阅读说明：本技术 酸性当归多糖asp3、酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒以及两者的制备方法和应用 (Acidic angelica polysaccharide ASP3, acidic angelica polysaccharide-adriamycin copolymer nanoparticles, and preparation methods and applications of acidic angelica polysaccharide ASP3 and acidic angel) 是由 陈美婉 胡杰 于 2018-08-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及纳米药物领域,提供了一种酸性当归多糖ASP3、酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒以及两者的制备方法和应用。该酸性当归多糖ASP3的提取方法,经DEAE-cellulose离子柱、Sephadex层析柱柱层析分离、纯化得到中性多糖ASP0、酸性多糖ASP1和酸性多糖ASP3,利用酸性当归多糖作为载体,赋予纳米载药系统优良的稳定性,提高了肝癌靶向性。本发明将天然当归多糖作为载体,阿霉素通过pH敏感的腙键连接到当归多糖上,实现对阿霉素的药物递送,以期阿霉素在弱酸性的肿瘤环境中快速释放,增强药效。不仅保证了纳米载药系统在体内稳定、安全地将药物靶向递送到病灶部位,实现了对肝癌的有效治疗。(The invention relates to the field of nano-drugs, and provides acidic angelica polysaccharide ASP3, acidic angelica polysaccharide-adriamycin copolymer nanoparticles, and preparation methods and applications of the acidic angelica polysaccharide ASP3 and the acidic angelica polysaccharide-adriamycin copolymer nanoparticles. The extraction method of the acidic angelica polysaccharide ASP3 comprises the steps of carrying out column chromatography separation and purification by a DEAE-cellulose ion column and a Sephadex chromatographic column to obtain neutral polysaccharide ASP0, acidic polysaccharide ASP1 and acidic polysaccharide ASP3, and the acidic angelica polysaccharide is used as a carrier to endow a nano drug-loaded system with excellent stability and improve liver cancer targeting property. According to the invention, the natural angelica polysaccharide is used as a carrier, and the adriamycin is connected to the angelica polysaccharide through a pH-sensitive hydrazone bond, so that the adriamycin drug delivery is realized, the adriamycin is rapidly released in a weakly acidic tumor environment, and the drug effect is enhanced. Not only ensures that the nano drug-carrying system stably and safely delivers the drug to the focus part in vivo, but also realizes the effective treatment of the liver cancer.)

酸性当归多糖ASP3、酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒以及 两者的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纳米药物领域，尤其涉及一种酸性当归多糖ASP3、酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒以及两者的制备方法和应用。

背景技术

当归是伞型科植物当归(angelica sinensis diel)的干燥根，为甘肃的道地药材之一。当归味甘、辛、性温，为著名常用中药，有补血活血、调经止痛、润肠通便之效，用于血虚萎黄，眩晕心悸，***，经闭痛经，肠燥便秘等病症。随着对当归越来越深入的研究和新技术的应用，已经分离得到了多种化学活性成分：藁本内酯、阿魏酸、当归多糖、微量元素、维生素、氨基酸、查耳酮、倍半萜烯、炔类化合物。近年来，越来越多的研究发现当归多糖(angelica sinensis polysaccharides，ASP)具有良好的药用疗效，其免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、抗凝血等生物活性已受到医药界的广泛重视和关注。

近年来，纳米载药系统在恶性肿瘤的治疗方面取得了长足的进步。目前应用于临床的紫杉醇-脂质体、紫杉醇-白蛋白纳米粒子、阿霉素-脂质体、G-CSF-聚乙二醇纳米粒子以及氟尿嘧啶-聚乳酸纳米粒子等纳米载药系统可在一定程度上提高药物疗效，减轻毒副作用。但是，目前这些纳米载药系统所用的载体仅限于脂质、高分子材料如聚乳酸、聚乙二醇或白蛋白等，如何开发新的药物载体用于纳米药物递送成为迫切需要。

发明内容

本发明的目的，例如包括提供一种酸性当归多糖ASP3的提取方法，通过该方法能够获得较高纯度的酸性当归多糖ASP3。

本发明的目的，还包括提供一种酸性当归多糖ASP3，其纯度高，具有良好的水溶性、生物相容性及抗肝癌活性。

本发明的目的，还包括提供一种酸性当归多糖ASP3在制备治疗肝癌的药物中作为载体的应用，利用酸性当归多糖作为载体，赋予纳米载药系统优良的稳定性，提高了肝癌靶向性。

本发明的目的，还包括提供一种酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒，其稳定性佳，肝癌靶向性强。

