活力，结果见图2。

实验分组：

粒径：50nm、100nm、500nm、2μm、5μm和10μm；

浓度：阴性对照(0)、0.5、1、2、5、10、20μg/mL；

共孵育时间：3、7、14d；

每组3个复孔，取平均值为最终结果。

将聚苯乙烯微纳小球按对应工作浓度的两倍与实施例1中配制好的培养体系混合均匀，每孔加入100μL混合液，将细胞团轻轻吹散，此时聚苯乙烯微纳小球即为工作浓度。

每3天半数换液，即每孔吸去100μL培养液，加入100μL含有聚苯乙烯微纳小球工作浓度的混合液，将细胞团轻轻吹散。

在对应的检测时间点，每孔加入20μL CCK-8试剂，将细胞团轻轻吹散，37℃细胞培养箱内孵育1-2h，用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度。

细胞活力计算方法：

细胞活力＝(OD₄₅₀实验组–OD₄₅₀空白)/(OD₄₅₀阴性对照–OD₄₅₀空白)×100％

补充说明：

空白对照(底色)为培养基加CCK8；如药物有颜色干扰，还需加入不同浓度的药物作为底色分别扣除。

实施例5

如实施例2所述方法准备小鼠骨髓原代细胞，初始造血干细胞数目为每孔50个，待细胞聚集在96孔板形成肉眼可见小球时，加入不同粒径的聚苯乙烯微纳小球，共孵育10d后采用流式细胞分析法测定LSK和SLAM HSC的比例和数目。结果见图3至图5。

实验分组：

粒径：50nm、100nm、500nm、2μm、5μm和10μm；

浓度：阴性对照(0)、1μg/mL；

每组需要6-12个孔，实验重复3次，取平均值为最终结果。

加入聚苯乙烯微纳小球和更换培养液的方法按实施例3所述，共孵育10d后收集各组细胞，计数后用100μL预冷的PBS+2％FBS重悬细胞，冰上放置备用。

每10⁶细胞将流式抗体按如下比例混合：

将抗体混合液按每10⁶细胞3.6μL加入细胞悬液，冰上避光孵育30-45min。

同型对照设置(Isotype Control，用于画门)

ISO1:ISO-PE-Cy5 1μL；

ISO2:Lin-PE-Cy5 1μL、ISO-PE-Cy7 0.5μL、ISO-APC 0.5μL；

ISO3:Lin-PE-Cy5 1μL、Sca1-PE-Cy7 0.5μL、c-Kit-APC 0.5μL、ISO-PE 0.5μL、ISO-eF4500.5μL。

单标管：每管约50000个细胞，分别加入0.2μL Lin-PE-Cy5、Sca1-PE-Cy7、c-Kit-APC、CD150-PE、CD48-eF450抗体，用于调整颜色补偿。

孵育结束后，4℃1500rpm离心5min去除未结合抗体，流式上机(Beckman,DxFLEX)检测LSK(Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺)和SLAM HSC(Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺CD150⁺CD48^-)比例和数量的差异。

流式检测步骤：不同厂家、型号的流式细胞分析仪具体软件使用方法有所不同，但大致检测步骤相似。以Beckman DxFLEX为例，先打开软件画散点图，上空白管(未结合抗体)调节各个检测通道的电压，依次上样单标管调整补偿、上样同型对照管画门，最后对每个实验组上样检测。

实施例6

如实施例2所述方法准备小鼠骨髓原代细胞，待细胞聚集在96孔板形成肉眼可见小球时，加入不同粒径的聚苯乙烯微纳小球，共孵育7d后采用CFU法测定造血干细胞体外分化功能。结果见图6。

收集细胞计数，每组30000细胞用实施例1中配制好的培养体系300μL重悬。用16G钝头针头套上5mL注射器，吸取细胞悬液，加入3mL的半固体培养基中(StemCell，MethoCult^TM GF M3434)中混匀。

向6孔板中每孔加入混有细胞的1mL半固体培养基，每孔约10000细胞，置于湿盒中，37℃细胞培养箱内培养。每2d显微镜下观察克隆形成，BFU-E形成(约第10-12d)2d后计数、统计并拍照保存。

不同克隆计数标准：

BFU-E(Burst-forming unit-erythroid)：细胞小、不规则，克隆无核心、颜色为黄或红色；

CFU-M(Colony-forming unit-macrophage)：细胞较大，为灰色椭圆形；

CFU-G(Colony-forming unit-granulocyte)：细胞圆形、透亮，比CFU-M小而均匀；

GM：克隆有核心，由G和M的细胞混合而成；

GEMM(granulocyte,erythroid,macrophage,megakaryocyte)：由粒、红、巨噬、巨核四种细胞组成，克隆较大，通常细胞数量大于500个，核心为黑色。