阅读说明：本技术 一种石蜡切片基因组dna提取的除蜡裂解液及提取试剂盒和提取方法 (Paraffin removal lysate for extracting genome DNA of paraffin section, extraction kit and extraction method ) 是由 周杰锋 于 2019-11-25 设计创作，主要内容包括：本申请涉及核酸提取方法,尤其涉及一种石蜡切片基因组DNA提取的除蜡裂解液及提取试剂盒和提取方法。一种石蜡切片基因组DNA的提取试剂盒,该试剂盒包括除蜡裂解液、结合缓冲液、洗涤液I、洗涤液II和洗脱液,所述的除蜡裂解液中的除蜡剂采用1,3-丙二胺。该除蜡裂解液采用1,3-丙二胺作为除蜡剂直接加入到除蜡裂解液中,脱蜡和裂解同步进行,裂解脱蜡结束后,无需额外操作,可以直接进行结合,洗涤,洗脱,非常适用于现在流行的核酸提取纯化仪,只要放入样本和相应试剂,就不用人工中途进行任何操作。(The application relates to a nucleic acid extraction method, in particular to paraffin removal lysate for extracting genome DNA of paraffin sections, an extraction kit and an extraction method. The kit comprises paraffin removal lysate, binding buffer solution, washing solution I, washing solution II and eluent, wherein a paraffin removal agent in the paraffin removal lysate adopts 1, 3-propane diamine. The dewaxing lysate adopts 1, 3-propane diamine as a dewaxing agent to be directly added into the dewaxing lysate, dewaxing and cracking are carried out synchronously, after cracking and dewaxing are finished, additional operation is not needed, combination, washing and elution can be directly carried out, the dewaxing lysate is very suitable for the existing popular nucleic acid extraction and purification instrument, and any operation is not needed to be carried out in the midway by manpower as long as a sample and a corresponding reagent are put in.)

一种石蜡切片基因组DNA提取的除蜡裂解液及提取试剂盒和 提取方法

技术领域

本申请涉及核酸提取方法，尤其涉及一种石蜡切片基因组DNA提取的除蜡裂解液及提取试剂盒和提取方法。

背景技术

石蜡切片(paraffinsection)组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。由于新鲜标本难以得到，对已有病例进行回顾性研究时，只能从石蜡包埋组织中进行DNA提取，因此石蜡包埋组织就成为来源最丰富的珍贵资源。

中国发明专利申请(公开号：CN104164418A，公开日：2014.06.26)公开了一种石蜡包埋组织切片基因组DNA提取试剂盒及其使用方法，包括脱蜡剂，二甲苯0.9～1.1份；脱蜡清洗剂，由95％乙醇1.8～2.2体积份，和75％乙醇0.9-1.1体积份组成；消化液0.28-0.32体积份，所述消化液由SDS、Tris-HCl、EDTA及蛋白酶K与水配制，消化液中各组分浓度分别为，SDS0.9-1.1％，Tris-HCl9～11mM、EDTA0.9-1.1mM，蛋白酶K90-110μg/ml；蛋白沉淀剂，所述蛋白沉淀剂为4MNH4AC溶液DNA沉淀剂，所述DNA沉淀剂为独立包装的3M醋酸钠溶液、无水乙醇、70％乙醇。该方法采用DNA沉淀法，并采用了二甲苯作为脱蜡剂，而二甲苯作为有毒物质，对试验操作者会产生毒害，也不利于环保排放。

中国发明专利申请(公开号：CN108998445A，公开日：2018.12.14)公开了一种从石蜡切片样本中提取核酸的试剂盒该，试剂盒包括有脱腊油，脱腊油包括有正十六烷和松节油，正十六烷和松节油的体积比为(3～6)：1。采用该脱蜡油对石蜡切片样本进行脱蜡，无需使用有毒化学品，正十六烷和松节油的配合使用具有良好脱蜡效果，无毒环保，简化了脱蜡过程中繁琐的洗涤步骤。该方法中裂解结束后有分层，需要人工吸取除蜡裂解液，脱蜡层在上层的话，吸取的枪头是要穿过有机物-蜡层的，对吸取的要求会有一定的要求，枪头可能会带出有机物-蜡层，此外如果下层除蜡裂解液吸取过多或者过少，都会影响后续的提取。

酚氯仿法、盐析法、吸附柱法、免疫亲和法、磁珠法等现有DNA提取方法中可用于唾液DNA提取的主要有吸附柱法和磁珠法，但吸附柱法提取效果和所提取DNA浓度上都有明显不足，而磁珠法在操作简易型和提取效果上也有很多待改进之处。

