通过β-葡糖苷酶水解甜菊醇糖苷
阅读说明：本技术 通过β-葡糖苷酶水解甜菊醇糖苷 (Hydrolysis of steviol glycosides by β -glucosidase ) 是由 毛国红 J.E.维克 M.贝滕 余晓丹 于 2018-06-29 设计创作，主要内容包括：本披露提供了利用β-葡糖苷酶的水解活性从多种甜菊醇糖苷产生提高量的莱鲍迪苷M(Reb M)的方法。更特别地,本披露提供了从含有目的底物的破碎的重组细胞(例如,重组微生物细胞)产生所希望的甜菊醇糖苷的改善的方法。在该方法中,此类细胞(例如,微生物)已经被修饰以携带能够产生目的甜菊醇糖苷的基因,这些目的甜菊醇糖苷包括莱鲍迪苷A(Reb A)、莱鲍迪苷E(Reb E)、和/或甜菊苷。在该实施例中,该方法包括以下步骤：从破碎的细胞(例如,微生物细胞)获得材料,并且在废产物中存在的甜菊苷上进行酶促水解以增强Reb M的产生。另外提供了通过本文所述的方法产生的甜菊醇糖苷组合物。(The present disclosure provides methods of producing enhanced amounts of rebaudioside M (Reb M) from a variety of steviol glycosides using the hydrolytic activity of β -glucosidase more particularly, the present disclosure provides improved methods of producing desired steviol glycosides from disrupted recombinant cells (e.g., recombinant microbial cells) containing a substrate of interest in which such cells (e.g., microorganisms) have been modified to carry genes capable of producing the steviol glycosides of interest, including rebaudioside A (Reb A), rebaudioside E (Reb E), and/or stevioside.)
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2017年6月30日提交的美国临时申请号62/527,482的优先权，将其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明的领域涉及使理想的甜菊醇糖苷的产生更有效且成本更低的方法和工艺。更特别地，本披露涉及使用通过β-葡糖苷酶的水解以驱使通过生物转化产生目的甜菊醇糖苷。
背景技术
本披露集中于将经鉴定的底物转化为目的甜菊醇糖苷。特别地，本披露部分涉及通过使用β-葡糖苷酶(“B-glu1”)水解存在于破碎的重组细胞(例如重组微生物细胞)中的特定底物，更有效的产生莱鲍迪苷M(“Reb M”)。
甜菊醇糖苷是从甜叶菊(Stevia rebaudiana)叶中分离的天然产物，并且广泛用作食品、饲料和饮料中的高强度、低热量甜味剂。天然存在的甜菊醇糖苷具有相同的碱二萜骨架结构(甜菊醇)，但在甜菊醇骨架的C13和C19位置上碳水化合物残基修饰(例如葡萄糖、鼠李糖和木糖残基)的数量和结构不同。具有已知结构的甜菊醇糖苷包括甜菊苷,莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷M和杜克苷A。在商业利用方面，莱鲍迪苷M本身已经通常被认为是安全的(‘GRAS’状态)，但是极难从提取过程中获得并且需要显著的微生物修饰以通过单独地微生物生物转化产生。
基于干重，甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C和杜克苷A分别占野生型甜叶菊叶中的甜菊醇糖苷总重量的9.l％、3.8％、0.6％和0.30％，而其他甜菊醇葡糖苷(例如Reb M)以低得多的量存在。已知使用重组微生物细胞来产生目的甜菊醇糖苷，然而，考虑到特定酶的生物化学活性范围，可以想到从这种微生物菌株产生多种甜菊醇糖苷。在这些情况下，这些菌株的破碎的细胞可以含有大量的甜菊苷(CAS号57817-89-7)、莱鲍迪苷A(CAS号58543-16-1)或其他甜菊醇糖苷，其中Reb M是所希望的产品。这些化合物的量对于甜菊苷为从约10％-20％的范围并且对于莱鲍迪苷A为从约5％-10％的范围，其中在混合物中存在其他次要成分。
作为天然甜味剂，不同甜菊醇糖苷具有不同程度的甜味、“口感”和与所测试的每种莱鲍迪苷种类相关的特定后味。相对于食糖(即“蔗糖”)，甜菊醇糖苷的甜度显著更高。例如，甜菊苷比蔗糖甜100-150倍，但在味道测试中指出具有苦的后味，而莱鲍迪苷A和E比蔗糖甜250-450倍，并且后味比甜菊苷好得多，但是，仍有明显的后味。因此，任何甜叶菊提取物的味道特征深受提取物中甜菊醇糖苷的相对含量的影响，这反过来可能受到地下植物所经历的环境条件和所用提取方法的影响。植物产量、天气条件和提取条件的这些变化可导致甜味菊提取物中甜菊醇糖苷的组成不一致，使得不同批次的提取产物之间的味道特征变化很大。甜叶菊提取物的味道特征也可以受到提取工艺后残留在产物中的植物来源的或环境来源的污染物(如色素、脂类、蛋白类、酚类和糖类)影响。这些污染物典型地其自身具有异味，这对于使用甜叶菊提取物作为消费品中的甜味剂是不理想的。
此外，分离甜叶菊提取物中不丰富的甜菊醇糖苷的单独或特定组合的成本是花费和资源过高的。来自甜菊苷和Reb A的甜菊醇糖苷的非生物产生是困难的。甜菊苷的酸水解是麻烦的，因为在酸性条件下，产生的甜菊醇重排成异甜菊醇。鉴于一些特定甜菊醇糖苷的质量和可用性有限，商业供应可以通过生物转化更好地解决，其中天然酶或特定微生物可以被修饰以携带所需的酶并使用商业上重要的发酵过程来特异性地增加目的糖苷的产生。例如，先前已经报道了通过使用经修饰的微生物的发酵途径进行的甜菊苷到Reb E的生物转化(参见，Mao等人，美国专利申请公开号US 2016/0207954，Non-Caloric Sweetener[无热量的甜味剂])。可替代地，其他非生物合成手段可用于开发目的甜菊醇糖苷。
从生物学角度来看，所有甜菊醇糖苷都是通过甜菊醇的一系列糖基化反应形成的，这些反应典型地由UDP-糖基转移酶(UGT)酶催化，使用尿苷5’-二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)作为糖部分的供体。在植物中，UGT是将葡萄糖残基从UDP-葡萄糖转移到甜菊醇的差异性很大的一组酶。在这些反应中，甜菊苷通常是多种莱鲍迪苷化合物生物合成的中间体。例如，甜菊苷在甜菊苷的C-13-O-葡萄糖的C-3’的糖基化产生莱鲍迪苷A；而在甜菊苷的19-0-葡萄糖位置的C-2’处的糖基化产生莱鲍迪苷E。
根据当前披露，改善甜叶菊提取物的味道品质的实用方法是改善那些通常具有更理想的味道特征的莱鲍迪苷化合物的产率，并且通过更有效的合成途径和相关方法来实现这一目的。在测试的那些甜菊醇糖苷中，许多人认为Reb M具有用于在食品和饮料中使用的最理想的味道和化学特征。然而，如上所述，该植物在其叶中含有极少量的这种化合物，因此需要可替代的方法实现并辅助大规模产生该糖苷以及为食品和饮料行业提供替代的甜味剂。
因此，需要作为商业产品开发的具有更好和更一致的味道特征的甜菊醇糖苷以及对于这种甜菊醇糖苷需要利用相对常见的起始底物(例如更丰富的甜菊醇糖苷)作为起始分子，以便产生理想的糖苷可以在商业上尽可能具有成本效益。本披露提供了增强所希望的甜菊醇糖苷产生的方法。
还需要新的产生方法来降低甜菊醇糖苷产生的成本，并减少大规模培养和加工对环境的影响(Yao等人,1994)。一种这样的潜在解决方案是使用发酵生物转化技术，其允许在某些微生物物种或其他重组细胞中产生，这增加可用于商业的所希望的甜菊醇糖苷的选择性、丰度和纯度；以及使用水解酶增强所希望的莱鲍迪苷的存在，以驱动在来自经修饰的微生物培养物或其他经修饰的细胞培养物的细胞裂解物中的这种产生。
发明内容