本发明的目的，还包括提供一种酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒的制备方法，该制备方法简单，获得的酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒，具有较强的稳定性和肝癌靶向性。

本发明的目的，还包括提供一种酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒在制备治疗肝癌药物中的应用。

为实现上述至少一个目的，本发明采用如下技术方案：

一种酸性当归多糖ASP3的提取方法，其包括：

分离：将当归多糖经过DEAE-cellulose柱层析进行分离，依次用蒸馏水、浓度为0.05-0.15mol/L和0.25-0.35mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集第一洗脱液，用苯酚-硫酸法检测第一洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，即得中性多糖ASP0、酸性多糖ASP1和酸性多糖ASP3；以及

纯化：取经分离获得的酸性多糖ASP3，溶于蒸馏水中，用滤膜过滤后，所得滤液经Sephadex柱层析进行提纯分离，用蒸馏水洗脱，收集第二洗脱液，即得酸性当归多糖ASP3；

优选地，在收集第二洗脱液后，还包括二次纯化：用苯酚-硫酸法检测第二洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，即得酸性当归多糖ASP3。

一种酸性当归多糖ASP3，其是由上述酸性当归多糖ASP3的提取方法提取获得，其重均分子量为90-100kDa；优选地，酸性当归多糖ASP3为果胶多糖，酸性当归多糖ASP3的主链为→4)-α-D-GalpA-(1→2)-α-L-Rhap-(1→，侧链为连接至Rha上的α-T-Araf/α-1,5-Araf和β-1,4Galp。

上述酸性当归多糖ASP3在制备治疗肝癌的药物中作为载体的应用。

一种酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒，其是将上述酸性当归多糖ASP3和阿霉素通过酸敏感的腙键连接起来制备得到。

一种酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒的制备方法，包括以下步骤：将上述酸性当归多糖ASP3与水合肼反应，制备ASP3-酰肼化物；将ASP3-酰肼化物与脱盐酸后的盐酸阿霉素反应，制备酸性当归多糖-阿霉素；将酸性当归多糖-阿霉素透析、过微孔滤膜，得到酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒。

上述酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒在制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明实施例提供的有益效果例如包括：

本发明提供的酸性当归多糖ASP3的提取方法，经DEAE-cellulose 52离子柱、Sephadex G-50层析柱柱层析分离、纯化得到中性多糖ASP0、酸性多糖ASP1和酸性多糖ASP3，并且对其中三个组分多糖的理化性质、分子量、单糖组成等进行了系统的分析鉴定，为将来在食品、保健品、医药等领域应用奠定了坚实的基础；利用酸性当归多糖作为载体，赋予纳米载药系统优良的稳定性，提高了肝癌靶向性。本发明将天然当归多糖作为载体，阿霉素通过pH敏感的腙键连接到当归多糖上，实现对阿霉素的药物递送，以期阿霉素在弱酸性的肿瘤环境中快速释放，增强药效。不仅保证了纳米载药系统在体内稳定、安全地将药物靶向递送到病灶部位，实现了对肝癌的有效治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1：实施例1中粗多糖在DEAE-cellulose 52柱上的洗脱曲线。分别用dd H₂O、0.1M NaCl和0.3M NaCl作为流动相，硫酸苯酚法检测其中多糖含量；

图2a、图2b和图2c：实施例1中ASP0(a)，ASP1(b)和ASP3(c)在Sephadex G-50柱上的洗脱曲线。dd H₂O作为流动相，硫酸苯酚法检测其中多糖含量；

图3：实验例2中PMP柱前衍生化HPLC法分析当归多糖的单糖组成。a.各单糖标准品混合曲线；b.ASP0，c.ASP1，d.ASP3。Man甘露糖，Rha鼠李糖，GlcA葡萄糖醛酸，GalA半乳糖醛酸，Glc葡萄糖，Gal半乳糖，Ara半乳糖；

图4a、图4b、图4c、图4d和图4e：实验例3中ASP3的HNMR(a)、CNMR(b)、COSY(c)、HSQC(d)和HMBC(e)结构分析；

图5a、图5b、图5c和图5d：实验例4中当归多糖各组分ASP0，ASP1和ASP3对肝癌细胞HepG2(a)、SMMC7721(b)和Bel7402(c)细胞以及正常肝细胞L02(d)的细胞毒性；

图6：实施例4中酸性当归多糖-阿霉素共聚物(ASP-DOX)的合成表征；

图7：实施例4和实验例5中酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒的表征，(a)粒径(b)电位(c)粒径随pH变化图(d)ASP-DOX分别在pH7.4和5.5时的药物释放曲线；

