阅读说明：本技术 一种海藻功能油及其应用 (Seaweed functional oil and application thereof ) 是由 张翼 杨文聪 张嫄嫄 千忠吉 李亚娟 刘亚月 杨静明 聂影影 宋采 梁金月 马小 于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种海藻功能油及其应用。本发明首先提供了一种海藻功能油,所述海藻功能油是海藻羊栖菜粗提物先由石油醚和乙酸乙酯的混合溶液洗脱,再由石油醚、氯仿和甲醇的混合溶液洗脱后,收集满足薄层层析比移值为0.1～0.4且乙酰胆碱酯酶生物自显影为白色斑点的活性组分,即得到所述海藻功能油。该海藻功能油具有显著的抑制乙酰胆碱酯酶的活性,清除DPPH自由基的活性,抑制细胞内炎症因子诱导的NO生成,清除细胞内的ROS水平的功能,且对正常细胞无任何毒副作用；另外,该制备方法产量高,材料来源天然,所得海藻功能油无毒性,不会引起不良反应,在制备治疗阿尔茨海默氏症的药物方面具有很好的应用前景。(The invention discloses seaweed functional oil and application thereof. The invention firstly provides seaweed functional oil, which is obtained by eluting a crude extract of sargassum fusiforme by a mixed solution of petroleum ether and ethyl acetate, eluting by a mixed solution of petroleum ether, chloroform and methanol, and collecting active components which meet the requirements that a thin-layer chromatography specific transfer value is 0.1-0.4 and acetylcholinesterase is subjected to biological self-development to form white spots. The seaweed functional oil has the functions of obviously inhibiting the activity of acetylcholinesterase, eliminating the activity of DPPH free radicals, inhibiting the generation of NO induced by inflammatory factors in cells and eliminating the level of ROS in the cells, and has NO toxic or side effect on normal cells; in addition, the preparation method has high yield and natural material sources, and the obtained seaweed functional oil has no toxicity, does not cause adverse reactions and has good application prospect in the aspect of preparing medicines for treating Alzheimer's disease.)

一种海藻功能油及其应用

技术领域

本发明属于精油提取技术领域。更具体地，涉及一种海藻功能油及其应用。

背景技术

阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s disease,AD)，俗称老年痴呆，是21世纪危害人类健康的重大疾病之一，是一种伴有认知、行为和功能失常的神经退行性疾病，多发于65岁以上的老人。现有的研究表明，AD与大脑中的氧化应激、神经炎症引发的神经退行和胆碱能神经元损伤等有密切联系。据2016年世界AD报告指出，当年罹患AD的人数高达4700万，且随着人口老龄化进程的加快，我国AD患者数量以全球最快的速度增加，有关专家预言，至2025年全世界将有2200万人口罹患AD。同时，AD患者每年用于医药和保健的费用高达万亿，对患者的身心健康和国家的经济发展均造成了很大的影响。

目前，用于治疗AD的药物包括他克林、多耐派齐、卡巴拉汀、加兰他敏、盐酸美金刚胺等乙酰胆碱酯酶抑制剂、疫苗。但是，以上药物或疫苗价格昂贵，毒副作用大，治疗AD的作用有限，只能改善AD症状并不能阻止病情的进展，而且还会引起诸多不良反应。

海洋生物因其特殊的生活环境而在生长和代谢过程中产生和积累了大量结构新、活性强的次生代谢产物,是研究发现新型海洋药物的重要资源。研究显示(张翼等，2005年，海藻组分抑制乙酰胆碱酯酶活性研究)，有些种类的海藻组分具有抑制乙酰胆碱酯酶的活性；但是不同藻类有效成分含量差异显著，目前相关研究较少，不同提取工艺对不同藻类相关活性成分的提取结果显示也具有很大的差异。因此，筛选出活性好、产量高、无毒性、天然来源的治疗阿尔茨海默氏症的药物，对于AD的预防和治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抑制乙酰胆碱酯酶及抗氧化、抗炎作用的海藻功能油及其制备方法，该制备方法产量高，材料来源天然，所得海藻功能油无毒性，不会引起不良反应，在阿尔茨海默氏症治疗方面具有很好的应用潜力。

