阅读说明：本技术 一种吡咯-部花菁衍生物荧光探针及其制备方法和应用 (Pyrrole-part cyanine derivative fluorescent probe and preparation method and application thereof ) 是由 王元 吴伟娜 赵晓雷 郭芳芳 李晓红 刘盼 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种吡咯-部花菁衍生物荧光探针及其制备方法和应用,其中所述吡咯-部花菁衍生物的化学结构式如下：<Image he="203" wi="419" file="100004_DEST_PATH_IMAGE001.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>；制备方法为：将N-吗啉乙基-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯-3-甲酰胺和N-乙基苯并噻唑碘盐溶解于有机溶剂中；将所得溶液滴加哌啶作催化剂,然后在80℃下回流搅拌反应3-4h；然后冷却至室温,减压抽滤,所得固体残渣用乙醇清洗,再用乙醇重结晶,得到所述吡咯-部花菁衍生物荧光探针。本发明的吡咯-部花菁衍生物荧光探针在纯水相生理条件下能选择性的与次氯酸根作用,溶液黄色褪色,同时绿色荧光显著减弱,特别是作为荧光探针在细胞溶酶体内次氯酸根的方便检测的应用。(The invention provides a pyrrole-part cyanine derivative fluorescent probe and a preparation method and application thereof, wherein the chemical structural formula of the pyrrole-part cyanine derivative is as follows: (ii) a The preparation method comprises the following steps: dissolving N-morpholinoethyl-2, 4-dimethyl-5-formylpyrrole-3-formamide and N-ethylbenzothiazole iodide in an organic solvent; dripping piperidine into the obtained solution to be used as a catalyst, and then refluxing and stirring the solution at the temperature of 80 ℃ to react for 3 to 4 hours; and then cooling to room temperature, carrying out vacuum filtration, washing the obtained solid residue with ethanol, and recrystallizing with ethanol to obtain the pyrrole-part cyanine derivative fluorescent probe. The pyrrole-part cyanine derivative of the invention is fluorescent probeThe needle can selectively react with hypochlorite under the condition of pure water phase biological condition, the solution is yellow and faded, and simultaneously green fluorescence is obviously weakened, and the needle is particularly used as a fluorescent probe for conveniently detecting hypochlorite in cell lysosomes.)

一种吡咯-部花菁衍生物荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机合成领域，具体涉及吡咯-部花菁衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

次氯酸（HClO）通常以次氯酸根（ClO−）的形式存在于生理环境中，具有杀菌作用，在机体被微生物入侵时也起到免疫作用。但是，吞噬细胞中产生的过量的 HClO 也会对人体产生伤害。已经有证据表明次氯酸根一些组织的炎症有关，而且人们认为中性粒细胞释放的次氯酸根跟肺部受损、类风湿性关节炎、肝缺血再灌注损伤以及肾脏疾病有关。细胞内过量的次氯酸根主要由溶酶体代谢，其浓度与溶酶体氧化还原平衡密切相关。在日常生活中，次氯酸也是常用的消毒剂。因此，生物样品中次氯酸根检测的选择性和敏感性工具的开发愈发显得重要。

近年来，荧光分子探针技术由于具有灵敏度高、操作简单、成本低等特点，已经成为检测重要金属离子，阴离子和小分子的重要手段。但现有绝大多数次氯酸根荧光探针需要有机助溶剂（>10%），无法在纯水相实现次氯酸根识别，限制了其进一步实际应用。而且当今对溶酶体靶向定位的次氯酸根荧光探针的报道并不多。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明考虑到部花菁衍生物优异的光化学和光物理特性，以含吡咯的部花菁衍生物为荧光探针，并引进吗啉环作为溶酶体的定位基团，合成了一种高灵敏度、高选择性的次氯酸根荧光探针。该探针能应用于纯水体系中次氯酸根的测定，具有溶酶体靶向功能，并能应用于溶酶体内次氯酸根浓度的检测。

本发明的主要目的在于提供一种可用于纯水体系和细胞溶酶体内针对次氯酸根的灵敏度高、选择性好的吡咯-部花菁衍生物荧光探针；另一目的是提供该荧光探针的制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种吡咯-部花菁衍生物荧光探针，所述吡咯-部花菁衍生物具有如下结构式：