图8a、图8b和图8c：实验例6中酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒抗肝癌活性。肝癌细胞HepG2(a)、SMMC7721(b)和正常肝细胞L02(c)；

图9A、图9B和图9C：实验例7中通过流式细胞仪检测酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒被肝癌细胞HepG2(a)、SMMC7721(b)和正常肝细胞L02(c)摄取考察，DOX：阿霉素；ASP-DOX酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒；Gal半乳糖，去唾液酸糖蛋白受体抑制剂；

图10：实验例7中通过高内涵分析细胞成像系统(IN Cell Analyzer 2000)检测酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒被肝癌细胞HepG2和SMMC7721摄取考察。DOX：阿霉素；ASP-DOX酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种酸性当归多糖ASP3、其制备方法和应用，以及酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒、其制备方法和应用进行具体说明。

本实施例提供了一种酸性当归多糖ASP3以及其制备方法。

其制备方法具体包括以下步骤：

S101、总多糖提取：将当归粗粉用第一无水乙醇煮提2-4次，每次0.5-4h；随后再用蒸馏水煮提2-4次，每次0.5-4h，合并水提取液，浓缩后加第二无水乙醇沉淀得到粗当归多糖。

其中，当归粗粉和第一无水乙醇的质量比为1:9-11；煮提温度为90-100℃。在用蒸馏水进行煮提时，蒸馏水的加入量为当归粗粉的质量的9-11倍。经发明人研究发现，采用当归粗粉9-11倍质量的溶剂进行提取，提取较为完全。合并水提取液之后，进行降压浓缩操作，并于3000-4000r/min的转速下离心5-15min，弃去沉淀，接着在上清液中加入上清液体积比3-5倍的第二无水乙醇；沉淀12-36h，于3000-4000r/min离心5-15min，收集醇沉物，得到粗当归多糖。

本实施例中，先采用第一无水乙醇进行煮提，再采用蒸馏水进行煮提，采用不同溶剂分别进行煮提，相较于单一的乙醇煮提或者蒸馏水煮提，本实施例中总多糖提取率更高。

值得注意的是，得到粗当归多糖不进一步处理直接用于下一步。

在本发明的其他实施例中，如果原料当归不是粉状，还可以包括当归的粉碎步骤：将干燥的当归粉碎，过20-40目筛。

S102、脱蛋白：将粗当归多糖用蒸馏水溶解后，再脱蛋白得到当归多糖。

脱蛋白的方法有多种，例如包括Sevage法、反复冻融法或等电点沉淀法中的一种或多种合用。本实施例中，优选采用Sevage法脱蛋白，具体方法如下：

将步骤S101中获得的粗当归多糖配制成浓度为2-10mg/mL的粗当归多糖水溶液，并向粗当归多糖水溶液中加入1/5-1/3粗当归多糖水溶液体积的正丁醇-氯仿混合液(正丁醇-氯仿的体积比1:3-4)，剧烈振荡15-25min，于3000-4000r/min离心5-15min，收集上层溶液，按照上述脱蛋白步骤反复操作8次，合并上层溶液，减压浓缩后经透析、冷冻干燥得纯度高的当归多糖。

S103、分离：将当归多糖经过DEAE-cellulose柱层析进行分离，依次用蒸馏水、浓度为0.05-0.15mol/L和0.25-0.35mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集第一洗脱液，用苯酚-硫酸法检测第一洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，即得中性多糖ASP0、酸性多糖ASP1和酸性多糖ASP3。在本发明的其他实施例中，浓度为0.05-0.15mol/L的氯化钠溶液的浓度例如可以为0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14或0.15mol/L中的任一者或者任意两者之间的范围值；0.25-0.35mol/L的氯化钠溶液的浓度例如可以为0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34或0.35mol/L中的任一者或者任意两者之间的范围值。

在将当归多糖进行过柱分离之前，先将当归多糖配制成质量浓度为50-200mg/mL的水溶液，于3000-4000r/min离心5-15min，取上清液。接着将上清液用DEAE-cellulose 52离子柱层析进行初步分离。在本发明的其他实施例中，当归多糖水溶液的质量浓度例如为50、60、80、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190和200mg/mL中的任一者或者任意两者之间的范围值。离心的转速例如可以3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900和4000r/min中的任一者或者任意两者之间的范围值。