本披露部分涵盖利用β-葡糖苷酶的水解活性从多种甜菊醇糖苷产生提高量的莱鲍迪苷M(Reb M)的方法。更特别地，本披露提供了从含有目的底物的破碎的重组细胞(例如，重组微生物细胞)产生所希望的甜菊醇糖苷的改善的方法。在该方法中，此类细胞(例如，微生物)已经被修饰以携带能够产生目的甜菊醇糖苷的基因，这些目的甜菊醇糖苷包括莱鲍迪苷A(Reb A)、莱鲍迪苷E(Reb E)、和/或甜菊苷。在该实施例中，该方法包括以下步骤：从破碎的细胞(例如，微生物细胞)获得材料，并且在废产物中存在的甜菊苷上进行酶促水解以增强Reb M的产生。
在产品/商业实用性方面，在美国市场上有几十种含有甜菊醇糖苷的产品，并且可以用于从镇痛药到驱虫剂以及在食品和膳食补充剂中的所有产品。含有目的甜菊醇糖苷的产品可以包括气溶胶、液体、或颗粒配制品。
至于当前披露中的细胞系统，其选自下组，该组由以下组成：细菌、酵母及其组合，或任何允许用所选基因进行遗传转化并随后从甜菊醇生物合成产生所希望的甜菊醇糖苷的细胞系统。在最优选的微生物系统中，大肠杆菌用于产生后来暴露于β-葡糖苷酶水解的所希望的甜菊醇糖苷化合物。
β-葡糖苷酶是通常存在于动物的下胃肠道中的组成酶，并且可用作食物材料的消化和吸收的辅助。根据当前披露，将B-glu1用于水解甜菊苷、莱鲍迪苷E(Reb E)、莱鲍迪苷A(Reb A)、莱鲍迪苷I(Reb I)、莱鲍迪苷D(Reb D)、莱鲍迪苷G(Reb G)和甜茶苷。通过甜菊醇二糖苷的初始形成进行水解，其中甜菊醇作为水解的终产物。
因此，本披露的方面提供了改变甜菊醇糖苷的糖基化的方法，这些方法包括a)提供重组细胞(例如，微生物、藻类或植物细胞)，将该重组细胞修饰以产生第一底物；b)使所述重组细胞破碎以释放其细胞胞质溶胶，其中这种胞质溶胶含有所述第一底物；c)从所述重组细胞获得胞质溶胶；d)将所述胞质溶胶暴露于β-葡糖苷酶，其中这种β-葡糖苷酶具有水解活性，该水解活性持续足够的时间以通过从所述第一底物去除至少一个葡糖基基团从而产生第二目的底物；和e)收集所述第二目的底物。
在一些实施例中，所述第一底物是甜菊醇糖苷。在一些实施例中，所述第二目的底物是Reb M。在一些实施例中，所述第二目的底物是Reb B。在一些实施例中，所述第二目的底物是Reb A。在一些实施例中，第一和第二底物是在本文的表1和图(例如图9)中所述的那些。
在一些实施例中，所述水解活性起作用以从所述甜菊醇糖苷的C19位置去除葡糖基基团。在一些实施例中，所述水解活性起作用以从所述甜菊醇糖苷的C13位置去除葡糖基基团。在一些实施例中，所述水解活性起作用以从所述甜菊醇糖苷的C19位置或所述甜菊醇糖苷的C13位置去除葡糖基基团。在一些实施例中，所述水解活性起作用以从所述甜菊醇糖苷的C19位置和所述底物的C13位置去除葡糖基基团。
在一些实施例中，所述水解活性起作用以从甜茶苷的C19位置去除葡糖基基团从而产生甜菊醇-13-葡糖苷。在一些实施例中，所述水解活性起作用以从甜菊苷的C19位置去除葡糖基基团从而产生甜菊醇二糖苷。在一些实施例中，所述水解活性起作用以从Reb E的C19位置去除葡糖基基团从而产生甜菊醇二糖苷。在一些实施例中，所述水解活性起作用以从Reb I的C19位置去除葡糖基基团从而产生Reb A。在一些实施例中，所述水解活性起作用以从Reb A的C19位置去除葡糖基基团从而产生Reb B。
在一些实施例中，所述水解活性起作用以从甜菊醇-13-葡糖苷的C13位置去除葡糖基基团从而产生甜菊醇。在一些实施例中，所述水解活性起作用以从Reb D的C13位置去除葡糖基基团从而产生Reb B或Reb A。在一些实施例中，所述水解活性起作用以从Reb G的C19位置和C13位置去除葡糖基基团从而产生甜菊醇-13-葡糖苷。
在一些方面，本文提供的方法进一步包括使用β-半乳糖苷酶或果胶酶来增加酶促水解速度。在一些实施例中，本文提供的方法进一步包括在转化的细胞系统中表达甜菊醇糖苷；在培养基中培养该细胞系统；以及，产生所述第二目的底物。
在一些实施例中，β-葡糖苷酶暴露于所述第一底物的所述时间段为至少6小时。
在一些实施例中，β-葡糖苷酶暴露于所述第一底物的所述时间段为至少12小时。在一些实施例中，β-葡糖苷酶暴露于所述第一底物的所述时间段为至少18小时。在一些实施例中，β-葡糖苷酶暴露于所述第一底物的所述时间段为至少24小时。在一些实施例中，所述第二目的底物是甜菊醇糖苷。
在一些实施例中，β-葡糖苷酶具有氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％(例如，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％)同一性。在一些实施例中，β-葡糖苷酶具有氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少95％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％)同一性。
在一些实施例中，重组细胞选自下组，该组由以下组成：细菌、酵母、丝状真菌、蓝细菌藻类和植物细胞。在一些实施例中，重组细胞(例如，微生物)选自下组，该组由以下组成：埃希氏杆菌属(Escherichia)；沙门氏菌属(Salmonella)；芽孢杆菌属(Bacillus)；不动杆菌属(Acinetobacter)；链霉菌属(Streptomyces)；棒状杆菌属(Corynebacterium)；甲基弯曲菌(Methylosinus)；甲基单胞菌(Methylomonas)；红球菌属(Rhodococcus)；假单胞菌属(Pseudomonas)；红杆菌属(Rhodobacter)；集胞藻属(Synechocystis)；酵母属(Saccharomyces)；接合酵母属(Zygosaccharomyces)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)；假丝酵母属(Candida)；汉逊酵母属(Hansenula)；德巴利氏酵母属(Debaryomyces)；毛霉菌属(Mucor)；毕赤酵母属(Pichia)；球拟酵母属(Torulopsis)；曲霉属(Aspergillus)；Arthrobotlys；短杆菌属(Brevibacteria)；微杆菌属(Microbacterium)；节细菌属(Arthrobacter)；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)；埃希氏杆菌属(Escherichia)；克雷白氏杆菌属(Klebsiella)；泛菌属(Pantoea)；沙门氏菌棒状杆菌(SalmonellaCorynebacterium)；梭菌属(Clostridium)；和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。
在一些实施例中，所述第二目的底物是甜菊醇糖苷。在一些实施例中，该第二目的底物是Reb E。在一些实施例中，所述第二底物是Reb E、Reb D4、和Reb M的混合物。在一些实施例中，该第二目的底物是Reb D4。在一些实施例中，所述第二目的底物是甜菊醇糖苷混合物，并且基于干重按重量计，该混合物的甜菊醇糖苷含量高于胞质溶胶来源的浓缩物的任何其他组分。
在一些实施例中，步骤e)中的第二目的底物是粗产物，并且步骤e)进一步包括i)纯化所述粗产物；和ii)在真空下去除溶剂以提供浓缩的产物。
在一些实施例中，通过柱色谱法纯化所述粗产物。在一些实施例中，通过酸碱提取纯化所述粗产物。在一些实施例中，通过真空蒸馏纯化所述粗产物。
在一些实施例中，本文提供的方法进一步包括使用半制备型HPLC纯化浓缩的产物。
虽然本披露易有多种修饰和可替代的形式，但是其具体的实施例通过附图中的实例的方式显示并将在本文中详细描述。然而，应该理解的是，本文给出的附图和
具体实施方式
并非旨在将本披露限制于所披露的特定实施例，相反，其旨在覆盖落入由所附权利要求书限定的本披露的精神和范围内的所有修饰、等同物和替代物。
参考附图，在下文对本发明优选的实施例的具体实施方式中，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
附图说明
图1显示甜茶苷被B-glu1酶和破碎的毕赤酵母细胞水解。A：甜茶苷水解产物的HPLC谱。a：甜菊醇(“S”)的标准品；b：甜茶苷(“Rub”)的标准品；c-d：在1小时(c)和3小时(d)，甜茶苷被重组B-glu1酶裂解；e-f：在1小时(e)和6小时(f)，甜茶苷被破碎的毕赤酵母细胞水解。B：通过B-glu1催化甜茶苷水解途径。甜茶苷被重组B-glu1酶和破碎的毕赤酵母细胞水解以产生甜菊醇-13-葡糖苷(“S-13-G”)和甜菊醇。