本发明的目的是提供一种海藻功能油。

本发明另一目的是提供所述海藻功能油在制备治疗阿尔茨海默氏症的药物中的应用。

本发明又一目的是提供所述海藻功能油在制备预防和/或辅助改善阿尔茨海默氏症的产品中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种海藻功能油，所述海藻功能油是海藻羊栖菜粗提物先由石油醚和乙酸乙酯的混合溶液洗脱，再由石油醚、氯仿和甲醇的混合溶液洗脱后，收集满足薄层层析比移值为0.1～0.4且乙酰胆碱酯酶生物自显影为白色斑点的活性组分，即得到所述海藻功能油。

所述海藻功能油的主要成分为十四烷酸、(Z)-9-十六碳烯酸、十六烷酸、植醇、花生四烯酸和11,14,17-二十碳三烯酸，其结构分别如下所示：

发明人在利用薄层层析-生物自显影法和96孔板法进行活性追踪，有机溶剂提取与柱层析法纯化海藻羊栖菜的活性组分时，得到所述海藻功能油；经过分析和实验验证，该海藻功能油具有显著的抑制乙酰胆碱酯酶活性、清除DPPH自由基活性，抑制脑源BV-2小胶质细胞内炎症因子诱导的NO生成，清除脑源BV-2小胶质细胞内的ROS水平的功能，且对正常细胞无任何毒副作用；因此，该海藻功能油在制备治疗阿尔茨海默氏症的药物，以及在制备预防和/或辅助改善阿尔茨海默氏症的产品中具有很好的应用前景。

优选地，所述的海藻功能油，其制备方法包括以下步骤：

S1.将海藻羊栖菜烘干、粉碎后，加入甲醇和氯仿的混合溶液提取，减压浓缩，得到海藻羊栖菜粗提物；

S2.将步骤S1得到的海藻羊栖菜粗提物经减压柱分别用体积比为8：2和7：3的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液洗脱后，得到粗组分1和粗组分2；

S3.将步骤S2得到的粗组分1和粗组分2混合后，经硅胶柱用体积比为9：1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液洗脱，再经凝胶柱用体积比为2：1：1的石油醚、氯仿和甲醇的混合溶液洗脱，即得到所述海藻功能油。

优选地，步骤S2所述减压柱的填料为100～200目的硅胶。

优选地，步骤S3所述硅胶柱的填料为200～300目的硅胶。

优选地，步骤S3所述凝胶柱的填料为葡聚糖凝胶。

优选地，步骤S1所述甲醇和氯仿的体积比为1：1～3。

更优选地，步骤S1所述甲醇和氯仿的体积比为1：2。

另外，所述海藻功能油在制备治疗阿尔茨海默氏症的药物中的应用，以及在制备预防和/或辅助改善阿尔茨海默氏症的产品中的应用，均应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述产品为药物、食品或保健品。

优选地，所述应用为在制备具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物、制备具有清除DPPH自由基活性的药物和制备抑制细胞内NO生成和ROS水平的药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种海藻功能油及其应用。经过实验证实，本发明提供的海藻功能油具有显著的抑制乙酰胆碱酯酶活性、抗氧化活性和抗炎活性，具体表现为抑制乙酰胆碱酯酶的活性，清除DPPH自由基的活性，抑制细胞内炎症因子诱导的NO生成，清除细胞内的ROS水平的功能，且对正常细胞无任何毒副作用，可作为活性高、产量高、无毒性、天然来源的抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物；

另外，该海藻功能油的制备方法产量高，该海藻功能油以天然的海藻羊栖菜为原料，材料来源天然、广泛，所得海藻功能油无毒性，不会引起不良反应，且制备海藻功能油的方法简便，成本低；因此，本发明提供的海藻功能油在制备治疗阿尔茨海默氏症的药物，以及在制备预防和/或辅助改善阿尔茨海默氏症的产品中具有很好的应用前景。