本实施例中，依次经过蒸馏水、浓度为0.05-0.15mol/L的氯化钠溶液以及浓度为0.25-0.35mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，中性多糖ASP0、酸性多糖ASP1和酸性多糖ASP3的分离效果更佳。

本实施例中使用的层析柱为DEAE-cellulose 52。

S104、纯化：取经分离获得的所述酸性多糖ASP3，溶于蒸馏水中，用滤膜过滤后，所得滤液经Sephadex柱层析进行提纯分离，用蒸馏水洗脱，收集第二洗脱液，即得酸性当归多糖ASP3；

优选地，在收集第二洗脱液后，还包括二次纯化：用苯酚-硫酸法检测第二洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，即得酸性当归多糖ASP3。

本实施例中使用的层析柱为Sephadex 50。

当然，容易理解的是，如果本实施例中还需要对中性多糖ASP0或酸性多糖ASP1进行纯化，可依照上述纯化步骤进行。

经由上述酸性当归多糖ASP3的提取方法提取获得的酸性当归多糖ASP3可以在制备治疗肝癌的药物中作为载体。本发明提供的酸性当归多糖ASP3的提取方法，经DEAE-cellulose 52离子柱、Sephadex G-50层析柱柱层析分离、纯化得到中性多糖ASP0和酸性多糖ASP1、ASP3，并且对其中三个组分多糖的理化性质、分子量、单糖组成等进行了系统的分析鉴定，为将来在食品、保健品、医药等领域应用奠定了坚实的基础；利用酸性当归多糖作为载体，赋予纳米载药系统优良的稳定性，提高了肝癌靶向性。

此外，本发明实施例还提供了一种酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒及其制备方法和应用。

该酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒是将上述的酸性当归多糖ASP3和阿霉素通过酸敏感的腙键连接起来制备得到。具体来说，包括以下步骤：

S201、将上述酸性当归多糖ASP3与水合肼反应，制备ASP3-酰肼化物；

具体地，将酸性当归多糖ASP3溶于水中，室温下搅拌；加入过量EDC.HCl和NHS后，再加入水合肼，继续室温反应，经透析、冷冻干燥得到ASP3-酰肼化物。

更具体地，先加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，室温条件下反应30-40min后，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，继续反应1-3h。同时，将水合肼直接加入当归多糖活化体系中，磁力搅拌反应20-30h。反应结束后，将反应混合物用蒸馏水透析(MWCO，3500)2-3天，冷冻干燥获得ASP3-酰肼化物。

S202、将ASP3-酰肼化物与脱盐酸后的盐酸阿霉素反应，制备酸性当归多糖-阿霉素；

具体地，将ASP3-酰肼化物溶于二甲基亚砜和水的混合溶液中，在氮气保护下加入含有阿霉素的二甲基亚砜溶液，随后加入三乙胺，避光搅拌，得到酸性当归多糖-阿霉素；优选地，每1ml所述含有阿霉素的二甲基亚砜溶液中含有10-30mg阿霉素。

S203、将酸性当归多糖-阿霉素透析、过微孔滤膜，得到酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒。

阿霉素通过pH敏感的腙键连接到当归多糖上，以期阿霉素在弱酸性的肿瘤环境中快速释放，增强药效。

酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明将天然当归多糖作为载体，实现对阿霉素的药物递送，不仅保证了纳米载药系统在体内稳定、安全地将药物靶向递送到病灶部位，实现了对肝癌的有效治疗。

以下结合实施例对本发明的酸性当归多糖ASP3、其制备方法和应用，以及酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒、其制备方法和应用进一步进行阐述。

以下实施例中，DEAE-Cellulose 52，Sephadex G-50来源于上海索莱宝生物科技有限公司；当归购买于甘肃省岷县，经鉴定为伞型科植物当归(angelica sinensis diel)的干燥根。

实施例1

本实施例提供了一种酸性当归多糖ASP3的制备方法以及由该制备方法获得的酸性当归多糖ASP3。该制备方法具体包括以下步骤：

S101、总多糖的提取：取干燥的岷县当归粉碎、过20目筛，加入10倍质量的无水乙醇，于90-100℃煮提三次，每次2h；随后再加入10倍质量的蒸馏水后，用蒸馏水煮提3次，每次2h。合并水提取液，减压浓缩后，于3500r/min离心10min，弃去沉淀；向上清液中加入4倍体积的无水乙醇，沉淀24h，于3500r/min离心10min，收集醇沉物，所得粗当归多糖不进一步处理直接用于下一步；