图2显示甜菊苷被B-glu1酶水解。A：甜菊苷水解产物的HPLC谱。a：甜菊苷(“ST”)的标准品；b：甜菊醇二糖苷(“SB”)的标准品；c-e：在1小时(c)、6小时(d)和24小时(e)，甜菊苷被重组B-glu1酶水解。B：通过B-glu1催化甜菊苷水解途径。甜菊苷被重组B-glu1酶和破碎的毕赤酵母细胞水解以产生甜菊醇二糖苷。
图3显示莱鲍迪苷E被B-glu1酶水解。A：莱鲍迪苷E水解产物的HPLC谱。a:甜菊醇二糖苷(“SB”)的标准品；b：莱鲍迪苷E(“E”)的标准品；c-e：在1小时(c)、6小时(d)、和24小时(e)，通过重组B-glu1酶水解莱鲍迪苷E。B：通过B-glu1催化的莱鲍迪苷E水解途径。莱鲍迪苷E被重组B-glu1酶和破碎的毕赤酵母细胞水解以产生甜菊醇二糖苷。
图4显示莱鲍迪苷A被B-glu1酶水解。A：莱鲍迪苷A水解产物的HPLC谱。a：莱鲍迪苷A(“Reb A”)的标准品；b：莱鲍迪苷B(“Reb B”)的标准品；c-d：在1小时(c)和6小时(d)，通过重组B-glu1酶水解莱鲍迪苷A。B：通过B-glu1催化莱鲍迪苷A水解途径。莱鲍迪苷A被重组B-glu1酶和破碎的毕赤酵母细胞水解以产生莱鲍迪苷B。
图5显示莱鲍迪苷I被B-glu1酶水解。A：莱鲍迪苷I水解产物的HPLC谱。a：莱鲍迪苷A(“Reb A”)的标准品；b：莱鲍迪苷B(“Reb B”)的标准品；c：莱鲍迪苷I(“Reb I”)的标准品。d-f：在1小时(d)、6小时(e)和24小时(f)，莱鲍迪苷I被重组B-glu1酶水解。B：通过B-glu1催化莱鲍迪苷I水解途径。莱鲍迪苷I被重组B-glu1酶水解以产生莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷B。
图6显示莱鲍迪苷D被B-glu1酶水解。A：莱鲍迪苷D水解产物的HPLC谱。a：莱鲍迪苷B(“Reb B”)的标准品；b：莱鲍迪苷D(“Reb D”)的标准品；c-e：在1小时(c)、6小时(d)和24小时(e)，莱鲍迪苷D被重组B-glu1酶水解。B：通过B-glu1催化莱鲍迪苷D水解途径。莱鲍迪苷D被重组B-glu1酶水解以产生莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷B。
图7显示莱鲍迪苷G被B-glu1酶和破碎的毕赤酵母细胞水解。A：莱鲍迪苷G水解产物的HPLC谱。a：甜菊醇(“甜菊醇(Steviol)”)，甜菊醇-13-葡糖苷(“S-13-G”)的标准品；b：莱鲍迪苷G(“G”)的标准品；b-d：在0.5小时(c)、1小时(d)和6小时(e)，莱鲍迪苷G被重组B-glu1酶水解；f：在24小时(f)，莱鲍迪苷G被破碎的毕赤酵母细胞水解。B：通过B-glu1催化莱鲍迪苷G水解途径。莱鲍迪苷G被重组B-glu1酶和破碎的毕赤酵母细胞水解以产生甜菊醇-13-葡糖苷(“S-13-G”)和甜菊醇。
图8显示甜菊醇糖苷被破碎的毕赤酵母细胞水解。a：甜菊醇二糖苷(“SB”)的标准品；b：莱鲍迪苷B(“B”)的标准品；c：在24小时，甜菊苷被破碎的毕赤酵母细胞水解；d：在24小时，莱鲍迪苷E(“E”)被破碎的毕赤酵母细胞水解；e：在24小时，莱鲍迪苷A(“A”)被破碎的毕赤酵母细胞水解；f：在24小时，莱鲍迪苷I(“I”)被破碎的毕赤酵母细胞水解；g：在24小时，莱鲍迪苷D(“D”)被破碎的毕赤酵母细胞水解。
图9显示B-Glu1可以水解不同的甜菊醇糖苷底物。黑线：糖基化；虚线：水解。
图10显示用于产生Reb M和Reb WB2的合成途径。
具体实施方式
本文使用的术语解释：
甜菊醇糖苷是一类化学化合物，甜菊醇糖苷是南美植物甜叶菊(菊科)叶有甜味的原因，并且可用作食品、饲料和饮料中的甜味剂。
定义：
细胞系统是提供异位蛋白质表达的任何细胞。它包括细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。它包括原核细胞和真核细胞。它还包括基于细胞组分例如核糖体的蛋白质的体外表达。
编码序列对本领域普通技术人员给出了它普通的和惯常的意思，并且非限制性地用于指编码特定氨基酸序列的DNA序列。
培养细胞系统。培养包括提供允许细胞繁殖和***的适当培养基。它还包括提供资源以使细胞或细胞组分可以翻译和制备重组蛋白。
蛋白质表达。蛋白质产生可以在基因表达后发生。它由DNA转录为信使RNA(mRNA)后的阶段组成。然后mRNA被翻译成多肽链，多肽链最终折叠成蛋白质。DNA通过转染存在于细胞中，转染是一种故意将核酸引入细胞的过程。该术语通常用于真核细胞中的非病毒方法。它也可以指其他方法和细胞类型，但其他术语是优选的：“转化”更常用于描述细菌、非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒DNA转移。在动物细胞中，转染是优选的术语，因为转化也用于指在这些细胞中发展成癌状态(致癌作用)。转导通常用于描述病毒介导的DNA转移。转化、转导和病毒感染包括在本申请的转染定义下。
酵母。根据当前披露，本文要求保护的酵母是真核的单细胞微生物，其被分类为真菌界的成员。酵母是从多细胞祖先进化而来的单细胞生物，但是一些物种可用于当前披露，这些物种是那些能够通过形成称为伪菌丝或假菌丝的连接芽殖细胞串来发展多细胞特征的物种。
在本披露中针对产生多种甜菊醇糖苷所用的UGT酶的名称与UGT命名委员会采用的命名系统一致(Mackenzie等人,“The UDP glycosyltransferase gene super family:recommended nomenclature updated based on evolutionary divergence[UDP糖基转移酶基因超家族：基于进化分歧更新的推荐命名法]”Pharmacogenetics[遗传药理学],1997,第7卷,第255-269页)，其通过家族数字、表示亚家族的字母和代表单独基因的数字的组合分类UGT基因。例如，名称“UGT76Gl”是指由属于UGT家族数字76(其是植物的起源)、亚家族G和基因数字l的基因编码的UGT酶。
结构术语：
如本文所用的，单数形式“一个/一种(a、an)”和“该(the)”包括复数指代，除非所述内容另外清楚地指示。
就在本说明书或权利要求中所用的术语“包括”、“具有”或等等来说，这种术语旨在以类似于术语“包含”的方式是包含性的，如“包含”在权利要求书中被用作过渡词时所解释的。
用语“示例性”在本文使用以意指“作为实例、情况或说明”。本文中被描述为“示例性”的任何实施例并不必须被解释为优选的或优越于其他实施例。
术语“互补”对本领域普通技术人员给出了它的普通的和惯常的意思，并且非限制性地用于描述能够互相杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA来说，腺苷互补于胸腺嘧啶，胞嘧啶互补于鸟嘌呤。相应地，本主题技术也包括互补于如在所附的序列表中报道的完整序列以及那些实质上相似的核酸序列的分离的核酸片段。
术语“核酸”和“核苷酸”对本领域普通技术人员给出了它们各自普通的和惯常的意思，并且非限制性地用于指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其单链或双链形式的聚合物。除非特别限定，该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，这些类似物具有与参考核酸相似的结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式被代谢。除非另外表明，特定的核酸序列也暗示涵盖其保守性修饰变体或简并变体(例如简并密码子置换)和互补序列，以及明确指示的序列。
术语“分离的”对本领域普通技术人员给出了它的普通的和惯常的意思，并且当被用在分离的核酸或分离的多肽的语境中时，其非限制性地用于指由人手脱离其原本环境而存在并因此不是天然产物的核酸或多肽。分离的核酸或多肽能以纯化的形式存在或可以存在于非原本环境，例如转基因宿主细胞中。
如本文所用的，术语“孵育”意指混合两种或更多种化学或生物实体(例如化学化合物和酶)并使它们在有利于产生甜菊醇糖苷组合物的条件下相互接触的方法。