。

本发明还提供了一种吡咯-部花菁衍生物荧光探针的制备方法，具体制备方法如下：

S1：将N-吗啉乙基-2，4-二甲基-5-甲酰基吡咯-3-甲酰胺和N-乙基苯并噻唑碘盐首先用有机溶剂溶解；

S2：将S1所得溶液滴加哌啶作催化剂，在80℃下回流3-4h；

S3：将S2所得溶液冷却至室温，减压抽滤，所得固体残渣用乙醇清洗，再用乙醇重结晶，得到所述吡咯-部花菁衍生物荧光探针。

更进一步地，所述乙醇为无水乙醇。

更进一步地，步骤S2中所述回流搅拌反应的时间为3h。

更进一步地，步骤S2中，N-吗啉乙基-2，4-二甲基-5-甲酰基吡咯-3-甲酰胺和哌啶的摩尔比为1:0.02。

更进一步地，步骤S1中加入的N-吗啉乙基-2，4-二甲基-5-甲酰基吡咯-3-甲酰胺和N-乙基苯并噻唑碘盐的摩尔比为1:1。

更进一步地，具体制备方法为，将2.79 g, N-吗啉乙基-2，4-二甲基-5-甲酰基吡咯-3-甲酰胺（10 mmol）和3.05 g N-乙基苯并噻唑碘盐（10 mmol）溶于0.05L乙醇中，滴加0.017 g哌啶（0.2 mmol）作催化剂，80℃下回流搅拌3-4h，冷却静置至室温，减压抽滤，所得固体用乙醇清洗得到所述吡咯-部花菁衍生物荧光探针。

本发明还提供了上述一种吡咯-部花菁衍生物荧光探针一种用途，即在作为次氯酸根荧光探针方面的应用，特别是在作为检测HeLa活细胞溶酶体内次氯酸根的荧光探针中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明通过缩合反应制备吡咯-部花菁衍生物荧光探针，原料易得，合成和后处理方法简单。在多种常见阴离子及活性氧物种中，对次氯酸根表现出较高的荧光识别性能。探针工作环境中无需任何有机溶剂助溶，非常有利于应用于生物体系，具有广泛的潜在应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的吡咯-部花菁衍生物荧光探针的¹H NMR谱图；

图2为本发明实施例1制得的吡咯-部花菁衍生物荧光探针的¹³C NMR谱图；

图3为本发明实施例1制得的吡咯-部花菁衍生物荧光探针的质谱谱图；

图4为本发明实施例1制得的吡咯-部花菁衍生物荧光探针(1×10^-5 mol／L)的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液 (0.02 mol／L，pH = 4)分别加入1×10^-4 mol／L阴离子（AcO⁻、Br⁻、Cl⁻、ClO⁻、ClO₄ ⁻、CN⁻、F⁻、H₂PO₄ ⁻、HPO₄ ⁻、I⁻、PO₄ ³⁻、S²⁻ 和SO₃ ²⁻)或活性氧物种 (H₂O₂、¹O₂、·OH、NO和O₂ ⁻）的紫外（a）和荧光（b）光谱图（激发波长为465 nm）；

图5为本发明实施例1制得的吡咯-部花菁衍生物荧光探针(1×10^-5 mol／L)的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液 (0.02 mol／L，pH = 4)滴定不同浓度ClO⁻的紫外（a）和荧光（b）光谱图,插图分别表示465 nm处吸光度和520 nm处荧光强度随次氯酸根浓度的线性变化趋势图（激发波长为465 nm）；

图6为在HeLa细胞中，吡咯-部花菁衍生物荧光探针与ClO⁻的荧光成像图；HeLa细胞用1×10^-5 mol／L 荧光探针培育30分钟后加入1×10^-4 mol/L ClO⁻，继续培育30分钟后，使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光成像。

其中：a为上述荧光探针绿色通道荧光成像图；b为上述荧光探针明场图；c为上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；d为上述荧光探针+ ClO⁻绿色通道荧光成像图；e为上述荧光探针+ ClO⁻明场下的成像图；f为上述荧光探针ClO⁻明场图和荧光图叠加后的图片。

图7为在HeLa细胞中，吡咯-部花菁衍生物荧光探针与商用溶酶体定位染料LysoTracker Red共染荧光成像图；HeLa细胞用1×10^-5 mol／L 荧光探针和LysoTrackerRed共同培育30分钟后，使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光成像。

其中：a为绿色通道荧光成像图；b为红色通道荧光成像图；c为绿色通道和红色通道叠加后的图片；d为明场图； e为绿色通道、红色通道和明场叠加后的图片；f为绿色通道和红色通道强度分布叠加图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。本发明实施例采用的试剂和原料为常规市场购买得到。

实施例1

本实施例吡咯-部花菁衍生物荧光探针的制备方法如下：

将2.79 g, N-吗啉乙基-2，4-二甲基-5-甲酰基吡咯-3-甲酰胺（10 mmol）和3.05 g N-乙基苯并噻唑碘盐（10 mmol）溶于0.05L乙醇中，滴加0.017 g哌啶（0.2 mmol）作催化剂，80℃下回流搅拌3-4h，冷却静置至室温，减压抽滤，所得固体用乙醇清洗，再用乙醇重结晶得到所述吡咯-部花菁衍生物荧光探针。目标产物的产率为82%。