S102、Sevage法脱蛋白：将步骤S101中干燥所得粗当归多糖配制成浓度为8mg/mL的粗当归多糖水溶液，并向该溶液中加入1/4粗当归多糖水溶液体积的正丁醇-氯仿混合液(正丁醇-氯仿的体积比1:4)，剧烈振荡20min，于3500r/min离心10min，收集上层溶液，按照上述脱蛋白步骤反复操作8次，合并上层溶液，减压浓缩后经透析、冷冻干燥得纯度高的当归多糖；

S103、分离：取脱蛋白处理后的当归多糖，配制成质量浓度为150mg/mL的水溶液，于3500r/min离心10min，取上清液用DEAE-cellulose 52离子柱层析进行初步分离，依次用蒸馏水、浓度为0.1mol/L和0.3mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分(当归多糖在DEAE-cellulose 52柱上的洗脱曲线见图1)，浓缩、透析、冻干，分别得到中性多糖ASP0、酸性多糖ASP1和酸性多糖ASP3；

S104、纯化：称取100mg经DEAE-cellulose 52纯化后的中性多糖ASP0、酸性多糖ASP1和酸性多糖ASP3，溶于10mL蒸馏水中，用滤膜过滤后，所得滤液经Sephadex 50层析柱进行提纯分离，用蒸馏水洗脱，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分[ASP0(a)，ASP1(b)和ASP3(c)在Sephadex G-50柱上的洗脱曲线见图2a、图2b和图2c]，浓缩、透析、冻干，即得中性当归多糖ASP0、酸性当归多糖ASP1和酸性当归多糖ASP3。三个组分进一步通过透析、冷冻干燥、称重，发现ASP3为其中最主要组分(比例约为73.4±5.0％)，而ASP0和ASP1分别占10.8±0.7％和15.7±4.6％。

实施例2

本实施例提供了一种酸性当归多糖ASP3的制备方法以及由该制备方法获得的酸性当归多糖ASP3。该制备方法具体包括以下步骤：

S101、总多糖的提取：取干燥的岷县当归粉碎、过20目筛，加入11倍质量的无水乙醇，于90-100℃煮提2次，每次4h；随后再加入11倍质量的蒸馏水后，用蒸馏水煮提2次，每次4h。合并水提取液，减压浓缩后，于4000r/min离心5min，弃去沉淀；向上清液中加入4倍体积的无水乙醇，沉淀30h，于4000r/min离心5min，收集醇沉物，所得粗当归多糖不进一步处理直接用于下一步；

S102、Sevage法脱蛋白：将步骤S101中干燥所得粗当归多糖配制成浓度为8mg/mL的粗当归多糖水溶液，并向该溶液中加入1/5粗当归多糖水溶液体积的正丁醇-氯仿混合液(正丁醇-氯仿的体积比1:5)，剧烈振荡25min，于4000r/min离心5min，收集上层溶液，按照上述脱蛋白步骤反复操作8次，合并上层溶液，减压浓缩后经透析、冷冻干燥得纯度高的当归多糖；

S103、分离：取脱蛋白处理后的当归多糖，配制成质量浓度为240mg/mL的水溶液，于4000r/min离心5min，取上清液用DEAE-cellulose 52离子柱层析进行初步分离，依次用蒸馏水、浓度为0.15mol/L和0.35mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，分别得到中性多糖ASP0、酸性多糖ASP1和酸性多糖ASP3；

S104、纯化：称取100mg经DEAE-cellulose 52纯化后的中性多糖ASP0、酸性多糖ASP1和酸性多糖ASP3，溶于10mL蒸馏水中，用滤膜过滤后，所得滤液经Sephadex 50层析柱进行提纯分离，用蒸馏水洗脱，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，即得中性当归多糖ASP0、酸性当归多糖ASP1和酸性当归多糖ASP3。

实施例3

本实施例提供了一种酸性当归多糖ASP3的制备方法以及由该制备方法获得的酸性当归多糖ASP3。该制备方法具体包括以下步骤：

S101、分离：取常规方法提取获得的当归多糖，配制成质量浓度为50mg/mL的水溶液，于3000r/min离心15min，取上清液用DEAE-cellulose 52离子柱层析进行初步分离，依次用蒸馏水、浓度为0.05mol/L和0.25mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，分别得到中性多糖ASP0、酸性多糖ASP1和酸性多糖ASP3；

S102、纯化：称取100mg经DEAE-cellulose 52纯化后的中性多糖ASP0、酸性多糖ASP1和酸性多糖ASP3，溶于10mL蒸馏水中，用滤膜过滤后，所得滤液经Sephadex 50层析柱进行提纯分离，用蒸馏水洗脱，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，即得中性当归多糖ASP0、酸性当归多糖ASP1和酸性当归多糖ASP3。