附图说明

图1是本发明海藻功能油的主要成分测试结果图；其中，A图是海藻功能油未甲酯化的气相色谱图；B图是海藻功能油甲酯化的气相色谱图。

图2是本发明海藻功能油抑制乙酰胆碱酯酶活性测试结果图。

图3是本发明海藻功能油的抗氧化性能测试结果图。

图4是本发明海藻功能油对细胞的毒性测试结果图。

图5是本发明海藻功能油抑制细胞内NO生成的活性测试结果图。

图6是本发明海藻功能油对LPS诱导的BV-2细胞内ROS的抑制作用结果图。

图7是本发明海藻功能油抑制细胞内ROS水平的活性测试结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1海藻功能油的制备

一、实验方法

1、一种海藻功能油，其制备方法包括以下步骤：

S1.将购买或采集的海藻羊栖菜除去杂质，置于40℃烘箱干燥1h或晒干后再用40℃烘箱干燥1h烘干，用粉碎机粉碎，加入其2倍体积的甲醇：氯仿＝1：2浸泡过夜，抽滤、减压浓缩，重复3次，得到海藻羊栖菜粗提物；

S2.将步骤S1所得海藻羊栖菜粗提物经减压柱(减压柱的填料为100～200目的硅胶)，分别用以下试剂洗脱分离：

(1)用石油醚：乙酸乙酯(体积比)＝8：2、7：3、1：1、3：7洗脱分离，得到4个粗组分Fr1～Fr4；

(2)用纯乙酸乙酯洗脱分离，得到1个粗组分Fr5；

(3)用氯仿：甲醇(体积比)＝5：1、2：1洗脱分离，得到2个粗组分Fr6～Fr7；

(4)用纯甲醇洗脱分离，得到1个粗组分Fr8；

共分离得到8个粗组分Fr1～Fr8，利用乙酰胆碱酯酶抑制活性生物自显影显色，得到显白色斑点的粗组分Fr1和Fr2；

S3.将粗组分Fr1和Fr2合并后经硅胶柱(硅胶柱的填料为200～300目的硅胶)，分别通过石油醚：乙酸乙酯(体积比)＝98：2(7个柱体积)、95：5(5个柱体积)、90：10(5个柱体积)、85：15(5个柱体积)、80：20(5个柱体积)和纯乙酸乙酯(5个柱体积)洗脱浓缩，得到组分Fr’1-1～Fr’1-32，利用乙酰胆碱酯酶抑制活性生物自显影显色，得到显白色斑点的组分Fr’1-17；

S4.将组分Fr’1-17经凝胶柱(凝胶柱的填料为葡聚糖凝胶)，通过体积比为石油醚：氯仿：甲醇＝2：1：1的混合溶液等度洗脱，流速为0.5mL/min，经TLC分析，将同样的组分合并，得到组分Fr’1-17-1～Fr’1-17-6，将组分Fr’1-17-1～Fr’1-17-6在薄层层析板(Merck公司生产的Silica gel 60F254，展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝19：1)上，于254nm紫外线照射下无紫外吸收，硫酸-茴香醛显色为紫色，薄层层析比移值为0.1～0.4，在薄层层析板上喷含有乙酰胆碱酯酶、底物硫代乙酰胆碱及5,5-二硫代二硝基苯甲酸的生物自显影显色液，得到显白色斑点的组分Fr’1-17-3，即为海藻功能油。

2、然后，对上述得到的海藻功能油的主要成分进行测定，将海藻功能油样品溶于正己烷(1mg/mL)，柱温箱80℃，进样口温度280℃，分流比为5，载气为He，升温程序如下：0～2min，80℃；2～6min，80℃～120℃；6～11min，120℃；11～16min，120℃～180℃；16～22min，180℃；22～32min，180℃～280℃；32～60min，280℃；离子源温度为250℃，接口温度为280℃，m/z范围为50～500；测定在气相色谱(GCMS-QP2010 Ultra，柱子型号为：SH-Rxi-5Sil MS，尺寸为30m×0.25mm，膜厚为0.25μm)中的保留时间；使用美国国家标准与技术研究院(NIST)库和中国科学院南海海洋研究所的GC-MS系统库与质谱对比来确定海藻功能油的主要成分。