术语“简并变体”是指具有因一个或多个简并密码子置换而不同于参考核酸序列的残基序列的核酸序列。简并密码子置换可以通过生成其中一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列实现。核酸序列和其所有的简并变体会表达相同的氨基酸或多肽。
术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”对本领域普通技术人员给出了它们各自的普通的和惯常的意思；这三个术语有时互换使用，并且非限制性地用于指氨基酸或氨基酸类似物的聚合物，无论其大小或功能。虽然“蛋白质”通常用于指相对大的多肽，而“多肽”通常用于指小的多肽，但本领域中这些术语的用法重叠并且是变化的。如本文所用的，术语“多肽”是指肽、多肽和蛋白质，除非另外注明。当指代多核苷酸产物时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。因此，示例性多肽包括多核苷酸产物、天然存在的蛋白质及其同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和其他等同物、变体以及前述物质的类似物。
当用于指参考多肽时，术语“多肽片段”和“片段”对本领域普通技术人员给出了它们普通的和惯常的意思，并且非限制性地用于指与参考多肽本身相比其中氨基酸残基缺失而剩余氨基酸序列通常与参考多肽上的相应位置相同的多肽。此类缺失可以发生在该参考多肽的氨基末端或羧基末端，或作为另外一种选择同时在这两处发生。
术语多肽或蛋白质的“功能片段”是指这样的肽片段，其是全长多肽或蛋白质的一部分，并且具有与全长多肽或蛋白质基本上相同的生物活性，或执行基本上相同的功能(例如，进行相同的酶促反应)。
可互换使用的术语“变体多肽”、“经修饰的氨基酸序列”或“经修饰的多肽”是指这样的氨基酸序列，其例如通过一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加而与参考多肽有一个或多个氨基酸不同。在一方面，变体是保持了参考多肽的部分或全部能力的“功能变体”。
术语“功能变体”进一步包括经保守置换的变体。术语“经保守置换的变体”是指这样的肽，其由于一个或多个保守氨基酸置换而具有不同于参考肽的氨基酸序列，并且保持了该参考肽的部分或全部活性。“保守氨基酸置换”是用功能上相似的残基置换氨基酸残基。保守置换的实例包括：非极性(疏水性)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸间的相互置换；带电荷或极性(亲水性)残基间的相互置换，如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间、苏氨酸与丝氨酸之间的相互置换；碱性残基如赖氨酸或精氨酸间的相互置换；或酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸间的相互置换；或芳香族残基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸间的相互置换。预计此类置换对蛋白质或多肽的表观分子量或等电点具有轻微影响或没有影响。短语“经保守置换的变体”还包括这样的肽，其中残基被化学来源的残基所替换，前提条件是所得到的肽保持如本文所述的参考肽的部分或全部活性。
术语“变体”，结合主题技术的多肽，进一步包括功能活性多肽，该功能活性多肽具有与参考多肽的氨基酸序列至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％相同的氨基酸序列。
术语“同源”以其所有语法形式和拼写变化是指具有“共同进化起源”的多核苷酸或多肽之间的关系，包括来自超家族的多核苷酸或多肽以及来自不同物种的同源多核苷酸或蛋白质(Reeck等人,Cell[细胞]50:667,1987)。此类多核苷酸或多肽具有序列同源性，正如其序列相似性所反映的，无论是在百分比同一性方面或是在保守位置上存在特定氨基酸或基序。例如，两个同源多肽可以具有至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少900％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和甚至100％相同的氨基酸序列。
“合适的调控序列”对本领域普通技术人员给出了它普通的和惯常的意思，并且非限制地用于指位于编码序列的上游(5’-非编码序列)、之内或下游(3’-非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”对本领域普通技术人员给出了它普通的和惯常的意思，并且非限制地用于指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3’。启动子可整个来源于天然基因，或由来源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或甚至包含合成的DNA片段。本领域的技术人员应理解的是不同的启动子可以指导基因在不同的组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或应答不同的环境条件的表达。引起基因在大多数细胞类型中表达的启动子大多数时候通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下，调控序列的准确界限尚未完全定义，所以不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上核酸序列间的关联，使得其中一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，则该启动子与该编码序列可操作地连接(即，该编码序列处于该启动子的转录控制之下)。编码序列能以有义或反义取向被可操作地连接至调控序列。
如本文所用的，“表达”对本领域普通技术人员给出了它普通的和惯常的意思，并且非限制性地用于指来源于本主题技术的核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。“过表达”是指基因产物在转基因或重组生物中的产量超过在正常或非转化生物体中的产生水平。
“转化”对本领域普通Y技术人员给出了它普通的和惯常的意思，并且非限制性地用于指将多核苷酸转移到靶细胞中。该被转移的多核苷酸可以被并入靶细胞的基因组或染色体DNA中，得到基因上稳定的遗传，或其可以独立于宿主染色体而复制。含有转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”或。
当在本文中与宿主细胞连用时，术语“转化的”、“转基因的”以及“重组的”对本领域普通技术人员给出了它们各自的普通的和惯常的意思，并且非限制性地用于指已经向其中引入异源核酸分子的宿主生物的细胞，例如植物或微生物细胞。核酸分子可以被稳定地整合到宿主细胞的基因组中，或核酸分子可以作为染色体外的分子存在。这种染色体外的分子可以是自主复制的。经转化的细胞、组织或主题应当被理解为不仅涵盖转化过程的最终产物，还涵盖其转基因子代。
当在本文中与多核苷酸连用时，术语“重组的”、“异源的”以及“外源的”对本领域普通技术人员给出了它们普通的和惯常的意思，并且非限制性地用于指源于相对于特定宿主细胞为外来的多核苷酸(例如，DNA序列或基因)或如果来自相同来源，其是从其原始形式被修饰的。因此，宿主细胞中的异源基因包括这样的基因，其相对于该具体宿主细胞而言是内源的，但已经通过例如使用定点诱变或其他重组技术进行了修饰。这些术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此，这些术语是指这样的DNA片段，其相对于细胞而言是外来的或异源的，或相对于细胞而言是同源的但元件处在不常见于该宿主细胞内的位置或形式。
类似地，当在本文中与多肽或氨基酸序列连用时，术语“重组的”、“异源的”和“外源的”意指这样的多肽或氨基酸序列，其相对于该具体宿主细胞而言起源于外部来源，或者如果来自相同来源，则在其原始形式上经过修饰。因此，可以在宿主细胞中表达重组DNA片段以产生重组多肽。