接下来，本实施例中对当归多糖的各个组分进行了详细的分析和实验，具体实验例如下：

实验例1：当归多糖各组分的凝胶渗透色谱(GPC)分析

精确称取待分析当归多糖各组分ASP0，ASP1和ASP3适量，用0.1mol/LNaNO₃溶液(含质量分数为0.2‰NaN₃)定容到7.0mg/mL，在4℃冰箱放置12h后取出，恢复至室温后用0.22μm滤膜过滤，即得当归多糖各组分GPC分析的供试品溶液。

当归多糖各组分GPC分析的色谱条件为：色谱柱为ShodexSUGARKS-805色谱柱和KS-803色谱柱串联使用(KS-805色谱柱在前，KS-803色谱柱在后)，0.1mol/LNaNO₃溶液(含质量分数为0.2‰NaN₃)以0.8ml/min的速度洗脱，色谱柱和RID温度分别为60℃和50℃，进样量：50μL。在此条件下进样分析当归多糖各组分的GPC色谱指纹图谱并计算色谱图中各峰的相对保留时间和各峰的相对峰面积。

结果如表1所示，ASP0，ASP1和ASP3的重均分子量分别为15169,17179和96258Da。

表1.ASP0、ASP1和ASP3的分子量测定(GPC)

实验例2：当归多糖各组分单糖组成分析

1)当归多糖各组分样品完全酸水解：分别精密称取当归多糖各组分(ASP0，ASP1和ASP3)10mg置于安瓿瓶中，加入4mL三氟乙酸溶液(终浓度2mol/L)，充分混匀后充入N₂，置于110℃烘箱中水解3h，取出冷却至室温，将水解产物减压蒸干，然后向其中加入同体积的甲醇，再次减压蒸干，重复3次后用2mL超纯水溶解。

2)当归多糖样品的PMP衍生化：分别称取各组分当归多糖水解液100μL，至于2mL离心管中，依次加入200μL 0.3mol/L NaOH溶液和200μL 0.5mol/L PMP甲醇溶液，涡旋混匀，于70℃水浴反应90min。冷却至室温后，加入200μL0.3mol/L HCl中和，再加入等体积氯仿萃取，振荡、静置，弃去有机相，重复操作3次。上层水相经0.45μM微孔滤膜过滤后用于HPLC分析。

3)单糖标准品的PMP衍生化：分别称取单糖标准溶液(甘露糖Man、鼠李糖Rha、葡萄糖醛酸(Glucuronic acid,GlcA)、半乳糖醛酸(Galacturonic acid,GalA)、葡萄糖Glc、半乳糖Gal、***糖Ara，单糖浓度5mg/ml)100μL，按2)所述的当归多糖水解产物的PMP衍生化方法进行衍生化。

4)混合单糖的PMP衍生化：取上述各单糖标准溶液(5mg/ml)100μL，依次加入1400μL 0.3mol/L NaOH溶液和1400μL 0.5mol/L PMP甲醇溶液，涡旋混匀，于70℃水浴反应90min。冷却至室温后，加入1400μL 0.3mol/L HCl中和，再加入等体积氯仿萃取，振荡、静置，弃去有机相，重复操作3次。上层水相经0.45μM微孔滤膜过滤后用于HPLC分析。

5)HPLC分析条件为：流动相为A：B＝63:17(w/w)，其中A相为磷酸盐缓冲溶液(0.1Mol/L,pH 6.7)，B相为乙腈。色谱柱为reverse phase C18column(250×4.6mm)。柱温：25℃；检测波长：245nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。

结果如图3所示，ASP0，ASP1和ASP3具有相似的单糖组成，其中ASP0主要由甘露糖、葡糖糖、半乳糖和***糖组成，为中性糖；ASP1由鼠李糖，半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖和***糖组成，为酸性多糖；ASP3则由鼠李糖，半乳糖醛酸，半乳糖和***糖组成。各种糖的组成比例见表2。

表2.ASP0，ASP1和ASP3的单糖组成分析

实验例3：酸性当归多糖ASP3的结构分析：

称取酸性当归多糖ASP3约40mg，溶解于600μL的氧化氘(D₂O)中，经Bruker 600MHz核磁共振仪对其HNMR，CNMR，COSY，HSQC和HMBC进行表征。