二、实验结果

本发明海藻功能油的主要成分测试结果如图1所示，可以看出，所述海藻功能油的主要成分为十四烷酸、(Z)-9-十六碳烯酸、十六烷酸、植醇、花生四烯酸和11,14,17-二十碳三烯酸；在气相色谱中的保留时间分别为：

18.50min(十四烷酸，对应图1的A图中保留时间18.50min的峰1)，

23.60min(十六烷酸，对应图1的A图中保留时间23.60min的峰3)，

22.82min((Z)-9-十六碳烯酸，对应图1的A图中保留时间22.82min的峰2)，

29.03min(花生四烯酸，对应图1的A图中保留时间29.03min的峰5)(未甲酯化)，

17.83min(十四烷酸，对应图1的B图甲酯化产物中保留时间17.83min的峰2)，

22.14min(十六烷酸，对应图1的B图甲酯化产物中保留时间22.14min的峰4)，

21.63min((Z)-9-十六碳烯酸，对应图1的B图甲酯化产物中保留时间21.63min的峰3)，

26.32min(11,14,17-二十碳三烯酸，对应图1的B图甲酯化处理后样品中保留时间26.32min的峰7)，

26.51min(植醇，对应图1的B图甲酯化处理后样品中保留时间26.51min的峰8)，

28.49min(花生四烯酸，图1的B图甲酯化产物中保留时间28.49min的峰10)(甲酯化)。

应用例1海藻功能油抑制乙酰胆碱酯酶活性测试

利用本发明实施例1制备得到的海藻功能油作为样品，采用抗乙酰胆碱酯酶药物筛选常用的电鳗乙酰胆碱酯酶(AChE)，进行海藻功能油的体外抗乙酰胆碱酯酶活性实验，具体的实验方法和实验结果如下：

1、实验方法

用甲醇溶解海藻功能油，在96孔板里倍半稀释后，挥发干甲醇，加入DMSO重溶，海藻功能油的终浓度设置为：1.024mg/mL、0.512mg/mL、0.256mg/mL、0.128mg/mL、0.064mg/mL、0.032mg/mL、0.016mg/mL、0.008mg/mL、0.004mg/mL、0.002mg/mL、0.001mg/mL、0.0005mg/mL，每个浓度两个复孔；

实验共设置4组，分别为样品组(样品+49μL PBS+1μL DMSO+10μL AChE+20μLDTNB，37℃孵育10min，加入20μL ATCh，37℃孵育20min)；

样品空白组(样品+49μL PBS+1μL DMSO+10μL BSA+20μL DTNB，37℃孵育10min，加入20μL ATCh，37℃孵育20min)；

对照组(49μL PBS+1μL DMSO+10μL AChE+20μL DTNB，37℃孵育10min，加入20μLATCh，37℃孵育20min)；

空白组(49μL PBS+1μL DMSO+10μL BSA+20μL DTNB，37℃孵育10min，加入20μLATCh，37℃孵育20min)，酶标仪405nm处测定OD值，根据OD值计算该海藻功能油对乙酰胆碱酯酶的抑制率；

抑制率＝[(OD_对照组-OD_空白组)-(OD_样品组-OD_{样品空白组})]/(OD_对照组-OD_空白组)×100％；

以抑制率-浓度作图，取对数趋势线，计算半抑制浓度IC₅₀。

2、实验结果

本发明海藻功能油抑制乙酰胆碱酯酶活性测试结果如图2所示，可以看出，当海藻功能油的浓度为1.024mg/mL时，对乙酰胆碱酯酶活性的抑制率达到50％以上，表明本发明制备得到的海藻功能油具有抑制乙酰胆碱酯酶的活性。