术语“质粒”、“载体”以及“盒”对本领域普通技术人员给出了它们各自普通的和惯常的意思，并且非限制性地用于指通常携带基因的染色体外元件，这些基因不是细胞的中心新陈代谢的部分，并且通常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可能是任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA，其中大量核苷酸序列已经被接合或重组成独特的构造，其能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当的3’非翻译序列引入到细胞中。
“转化盒”是指特定的载体，其含有外来基因并具有除该外来基因以外的、有利于具体宿主细胞的转化的元件。
“表达盒”是指特定的载体，其含有外来基因并具有除该外来基因以外的、允许该基因在外来宿主中的增强表达的元件。
本披露涉及通过B-glu1酶合成目的甜菊醇糖苷。
合成生物学
这里所用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是熟知的并且描述于：例如，Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版；Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor[冷泉港实验室:冷泉港],N.Y.[纽约],1989(在下文中称为“Maniatis”)；和Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.Experiments with Gene Fusions[基因融合实验]；ColdSpring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor[冷泉港实验室:冷泉港],N.Y.[纽约],1984；以及Ausubel,F.M.等人,在Current Protocols in Molecular Biology[当前分子生物学方案]中,Greene Publishing and Wiley-Interscience[格林出版社和威利国际科学出版社]出版,1987；(这些文献各自通过引用以其全文特此并入本文)。
除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。虽然类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和材料可以用于本披露的实践或测试，但优选的材料和方法描述如下。
糖基化通常被认为是控制植物天然产物的生物活性和储存的普遍存在的反应。在迄今为止已研究的大多数植物物种中，小分子的糖基化由转移酶超家族催化。这些糖基转移酶(GT)已被分类为超过60个家族。其中，GT酶(也称为UDP糖基转移酶(UGT))的家族将UDP活化的糖部分转移至特定的受体分子。这些是转移在甜菊醇糖苷中的此类糖部分以产生多种莱鲍迪苷的分子。这些UGT中的每一个都具有它们自己的活性谱和优选的结构位置，在那里它们转移它们的活化的糖部分。
生产系统
原核生物中蛋白质的表达大部分通常在具有含指导融合或非融合蛋白质表达的组成型或诱导型启动子的载体的细菌宿主细胞中完成。融合载体将一些氨基酸添加至在其中编码的蛋白质，通常添加至重组蛋白的氨基端。这种融合载体典型地有三个目的：l)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解度；以及3)通过作为亲和纯化中的配体起作用帮助重组蛋白的纯化。通常，在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白裂解位点以在纯化融合蛋白后使重组蛋白从融合部分分离。此类载体在本披露的范围内。
在实施例中，表达载体包括用于在细菌细胞中表达重组多肽的那些遗传元件。用于在细菌细胞中转录和翻译的元件可以包括启动子、针对蛋白复合体的编码区和转录终止子。
本领域普通技术人员会知道可用于制备表达载体的分子生物学技术。如上所述，用于并入本主题技术的表达载体的多核苷酸可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)的常规技术制备。
已经开发了许多分子生物学技术以通过互补的粘性末端将DNA可操作地连接至载体。在一个实施例中，可以将互补的均聚物片段添加至待被***载体DNA的核酸分子中。载体和核酸分子然后通过互补的均聚物尾之间的氢键连接以形成重组DNA分子。
在一个可替代的实施例中，提供的含有一个和或多个限制性位点的合成的接头用于将本主题技术的多核苷酸可操作地连接至表达载体。在实施例中，多核苷酸通过限制性内切酶消化产生。在实施例中，将核酸分子用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理，这些酶用它们的3’-5’核酸外切酶活性去除突出的3’-单链末端，并用它们的聚合活性填补凹进的3’-末端，从而产生平末端DNA片段。在酶的存在下将平末端片段然后用大摩尔过量的接头分子进行孵育，该酶能够催化平末端DNA分子的连接，例如噬菌体T4 DNA连接酶。因此，反应产物是在其末端携带有聚合的接头序列的多核苷酸。这些多核苷酸然后用适当的限制性酶裂解并连接至已经用酶裂解而产生与多核苷酸的那些末端相容的末端的表达载体。
可替代地，可以使用具有不依赖于连接的克隆(ligation-independent cloning，LIC))位点的载体。然后所要求的PCR扩增的多核苷酸可以不经限制性消化或连接而被克隆到LIC载体中(Aslanidis和de Jong,Nucl.Acid.Res.[核酸研究]18,6069-74,(1990)；Haun等人,Biotechniques[生物技术]13,515-18(1992)，这些文献以与其一致的程度通过引用并入本文)。
在实施例中，为分离和/或修饰用于***所选质粒的目标多核苷酸，适合用PCR。可以设计用于在序列的PCR制备中使用的适当的引物以分离核酸分子的所要求的编码区、添加限制性核酸内切酶或LIC位点、将编码区放入所希望的阅读框。
在实施例中，通过使用PCR，使用适当的寡核苷酸引物制备用于并入本主题技术的表达载体中的多核苷酸。编码区被扩增，同时引物本身变为并入扩增的序列产物中。在实施例中，扩增引物含有限制性核酸内切酶识别位点，该位点使得扩增的序列产物被克隆到适当的载体。
可以通过常规转化或转染技术将表达载体引入重组宿主细胞(例如植物或微生物宿主细胞)中。用本主题技术的表达载体进行适当细胞的转化是通过本领域已知的方法完成的，并典型地取决于载体和细胞的类型。合适的技术包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体转染、化学穿孔(chemoporation)或电穿孔。
通过本领域熟知的技术可以鉴定成功转化的细胞(即，含有表达载体的那些细胞)。例如，可以培养用本主题技术的表达载体转染的细胞以产生本文所述的多肽。可以通过本领域熟知的技术检查细胞中是否存在表达载体DNA。
宿主细胞可以含有先前所述的表达载体的单拷贝，或可替代地，该表达载体的多个拷贝。
在一些实施例中，转化的细胞为动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、藻细胞、真菌细胞或酵母细胞。在一些实施例中，细胞是选自下组的植物细胞，该组由以下组成：卡诺拉油菜(canola)植物细胞、油菜籽植物细胞、棕榈植物细胞、向日葵植物细胞、棉花植物细胞、玉米植物细胞、花生植物细胞、亚麻植物细胞、芝麻植物细胞、大豆植物细胞、和矮牵牛植物细胞。
微生物宿主细胞和含有指导外来蛋白高水平表达的调控序列的其他宿主细胞表达系统和表达载体是本领域技术人员熟知的。这些中的任何可以被用于构建用于在微生物宿主细胞中表达本主题技术的重组多肽的载体。然后可以通过转化将这些载体引入适当的微生物中以允许本主题技术的重组多肽的高水平表达。
可用于转化适合的微生物宿主细胞和其他宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。典型地，载体或盒含有指导相关多核苷酸的转录和翻译的序列、选择性标记以及允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含具有转录起始控制的多核苷酸的5’区和控制转录终止的DNA片段的3’区。对于两个控制区均优选的是来源于与被转化的宿主细胞同源的基因，虽然应该被理解的是这些控制区不需要来源于被选作宿主的特定物种的天然的基因。