采用核磁共振仪对制得的吡咯-部花菁衍生物进行核磁共振分析，结果如下：

¹H NMR (400 MHz, D₂O), δ (ppm): 7.85-7.87 (1H, d, Ar-H), 7.75-7.77 (1H,d, Ar-H), 7.60-7.63 (d, 1H, CH=), 7.57-7.61 (1H, t, Ar-H), 7.45-7.49 (1H, t,Ar-H), 6.92-6.96 (1H, d, CH=), 4.47-4.52 (2H, q, CH₂-CH₃), 3.70-3.72 (4H, t,2CH₂), 3.43-3.47 (2H, t, CH₂), 2.62-2.64 (6H, m, 3CH₂), 2.28 (3H, s, CH₃),2.17 (3H, s, CH₃), 1.40-1.43 (3H, t, CH₃). 具体核磁共振氢图谱见图1；

¹³C NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 170.35, 164.33, 142.46, 141.13, 135.51,133.22, 129.44, 127.73, 127.36, 126.71, 124.41, 122.31, 115.84, 102.77,66.75, 57.69, 53.63, 43.87, 36.26, 14.03, 13.59, 10.97. 具体核磁共振碳图谱见图2；

质谱ESI-MS: m/z = 439.2271 for [M+H]⁺; m/z = 220.1192 for [M+2H]²⁺。具体质谱谱图见图3。

实施例2

吡咯-部花菁衍生物对次氯酸根的光学性质测定

将上述实施例1制得的吡咯-部花菁衍生物作为荧光探针在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.02 mol／L，pH = 4)中配制成摩尔浓度为1×10^-5 mol／L的溶液，分别在含摩尔浓度为1×10^-4 mol/L的阴离子（AcO⁻、Br⁻、Cl⁻、ClO⁻、ClO₄ ⁻、CN⁻、F⁻、H₂PO₄ ⁻、HPO₄ ⁻、I⁻、PO₄ ³⁻、S²⁻ 和SO₃ ²⁻)或活性氧物种 (H₂O₂、¹O₂、·OH、NO和O₂ ⁻）的溶液中加入等量的上述荧光探针溶液，采用紫外可见分光光度计或荧光光谱仪进行分析（激发波长为465 nm），所得紫外和荧光光谱图见图4。通过图4可以看出，本发明制得的吡咯-部花菁衍生物作为探针只对次氯酸根具有明显响应，紫外信号和荧光信号均可用于次氯酸根的快速鉴别，而其它离子无变化。

通过图5的滴定光谱计算可以得到ClO⁻检出限为1.65×10^-7 mol/L，紫外光谱和荧光光谱的线性检测范围分别为2.25×10^-5-5.0×10^-5 mol／L和10.0×10^-5-3.2×10^-5 mol／L,因此本发明制得的吡咯-部花菁衍生物可用于次氯酸根的紫外和荧光定量检测。

实施例3

吡咯-部花菁衍生物荧光探针在细胞内次氯酸根的检测实验

HeLa细胞用1×10^-5 mol／L的上述实施例1制得的吡咯-部花菁衍生物荧光探针和商用溶酶体定位染料LysoTracker Red在37℃下共同培育30分钟，获得在HeLa细胞的荧光成像图，具体如图6所示，其中：a为绿色通道荧光成像图；b为红色通道荧光成像图；c为绿色通道和红色通道叠加后的图片；d为明场图； e为绿色通道、红色通道和明场叠加后的图片；f为绿色通道和红色通道强度分布叠加图。HeLa细胞中探针绿色通道荧光和LysoTracker Red红色通道荧光基本吻合，重叠系数为0.89。故本发明实施例1制得的吡咯-部花菁衍生物荧光探针可以靶向细胞溶酶体。

HeLa细胞用1×10^-5 mol／L的上述实施例1制得的吡咯-部花菁衍生物荧光探针在37℃下培育30分钟，加入ClO⁻（1×10^-4 mol／L）后再培育30分钟，获得在HeLa细胞的荧光成像图，具体如图7所示，其中其中：a为上述荧光探针绿色通道荧光成像图；b为上述荧光探针明场图；c为上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；d为上述荧光探针+ ClO⁻绿色通道荧光成像图；e为上述荧光探针+ ClO⁻明场下的成像图；f为上述荧光探针ClO⁻明场图和荧光图叠加后的图片。HeLa细胞中加入吡咯-部花菁衍生物荧光探针出现强荧光，而再加入ClO⁻后荧光明显减弱。故本发明实施例1制得的吡咯-部花菁衍生物可用于细胞溶酶体中ClO⁻的定性检测。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。