应用例2海藻功能油的抗氧化性能测试

利用本发明实施例1制备得到的海藻功能油作为样品，采用抗氧化剂筛选常用的DPPH自由基，进行海藻功能油的体外抗氧化活性实验，具体的实验方法和实验结果如下：

1、实验方法

用甲醇溶解海藻功能油，在96孔板里倍半稀释后，挥发干甲醇，加入DMSO重溶，海藻功能油的终浓度设置为：1.024mg/mL、0.512mg/mL、0.256mg/mL、0.128mg/mL、0.064mg/mL、0.032mg/mL、0.016mg/mL、0.008mg/mL、0.004mg/mL、0.002mg/mL、0.001mg/mL、0.0005mg/mL，每个浓度两个复孔；

实验共设置4组，分别为样品组(样品+50μL DMSO+50μL DPPH，暗处放置30min)；样品空白组(样品+50μL DMSO+50μL甲醇，暗处放置30min)；

对照组(50μL DMSO+50μL DPPH，暗处放置30min)；

空白组(50μL DMSO+50μL甲醇，暗处放置30min)；酶标仪517nm处测定OD值，根据OD值计算该海藻功能油对DPPH自由基的清除率；

清除率＝[(OD_对照组-OD_空白组)-(OD_样品组-OD_{样品空白组})]/(OD_对照组-OD_空白组)×100％。

2、实验结果

本发明海藻功能油的抗氧化性能测试结果如图3所示，可以看出，当海藻功能油的浓度为1.024mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为37％以上，表明本发明制备得到的海藻功能油具有抗氧化活性。

应用例3海藻功能油对细胞的毒性测试

细胞毒性是由细胞或化学物质引起的单纯细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理，有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选；因此，细胞毒性测试可以筛选化合物的毒性，利用本发明实施例1制备得到的海藻功能油作为样品，细胞毒性测试具体的实验方法和实验结果如下：

1、实验方法

(1)将BV-2细胞分别制成细胞悬液，向96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，每孔密度为5×10³个/孔，轻拍孔板，使细胞均匀分布于孔板底部，放入二氧化碳培养箱中继续培养；

(2)24h后，将孔板取出，弃去旧的培养基，将海藻功能油样品母液与无血清培养基混匀，使海藻功能油的终浓度为5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL，然后加到相应的孔内，每组平行3次，放入培养箱中培养；

(3)24h后，取出96孔板，吸去培养基，向每孔加入100μL MTT(1mg/mL)溶液，放入培养箱中继续培养；4h后，拿出孔板，小心吸取MTT溶液，然后再向每孔加入100μL DMSO溶液；放置于摇床上振荡30min，使得孔结晶紫充分溶解，测定OD₅₄₀下的吸光度；

细胞相对活力(％)＝(OD_实验组－OD_空白孔)/(OD_空白组－OD_空白孔)×100％。

2、实验结果

本发明海藻功能油对细胞的毒性测试结果如图4所示，可以看出，该海藻功能油对BV-2细胞无毒性。

应用例4海藻功能油的抗炎活性测试

一、海藻功能油抑制细胞内NO生成的活性测试实验

加入LPS诱导BV-2细胞触发炎症可以使其生成并释放NO，当加入抗炎药物时，生成并释放NO的量会减少；因此，可以通过测试细胞内NO的量作为筛选抗炎药物的筛选模型，利用本发明实施例1制备得到的海藻功能油作为样品，具体的实验方法和实验结果如下：

1、实验方法

(1)将BV-2细胞分别制成细胞悬液，向96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，每孔密度为5×10⁴个/孔，轻拍孔板，使细胞均匀分布于孔板底部，放入二氧化碳培养箱中继续培养；

(2)24h后，将孔板取出，弃去旧的培养基；将海藻功能油样品母液与无血清培养基混匀，使海藻功能油的终浓度为5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL，然后加到相应的孔内，每组平行3次，放入培养箱中培养；