可用于驱动重组多肽在所希望的微生物宿主细胞或其他宿主细胞中表达的起始控制区或启动子对于本领域技术人员是非常多的并且是熟悉的。事实上，任何能驱动这些基因的启动子都适合于本主题技术，该启动子包括但不限于CYCI、HIS3、GALI、GALIO、ADHI、PGK、PH05、GAPDH、ADCI、TRPI、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于在酵母属中的表达)；AOX1(可用于在毕赤酵母属中的表达)；以及lac、trp、JPL、IPR、T7、tac和trc(可用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达)。
终止控制区也可以来源于对微生物宿主天然的多种基因。对于本文所述的微生物宿主来说，任选地可以包括终止位点。
在植物细胞中，本主题技术的表达载体可以包括可操作地连接至能指导本主题技术的重组多肽在所希望的发育阶段中在所希望的组织中表达的启动子的编码区。出于方便，待表达的多核苷酸可以包含来源于相同多核苷酸的启动子序列和翻译前导序列。编码转录终止信号的3’非编码序列也应该存在。表达载体还可以包含一个或多个内含子以促进多核苷酸表达。
对于植物宿主细胞，能够诱导编码区表达的任何启动子和任何终止子的任何组合可以用在本主题技术的载体序列中。启动子和终止子的一些合适的实例包括来自胭脂碱合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)和花椰菜花叶病毒(CaMV)基因的那些。可以使用的有效的植物启动子的一种类型是高水平植物启动子。与主题技术的表达载体可操作连接的此类启动子应该能促进载体的表达。在本主题技术中可以使用的高水平植物启动子包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基(ss)的启动子，例如来自大豆(Berry-Lowe等人,J.MolecularandApp.Gen.[分子与应用基因],1:483498(1982)，该文献的全文以与其一致的程度特此并入本文))以及叶绿素alb结合蛋白的启动子。这两种启动子已知在植物细胞中是光诱导的(参见，例如，Genetic Engineering of Plants,an Agricultural Perspective[植物基因工程农业视角],A.Cashmore,Plenum.[普莱南出版公司],N.Y.[纽约](1983),第2938页；Coruzzi,G.等人,The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],258:1399(1983)；和Dunsmuir,P.等人,Journal of Molecular and Applied Genetics[分子与应用基因学杂志],2:285(1983)，这些文献以与其一致的程度通过引用特此并入本文)。
细胞破碎技术
细胞破碎是用于从细胞内释放目的生物分子的技术的集合。许多生物技术产生的化合物是细胞内的，并且必须在回收前从细胞中释放出来。产品的有效回收需要细胞破碎，取决于目的生物分子和所使用的细胞系统，该细胞破碎可以通过使用不同的方法和技术(机械或非机械方法)来实现。应该注意的是，所有破碎方法都将释放目的分子(本文是甜菊醇糖苷)，以及可能导致裂解物中目的蛋白质分解的其他分子。如果蛋白质活性对下游工作很重要，则需要考虑防止这种情况。在高变性溶液或高pH下裂解样品使酶促活性最小化。在冰上或较低温度下进行破碎还有助于使样品的降解最小化。因此，抑制蛋白酶活性的一种技术是一旦破碎就具有可用于裂解物的一般磷酸酶抑制剂混合物。
根据当前披露可以使用的已知破碎技术
标准品破碎由以下组成：机械均化、弗氏压碎、超声处理、珠粒均化、研磨、冻融裂解、洗涤剂裂解、酶促裂解和渗透裂解。
机械均化包括使用手持装置，如杜恩斯(Dounce)匀浆器，或类似搅拌器的东西，以使组织均化。该方法可用于非种子植物类材料或软组织(即肝组织)。
弗氏压碎使用剪切力使组织均化。这方面的一个实例是采用细胞悬浮液，并使用注射器针筒和柱塞推动该细胞悬浮液通过窄规格注射器。这适用于细菌、酵母、真菌、藻类和哺乳动物细胞培养，但难以扩大规模。
超声处理使用短脉冲超声波来破坏组织。该方法产生大量热量，并将典型地必须在冰上进行以维持蛋白质。该方法还对细菌、酵母、真菌、藻类和哺乳动物细胞培养有效，并且是当前披露的优选的方法。
珠粒均化涉及使用玻璃或金属珠粒进行轻微磨损，同时用组织或细胞悬浮液涡旋这些珠粒。研磨涉及使用研钵和研杵来均化组织样品。最常用的方法是使用液氮来冷冻和研磨样品。冻融裂解就如同其字面意思一样，使用液氮或冷冻机来冷冻细胞并然后让它们解冻。当细胞冷冻时，细胞内的水在冻结时膨胀，导致细胞破裂释。该方法对哺乳动物细胞有效。
酶促裂解包括将细胞悬浮在含有可以消化细胞壁的酶(即，酵母细胞的溶细胞酶)的等渗缓冲液中。该裂解方法通常与另一种破碎技术(通常是超声处理)结合使用以确保样品的完全裂解。该技术对细菌、酵母、真菌、藻类、非种子植物材料和哺乳动物细胞培养是有效的，并且由当前披露体现。
洗涤剂裂解涉及将细胞悬浮于洗涤剂溶液中以溶解细胞膜，释放细胞内容物。该方法通常还使用另一种裂解方法(例如超声处理)以确保完全裂解。该方法对哺乳动物细胞培养是有效的。
渗透裂解涉及将细胞悬浮在低渗(低盐)溶液中。这导致细胞膨胀并最终破裂释放细胞内容物用于进一步使用。
典型地，在本主题技术的体外方法中，基于干重，重组多肽与底物的重量比为从约1∶100至约1∶5，优选从约1∶50至约1∶10，更优选从约1∶25至约1∶15。
典型地，体外方法的反应温度为从约20℃至约40℃，适合地从25℃至约37℃，更适合地从28℃至约32℃。
本领域技术人员将认识到，由本文所述的方法产生的甜菊醇糖苷组合物可以被进一步纯化并与其他的甜菊醇糖苷、香料或甜味剂混合以获得所希望的风味或甜味剂组合物。例如，如本文所述产生的富集有莱鲍迪苷D4或莱鲍迪苷M的组合物可以与含有莱鲍迪苷A作为主要甜菊醇糖苷的天然甜叶菊提取物混合，或与其他合成的或天然的甜菊醇糖苷产物混合以制备所希望的甜味剂组合物。可替代地，从本文所述的甜菊醇糖苷组合物获得的基本上纯的甜菊醇糖苷(例如，莱鲍迪苷D4或莱鲍迪苷M)可以与其他的甜味剂(如蔗糖、麦芽糖糊精、天冬苯丙二肽酯、三氯蔗糖、纽甜、乙酰氨基磺酸钾和糖精)结合。如本领域已知的，可以调节甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的量以获得所希望的味道。本文所述的甜菊醇糖苷组合物(包括莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷D4、莱鲍迪苷M或它们的组合)可以包含在食物产品(如饮料、软饮料、冰激凌、乳制品、甜品、谷物、口香糖、烘焙商品等)、膳食补充剂、医药营养品以及药品中。
用同一性评分分析序列相似性
如本文所用的，“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的整个比对窗口中不变的程度。用于测试序列和参考序列的比对片段的“同一性分数”是由两个比对序列共有的相同组分的数量除以参考序列片段(即整个参考序列或参考序列的较小定义部分)中的组分总数。
如本文所用的，术语“序列同一性百分比”或“百分比同一性”是指参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中与测试(“主题”)多核苷酸分子(或其互补链)相比的相同核苷酸的百分比，这是当这两个序列最佳比对时(在比较窗口上适当的核苷酸***、缺失或缺口总共小于参考序列的20％)。用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员熟知的，并且可以通过如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的搜索相似性方法的工具来进行，并且优选地通过这些算法的计算机化实施，例如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，可作为