结果如图4a-图4e和表3所示，结合相关文献，我们推断酸性当归多糖ASP3为一类果胶多糖，酸性当归多糖ASP3的主链可能为→4)-α-D-GalpA-(1→2)-α-L-Rhap-(1→，而α-T-Araf/α-1,5-Araf和β-1,4Galp作为侧链连接到Rha上。

表3.ASP3的1HNMR和13CNMR的化学位移值

实验例4：当归多糖各组分抑制肝癌活性

MTT(四氮唑盐法)实验：采用人肝癌细胞HepG2、SMMC7721和Bel7402细胞以及人正常肝细胞株L02(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)培养于含有10％胎牛血清(Gibco公司)、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM培养基(Gibco公司)中。细胞在37℃含5％CO₂培养箱中培养。将处于对数生长期的HepG2，SMMC7721、Bel7402以及L02细胞5×103个接种于96孔板中，培养箱孵育24h后弃上清，分别加入含有各组分当归多糖(实施例1制备)的培养基溶液100μL，使终浓度为31.25、62.5、125、250、500和1000μg/mL，每个浓度均为三个复孔，另设空白对照孔。细胞在培养箱培养24和48h后，用MTT法检测。

结果如图5a-图5d所示，图5a-图5d当归多糖各组分ASP0，ASP1和ASP3对肝癌细胞HepG2(a)、SMMC7721(b)和Bel7402(c)细胞以及正常肝细胞L02(d)的细胞毒性。其中，竖条纹的表示的为ASP0(即每个坐标系中的第一组数据)，横条纹的表示的为ASP1(即每个坐标系中的第二组数据)，斜条纹的表示的为ASP3(即每个坐标系中的第三组数据)。

酸性多糖ASP3可剂量和时间依赖性的抑制HepG2，SMMC7721和Bel7402三种人肝癌细胞的生长，而ASP0和ASP1则显示出一定的促进肿瘤细胞生长的作用。此外，对于人正常肝细胞株L02，ASP0，ASP1和ASP3则均未显示出明显的毒性，显示出很好的安全性。ASP3在此显示出较好的抗肝癌活性，经发明人研究发现ASP3可作为抗肝癌药物传递的载体。

实施例4

本实施例提供了一种酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒及其制备方法，其制备方法具体包括以下步骤：

将100mg上述酸性当归多糖ASP3溶于10mL蒸馏水中，边磁力搅拌边加入256mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，室温条件下反应30min后，加入146mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，继续反应2h。同时，将3mL水合肼直接加入当归多糖活化体系中，磁力搅拌反应24h。反应结束后，将反应混合物用蒸馏水透析(MWCO，3500)2天，冷冻干燥获得酸性当归多糖-酰肼化物。

取上述得到的ASP3-酰肼化物100mg，溶于5mL二甲基亚砜和水的混合溶液(1:1)中，氮气保护下加入1mL含有10-30mg阿霉素的二甲基亚砜溶液，并随后加入50μL三乙胺，避光搅拌24小时。反应结束后，将反应混合物用蒸馏水透析(MWCO，3500)2天，过0.45μm微孔滤膜，得酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒。合成产物的HNMR表征如图6所示。

酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒的制备工艺如表4所示。10mg的ASP-DOX(不同质量比，10:0.5，10:1和10:2反应得到酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒)溶于5mL的ddH₂O，超声5min(功率100W，超声3s，停4s)，后透析数小时。最后过0.45μm微孔滤膜，得到ASP-DOX纳米粒。动态光散射仪(DLS)测其粒径，当ASP-NH₂/DOX质量比为10:1时，纳米粒具有较好的粒径和电位(分别为199.4±8.5nm和-21.3±2.32)，且其Pdi较小，故选择该比例制备ASP-DOX纳米粒。透射电镜TEM显示该比例的ASP-DOX聚合物纳米粒具有较好的外貌形态(图7中的a和b)。

表4.ASP3-酰肼化合物/阿霉素的质量比对于形成ASP-DOX共聚物纳米粒粒径、Pdi、电位等的影响

鉴于肿瘤微环境弱酸性的特性，本研究中，阿霉素通过pH敏感的腙键连接到当归多糖上，以期阿霉素在弱酸性的肿瘤环境中快速释放，增强药效。我们通过体外实验模拟了不同的pH环境。由图7中的c可见，在酸性条件下，该纳米粒粒径增大，这有可能是纳米粒聚集引起的；此外，还发现纳米粒裂分为多峰，这可能是纳米粒在酸性条件下发生破裂引起的。

接下来，本实施例中对酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒进行了详细的分析和实验，具体实验例如下：