(3)24h后，取出96孔板，吸取每孔内50μL的细胞上清液；

(4)按照Progema Griess Reagent System说明书进行NO含量的测定；

(5)根据标准曲线回归方程和实验组孔的OD₅₂₄计算出相应的NO含量。

2、实验结果

本发明海藻功能油抑制细胞内NO生成的活性测试结果如图5所示，可以看出，当海藻功能油的浓度为5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL时，BV-2细胞产生NO的量随着海藻功能油浓度的上升而显著下降，表明该海藻功能油可以显著抑制细胞内NO生成，具有抗炎活性。

二、海藻功能油抑制细胞内ROS水平的活性测试实验

加入LPS诱导BV-2细胞触发炎症可以使其ROS水平上升，当加入抗炎药物的时候，ROS水平下降；DCFH-DA本身没有荧光并可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成无荧光的DCFH，细胞内的ROS可以将其氧化为有荧光的DCF，通过检测DCF的荧光来衡量细胞内ROS的水平；因此，可以通过测定细胞内ROS水平作为筛选抗炎药物的筛选模型，利用本发明实施例1制备得到的海藻功能油作为样品，具体的实验方法和实验结果如下：

1、实验方法

(1)将BV-2细胞分别制成细胞悬液，向24孔板中每孔加入300μL细胞悬液，每孔密度为5×10⁴个/孔，轻拍孔板，使细胞均匀分布于孔板底部，放入二氧化碳培养箱中继续培养；

(2)24h后，将孔板取出，弃去旧的培养基；将海藻功能油样品母液与无血清培养基混匀，使海藻功能油的终浓度为5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL，然后加到相应的孔内，每组平行3次，放入培养箱中培养；

(3)24h后，取出孔板，吸弃培养基，用无血清培养清洗孔底3次；

(4)向每孔内加500μL浓度为10μΜ的DCFH-DA溶液，将24孔板放入培养箱内避光孵育，每隔3～5分钟振荡混匀一下，使探针和细胞充分接触；30min后，取出24孔板，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；

(6)用倒置荧光显微镜下观察实验孔内荧光情况，并拍照，用Image J软件分析平均荧光强度，平均光密度＝IntDen/Area；

实验共分为以下5组：

A组：BV-2+DCFH-DA(10μM)，即对照组，只有细胞和活性氧荧光探针DCFH-DA，无海藻功能油HFFO和LPS加入；

B组：BV-2+LPS(1μg/mL)+DCFH-DA(10μM)，即造模组，有细胞，并用LPS诱导活性氧，不加HFFO，加入探针DCFH-DA；

C组：BV-2+LPS(1μg/mL)+HFFO(5μg/mL)+DCFH-DA(10μM)，即低剂量组，在造模组基础上加入5μg/mL的HFFO；

D组：BV-2+LPS(1μg/mL)+HFFO(10μg/mL)+DCFH-DA(10μM)，即中剂量组，在造模组基础上加入10μg/mL的HFFO；

E组：BV-2+LPS(1μg/mL)+HFFO(20μg/mL)+DCFH-DA(10μM)，即高剂量组，在造模组基础上加入20μg/mL的HFFO。

2、实验结果

本发明海藻功能油对LPS诱导的BV-2细胞内ROS的抑制作用结果如图6所示，可以看出，无LPS加入的对照组(A组)细胞内ROS含量(由荧光强度直观反映)很低；而加入LPS的造模组(B组)细胞内ROS引起的荧光强度明显增强；而加入海藻功能油HFFO时(C组、D组和E组)，胞内ROS引起的荧光强度随海藻功能油HFFO浓度的升高呈现出剂量依赖性的降低。

本发明海藻功能油抑制细胞内ROS水平的活性测试结果如图7所示，可以看出，当海藻功能油的浓度为5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL时，BV-2细胞内ROS水平(由平均荧光密度反映)随着海藻功能油浓度的上升而显著下降，表明该海藻功能油可以显著抑制细胞内ROS水平，具有抗氧化活性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。