序列同一性的百分比优选使用序列分析软件包(Sequence Analysis SoftwarePackageTM)(版本10；威斯康辛州麦迪逊(Madison,WI)的遗传学计算机组公司(GeneticsComputer Group,Inc.))的“BestFit(最佳拟合)”或“Gap(缺口)”程序确定。“Gap”利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch，Journal ofMolecularBiology[分子生物学杂志]48:443-453,1970)来找到两个序列的比对，其使匹配数最大化并使缺口数最小化。“BestFit”对两个序列之间的最佳相似性片段进行最佳比对，并使用Smith和Waterman的局部同源性算法***缺口以使匹配数最大化(Smith和Waterman，Advances in AppliedMathematics[应用数学进展],2:482-489，1981；Smith等人,Nucleic Acids Research[核酸研究]11:2205-2220,1983)。最优选使用“Best Fit”程序确定同一性百分比。
用于确定序列同一性的有用方法也披露于基本局部比对搜索工具(BLAST)程序中，该程序可从美国国立卫生研究院(National Institute ofHealth)(贝塞达斯(Bethesda)，马里兰州(Md.)20894)的国立医学图书馆(National Library of Medicine)的国家中心生物技术信息(National Center Biotechnology Information，NCBI)公开获得；参见BLAST Manual[BLAST手册]，Altschul等人，NCBI，NLM，NIH；Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990)；BLAST程序的2.0版本或更高版本允许在比对中引入缺口(缺失和***)；对于肽序列，BLASTX可用于确定序列同一性；并且，对于肽序列，BLASTN可用于确定序列同一性。
如本文所用的，术语“基本百分比序列同一性”是指至少约70％序列同一性，至少约80％序列同一性，至少约85％同一性，至少约90％序列同一性，或甚至更大的序列同一性(例如约98％或约99％序列同一性)的百分比序列同一性。因此，本披露的一个实施例是多核苷酸分子，该多核苷酸分子与本文所述的多核苷酸序列具有至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％同一性、至少约90％序列同一性、或甚至更高的序列同一性，例如约98％或约99％序列同一性。具有当前披露的β-葡糖苷酶基因的活性的多核苷酸分子能够指导多种甜菊醇糖苷的产生，并且与本文提供的多核苷酸序列具有基本百分比序列同一性，并且涵盖在本披露的范围内。
同一性和相似性
同一性是在序列比对后一对序列之间相同的氨基酸的分数(可以仅使用序列信息或结构信息或一些其他信息来完成，但通常仅基于序列信息)，并且相似性是基于使用一些相似性矩阵的比对而分配的得分。相似性指数可以是以下BLOSUM62、PAM250或GONNET中的任何一种，或本领域技术人员用于蛋白质序列比对的任何矩阵。
同一性是两个子序列之间的对应程度(序列之间没有缺口)。25％或更高的同一性意味着功能的相似性，而18％-25％意味着结构或功能的相似性。请记住，两个完全不相关的或随机的序列(大于100个残基)可以具有高于20％的同一性。相似性是两个序列比较时它们之间的相似程度。这取决于它们的同一性。
从前面的描述显而易见的是，本披露的某些方面不受本文所示的实例的特定细节的限制，因此预期本领域技术人员将想到其他修饰和应用、或其等同物。因此预期权利要求书应该覆盖不脱离本披露的精神和范围的所有此类修饰和应用。
而且，除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有与本披露所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料可以用于本披露的实践或测试，但优选的方法和材料是以上所述的。
尽管出于理解的目的通过说明和实例详细地描述了前述发明，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以实施某些改变和修饰。因此，描述和实例不应解释为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书描述。
根据当前披露，可以将β-葡糖苷酶(“B-glu1”)用于水解甜菊醇糖苷并以新颖的方式减少不希望的甜菊醇糖苷的产生。在甜叶菊提取物或发酵产物中不希望的甜菊醇糖苷的存在影响甜菊醇糖苷的总体味道特征和有用性。通过减少产生步骤，当前披露将降低在甜叶菊粗提取物中所希望的甜菊醇糖苷的纯化和产生的成本。
当考虑到以下非限制性实例时，会更充分地理解本披露。虽然指示了本主题技术的优选的实施例，但应该理解的是以下实例仅通过说明的方式给出。从上面的讨论和这些实例中，本领域技术人员可以确定本主题技术的必要特征，并在不违背其精神和范围下，可以做出本主题技术的多种变化和修饰以使其适应各种用途和条件。
实例1：鉴定巴斯德毕赤酵母(Pichiapastori)中的β-糖苷酶
根据当前披露，完成了巴斯德毕赤酵母基因组分析并鉴定了若干种β-糖苷酶候选基因。所有候选β-葡糖苷酶基因的全长DNA片段是商业合成的。几乎所有cDNA的密码子都改变为针对大肠杆菌的优选的密码子(新泽西州(NJ)的金斯瑞公司(Genscript))。将合成的DNA克隆到细菌表达载体：pETite N-HisSUMO Kan载体(鲁西金公司(Lucigen))中。可以在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中进行这些相同的实验，该解脂耶氏酵母具有针对这种用途优化的序列。
将每个表达构建体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，然后在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养液中于37℃生长直至OD600达到0.8-1.0。通过添加1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达，并使培养物在16℃再生长22小时。通过离心(3,000x g；10min；4℃)收获细胞。收集细胞团块并立即使用或保存在-80℃。
将细胞团块典型地重悬浮于裂解缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.2、25ug/ml溶菌酶、5ug/ml DNA酶I、20mM咪唑、500mM NaCl、10％甘油、和0.4％Triton X-100)中。在4℃通过超声处理将细胞破碎，并通过离心(18,000x g；30min)将细胞碎片澄清。将上清液上样到经过平衡的(平衡缓冲液：50mM磷酸钾缓冲液，pH 7.2、20mM咪唑、500mM NaCl、10％甘油)Ni-NTA(凯杰公司(Qiagen))亲和柱上。在上样蛋白样品后，将柱用平衡缓冲液洗涤以去除未结合的污染蛋白。用含有250mM咪唑的平衡缓冲液洗脱带His标签的β-葡糖苷酶重组多肽。
通过使用多种甜菊醇糖苷作为底物，测定经纯化的候选β-葡糖苷酶重组多肽的去糖基化活性。典型地，将重组多肽(10μg)在300μl体外反应系统中测试。该反应系统含有50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)，1mg/ml甜菊醇糖苷。反应在30℃-37℃进行，并且在多个时间点处通过添加200μL 1-丁醇终止50ul反应。将样品用200μL的1-丁醇提取三次。将合并的级分干燥，并溶解于100μL 80％甲醇中，用于高效液相色谱法(HPLC)分析。
将毕赤酵母细胞悬浮于提取缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)；150mM NaCl)中。超声处理后，通过设置在4℃以12,000g的离心来收集上清液(粗提取物)。将所得粗蛋白质(50ug)在300ul体外反应系统中测试。该反应系统含有50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)，1mg/ml甜菊醇糖苷。反应在30℃-37℃进行，并且在多个时间点处通过添加200μL 1-丁醇终止50ul反应。将样品用200μL的1-丁醇提取三次。将合并的级分干燥，并溶解于100μL 80％甲醇中，用于高效液相色谱法(HPLC)分析。