实验例5：酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒的体外释放行为

采用透析法考察实施例4中制得的酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒体外释药行为。精密量取2mL的酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒(浓度200μg/mL)，置于透析袋(截留分子量：3500)内，浸入30mL含1％吐温80(w/v)，pH分别为7.4和5.5的PBS中，于37℃，100r/min振摇，分别于0.5、1、2、4、6、8、12、18、24、36h和48h取样1mL，同时补充相同pH值、体积和温度的新鲜介质。样品经0.45μm滤膜过滤，弃去初滤液，UV法测定阿霉素含量，并计算累积释药百分数，结果见图7中的d。酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒在pH为7.4和5.5的释放介质中，12h的累积释药量分别为45.5％和70.2％，表明酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒在生理环境(pH 7.4)较稳定，进入肿瘤细胞内涵体的酸性环境(pH 5.0-6.0)能够更快地释放药物。

实验例6：酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒体外抑制肝癌活性

将人肝癌细胞HepG2(a)、SMMC7721(b)和正常肝细胞L02(c)接种在96孔板含有10％胎牛血清(Gibco公司)、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM培养基(Gibco公司)中。将细胞在37℃下在含有5％CO₂的潮湿气氛中孵育。接种后24小时用新鲜培养基替换培养基。将ASP3、阿霉素原药、ASP-DOX解于PBS中并使用细胞培养基稀释(pH7.4和6.5的ASP-DOX组是指将ASP-DOX分别用pH7.4和pH6.5的培养基稀释)。对于每个孔，加入100μL具有不同指定药物浓度的细胞培养基。通过加入100μL培养基产生阴性对照。细胞在培养箱培养24和48h后，用MTT法检测。

结果如图8a-图8c所示，ASP-DOX对HepG2细胞的细胞毒性显著优于阿霉素原药，而ASP-DOX对于SMMC7721和L02细胞的毒性与原药大致相当。此外，ASP-DOX在pH 6.5条件下的抗增殖活性优于pH 7.4组，这可能与酸性条件下，阿霉素更快、更多的从ASP-DOX中释放出来有关。值得注意的是，未载药的空白载体ASP3在相应阿霉素浓度下(ASP3最高浓度约30μg/mL)并未显示出显著的抗肿瘤活性，暗示其生物相容性较好。

实验例7：酸性当归多糖-阿霉素共聚物纳米粒体外细胞摄取

将肝癌细胞HepG2(a)、SMMC7721(b)和正常肝细胞L02(c)细胞接种到12孔板中，24小时后，三种细胞分别孵育DOX、ASP-DOX和ASP-DOX+Gal1,3,6小时。然后，使用胰蛋白酶分离细胞，并用PBS洗涤三次。使用BD Beckman Coulter流式细胞仪分析细胞的阿霉素荧光强度。如图9A-B中的对应的a-f显示，ASP-DOX被HepG2、SMMC7721肝癌细胞以及L02正常肝细胞摄取的能力显著优于原药DOX，尤其在3h和6h差异最为显著。进一步研究表明，在HepG2和SMMC7721细胞中，阿霉素原药在12h进入细胞就几乎达到最大值，而ASP-DOX能更多的进入细胞，甚至在更久的时间如24h都未达到(图9C中的g，h)。这表明，ASP-DOX能促进药物在肿瘤细胞内的累积。此外，通过Incell高内涵细胞成像仪对DOX、ASP-DOX被HepG2和SMMC7721细胞的摄取、分布进行研究，发现ASP-DOX被两种肝癌细胞摄取的能力均强于阿霉素原药(图10)。

为了验证ASP-DOX可靶向肝癌细胞表面的ASGPR受体，我们首先对三种肝癌细胞HepG2，SMMC7721和Bel7402及正常肝细胞L02细胞表面的ASGPR受体的表达进行了研究。如图9C中的i所示，HepG2细胞表面的ASGPR受体过表达，而SMMC7721和Bel7402细胞低表达该受体。通过加入竞争性抑制剂(小分子半乳糖Gal，80mM)，发现ASP-DOX被HepG2细胞的摄取大大下降，尤其在6h差异最为显著。而在其他ASGPR低表达或不表达的SMMC7721和L02细胞中却未检测到ASP-DOX的摄取降低。通过该竞争性实验表明，该ASP-DOX共聚物纳米粒可经ASGPR介导靶向肝癌细胞。这或许是ASP-DOX抗肿瘤活性优于原药在HepG2细胞中更为显著的原因。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。