然后使用Dionex UPLC ultimate 3000系统(森尼韦尔市(Sunnyvale)，加利福尼亚州(CA))进行HPLC分析，该系统包括四元泵、温控柱室、自动采样器和UV吸光度检测器。将具有保护柱的Synergi Hydro-RP柱(菲罗门公司(Phenomenex))用于表征合并样品中的甜菊醇糖苷。在HPLC分析中，将在水中的乙腈作为流动相。在HPLC分析中使用的检测波长是210nm。活性筛选后，我们发现β-葡糖苷酶(B-glu1，SEQ:1)具有强烈的活性裂解相关的甜菊醇糖苷，并因此是产生目的甜菊醇糖苷的有用工具。
实例2：通过使用重组B-glu1和破碎的毕赤酵母细胞水解甜茶苷
甜茶苷可以被重组B-glu1酶和破碎的毕赤酵母细胞水解以产生甜菊醇-13-葡糖苷。随后可以将产生的甜菊醇-13-葡糖苷水解以产生甜菊醇(图1B)。如实例1所述设置反应。在反应中添加1g/L甜茶苷作为底物。如图1A所示，B-glu1可以从甜茶苷的C19位置去除葡糖基基团以产生甜菊醇-13-葡糖苷(图1A-c)。在之后的时间点，产生的甜菊醇-13-葡糖苷(S-13-G)将转化为甜菊醇(图1A-d)。B-glu1从甜菊醇-13-葡糖苷的C13位置去除另一个葡糖基基团。由于B-glu1是毕赤酵母细胞中的胞间酶，破碎的毕赤酵母细胞释放B-glu1酶，该酶具有相同酶促活性以将甜茶苷水解为甜菊醇-13-葡糖苷并持续水解以产生甜菊醇(图1A-e和f)。
实例3：通过使用重组B-glu1和破碎的毕赤酵母细胞水解甜菊苷
甜菊苷可以被重组B-glu1酶和破碎的毕赤酵母细胞水解以产生甜菊醇二糖苷(图2B)。如实例1所述设置反应。在反应中添加1g/L甜菊苷作为底物。如图2所示，B-glu1可以从甜菊苷的C19位置去除葡糖基基团以产生甜菊醇二糖苷(图2A c和d)。由于B-glu1是毕赤酵母细胞中的胞间酶，破碎的毕赤酵母细胞释放B-glu1酶，该酶具有相同的酶促活性以将甜菊苷水解为甜菊醇二糖苷(图8C)。
实例4：通过使用重组B-glu1和破碎的毕赤酵母细胞水解莱鲍迪苷E
莱鲍迪苷E可以被重组B-glu1酶水解以产生甜菊醇二糖苷(图3B)。如实例1所述设置反应。在反应中添加1g/L莱鲍迪苷E作为底物。如图3所示，B-glu1可以从莱鲍迪苷E的C19位置去除葡糖基基团以产生甜菊苷和甜菊醇二糖苷(图3A c-e)。由于B-glu1是毕赤酵母细胞中的胞间酶，破碎的毕赤酵母细胞释放B-glu1酶，该酶具有相同的酶促活性以将莱鲍迪苷E水解为甜菊醇二糖苷(图8D)。
实例5：通过使用重组B-glu1和破碎的毕赤酵母细胞水解莱鲍迪苷A
莱鲍迪苷A可以被重组B-glu1酶水解以产生莱鲍迪苷B(图4B)。如实例1所述设置反应。在反应中添加1g/L莱鲍迪苷A作为底物。如图4所示，B-glu1可以从莱鲍迪苷A的C19位置去除葡糖基基团以产生莱鲍迪苷B(图4A c-d)。由于B-glu1是毕赤酵母细胞中的胞间酶，破碎的毕赤酵母细胞释放B-glu1酶，该酶具有相同的酶促活性以将莱鲍迪苷A水解为莱鲍迪苷B(图8e)。
实例6：通过使用重组B-glu1和破碎的毕赤酵母细胞水解莱鲍迪苷I
莱鲍迪苷I可以被重组B-glu1酶水解以产生莱鲍迪苷A，并且产生的A可以被水解以产生莱鲍迪苷B(图5B)。如实例1所述设置反应。在反应中添加1g/L莱鲍迪苷I作为底物。如图5所示，B-glu1可以从莱鲍迪苷I的C19位置去除葡糖基基团以产生莱鲍迪苷A，并随后从莱鲍迪苷A的C19位置去除另一个葡糖基基团以产生莱鲍迪苷B(图5A d-f)。在24小时，莱鲍迪苷I可以完全转化为莱鲍迪苷A(图5A f)。由于B-glu1是毕赤酵母细胞中的胞间酶，破碎的毕赤酵母细胞释放B-glu1酶，该酶具有相同的酶促活性以将莱鲍迪苷I水解为莱鲍迪苷B(图8f)。
实例7：通过使用重组B-glu1和破碎的毕赤酵母细胞水解莱鲍迪苷D
莱鲍迪苷D可以被重组B-glu1酶水解以产生莱鲍迪苷B(图6B)和Reb A。如实例1所述设置反应。在反应中添加1g/L莱鲍迪苷D作为底物。如图6所示，B-glu1可以从莱鲍迪苷D的C19位置去除葡糖基基团以产生莱鲍迪苷(图6A c-e)。由于B-glu1是毕赤酵母细胞中的胞间酶，破碎的毕赤酵母细胞释放B-glu1酶，该酶具有相同的酶促活性以将莱鲍迪苷D水解为莱鲍迪苷B(图8g)。
实例8：通过使用重组B-glu1和破碎的毕赤酵母细胞水解莱鲍迪苷G
莱鲍迪苷G可以被重组B-glu1酶和破碎的毕赤酵母细胞水解以产生甜菊醇-13-葡糖苷。可以将产生的甜菊醇-13-葡糖苷持续水解以产生甜菊醇(图7B)。如实例1所述设置反应。在反应中添加1g/L莱鲍迪苷G作为底物。如图7A所示，B-glu1可以从莱鲍迪苷G的C13和C19位置去除葡糖基基团以产生甜菊醇-13-葡糖苷(图7A b-c)。产生的甜菊醇-13-葡糖苷(S-13-G)将被转化为甜菊醇(图7A)。在24小时，产生的甜菊醇-13-葡糖苷将被完全转化为甜菊醇(图7A d)。B-glu1从甜菊醇-13-葡糖苷的C13位置去除另一个葡糖基基团。由于B-glu1是毕赤酵母细胞中的胞间酶，破碎的毕赤酵母细胞释放B-glu1酶，该酶具有相同的酶促活性以将莱鲍迪苷G水解为甜菊醇-13-葡糖苷，并持续水解以产生甜菊醇(图7A e)。
根据当前披露，我们鉴定并量化了β-葡糖苷酶对巴斯德毕赤酵母细胞裂解物的酶促活性。该酶具有特定的活性，该活性允许该酶水解特定的甜菊醇糖苷(表1)。参考图7，RebG被B-glu1酶和破碎的毕赤酵母细胞水解。HPLC显示Reb G水解的产物。在此努力下产生甜菊醇(“S”)、甜菊醇-13-葡糖苷(“S-13-G”)、甜茶苷(“Rub”)。时程是24小时内的一系列时间点。通过重组巴斯德毕赤酵母培养物产生甜菊醇-13-葡糖苷(“S-13-G”)和甜菊醇。
使用该技术，我们已经水解了Reb M以去除Reb A、Reb D3、Reb D4、Reb W、Reb V、Reb E、Reb I和Reb D从而提高纯化功效(图9)。该技术涉及使用甜菊苷和Reb A，以通过β-葡糖苷酶生物转化产生甜菊醇、甜菊醇-13-O-葡糖苷、甜菊醇二糖苷和Reb B。参考图8，甜菊醇糖苷被破碎的巴斯德毕赤酵母细胞水解。这些样品包括甜菊醇二糖苷(“SB”)和莱鲍迪苷B(“B”)标准品。在我们的实验中，在24小时，甜菊苷被破碎的毕赤酵母细胞水解；在24小时，Reb E和Reb A被破碎的毕赤酵母细胞水解。同样地，在24小时，Reb I和Reb D被破碎的毕赤酵母细胞水解(图8)。
在当前披露的另一个实施例中，我们可以使用β-葡糖苷酶以控制甜菊醇糖苷产生途径。(例如：从Reb W到Reb M)(图10)。
根据当前披露的优选的实施例，可以将β-葡糖苷酶用于水解另外的甜菊醇糖苷(包括Reb V、Reb W、Reb Z1、Reb Z2、Reb D3和Reb D4)以驱动这些甜菊醇苷成为目的甜菊醇糖苷(图9)。此后，我们可以分离、收集和浓缩水解的产物。在当前披露的另一个实施例中，我们使用β-葡糖苷酶缺陷型菌株，该菌株将减少我们的生物转化过程中的副产物。
表1：通过B-glu1水解甜菊醇糖苷的总结。
工业实用性声明/技术领域
本披露适用于食品、饲料、饮料和药理学工业。本披露总体上涉及用于通过β葡糖苷酶的水解的甜菊醇糖苷生物合成的方法。
通过引用援引和并入的文献：
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目的序列：
序列：
B-glu1：
B-glu1氨基酸：(SEQ ID NO：1)巴斯德毕赤酵母序列(GS115)
B-glu1 DNA：(SEQ ID NO：2)(针对大肠杆菌的密码子优化)
B-glu2氨基酸：(SEQ ID NO：3)巴斯德毕赤酵母序列(GS115)
B-glu2 DNA(SEQ ID NO：4)巴斯德毕赤酵母序列(GS115)
B-glu3氨基酸(SEQ ID NO：5)巴斯德毕赤酵母序列(GS115)
B-glu3 DNA(SEQ ID NO：6)巴斯德毕赤酵母序列(GS115)
B-glu4氨基酸(SEQ ID NO：7)巴斯德毕赤酵母序列(GS115)
B-glu4 DNA(SEQ ID NO：8)巴斯德毕赤酵母序列(GS115)
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