发明内容

为了解决上述的除蜡裂解后需要吸取再进行下部操作的技术问题，本申请的目的是提供一种石蜡切片基因组DNA提取的除蜡裂解液，该除蜡裂解液采用1,3-丙二胺作为除蜡剂直接加入到除蜡裂解液中，脱蜡和裂解同步进行，裂解脱蜡结束后，无需额外操作，可以直接进行结合，洗涤，洗脱，非常适用于现在流行的核酸提取纯化仪，只要放入样本和相应试剂，就不用人工中途进行任何操作。

为了实现上述的目的，本申请采用了以下的技术方案：

一种石蜡切片基因组DNA提取的除蜡裂解液，该除蜡裂解液由以下的成分构成：

上述的百分比为质量百分比，余量为水，pH8.5-9.0。

作为优选，该除蜡裂解液由以下的成分构成：

上述的百分比为质量百分比，余量为水，pH8.5-9.0。

另外，本申请还公开了一种石蜡切片基因组DNA的提取试剂盒，该试剂盒包括除蜡裂解液、结合缓冲液、洗涤液I、洗涤液II和洗脱液，所述的除蜡裂解液采用所述的除蜡裂解液。

作为优选，所述的结合缓冲液选用75-85％质量百分比的异丙醇，pH7.0-8.0。

作为优选，所述的洗涤液I包括2.5-3.5MGuHCl，8-12mMTris，45-55％乙醇，pH7.5-8.5；洗涤液II包括8-12mMTris，75-85％乙醇，pH7.5-8.5。

作为优选，所述的洗脱液包括：8-12mMTris，0.05-0.15mMEDTA；pH8.5-9.5。

作为优选，所述的该试剂盒还包括蛋白酶k溶液，蛋白酶K15-22mg/ml。申请人发现在适当的时间补加蛋白酶k有助于对样本的裂解。

作为优选，所述的该试剂盒包括以下的组分：

1)除蜡裂解液：30％1,3-丙二胺，0.1MTris-HCl，20mMEDTA，1.2MNaCl，4MGuSCN,1％SDS，2％PVP，pH8.9；

2)结合缓冲液：80％异丙醇；pH7.5；

3)洗涤液I：3MGuHCl，10mMTris，50％乙醇；pH8.0；

4)洗涤液II：10mMTris，80％乙醇；pH7.5；

5)洗脱液：10mMTris，0.1mMEDTA；pH9.0；

6)蛋白酶k。

本申请还公开了一种石蜡切片基因组DNA的方法，该方法采用所述的试剂盒。该方法包括以下的步骤：

1)取组织石蜡切片，转移至EP管中，加入除蜡裂解液，震荡混匀；

2)加入蛋白酶k，60-70℃加热震荡20-40min,随后放置于75-85℃水浴锅中静置15-25min，冷却至室温，补加蛋白酶k，60-70℃加热震荡5-15min；

3)加入结合缓冲液和磁珠，放置于垂直混合仪上旋转10-20min；

4)将离心管放到磁力架上0.5-2.0min，直到管内的磁珠完全被吸附，移走全部液体；

5)将离心管从磁力架中取出，加入洗涤液I，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分分散；6)然后将离心管置于磁力分离架上0.5-2.0min，直到管内磁珠完全被吸附，移走全部上清液；

6)加入洗涤液II，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分分散；然后将离心管置于磁力分离架上0.5-2.0min，直到管内磁珠完全被吸附；移走全部上清液；

7)重复一遍步骤6)；

8)加洗脱液，在60-70℃温度下震荡4-8min，然后将离心管置于磁力分离架,1.5-2.5min，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；保存于-20℃。

作为优选，所述的蛋白酶k第一次的加入量为除蜡裂解液体积的3-5％，补加的蛋白酶k为除蜡裂解液体积的3-5％。

本申请由于采用了上述的技术方案，具有以下的特点：

1)实现脱蜡/裂解同步进行，无需单独脱蜡，裂解完后可直接用于基因组DNA的提取省时省力，通过1,3-丙二胺除蜡剂即可达到高效、完全的脱蜡效果；

2)试剂之间不会相互影响，脱蜡—裂解同步进行，脱蜡—裂解仅需1小时的时间，就能充***解脱蜡后的组织，无需单独脱蜡，无需离心，省时省力，裂解完后可直接用于基因组DNA的提取；

3)既适用于手动提取，也能在微孔板中以自动化的方式配套核酸提取仪使用，提取纯度高且操作简便安全；

4)适用于包埋不同组织类型的石蜡切片；

5)高浓度、纯度：与磁珠相结合，提取的DNA浓度、纯度很高，可直接用于下游实验。

6)试剂盒具有良好的稳定性。

7)试剂不含酚、氯仿等有毒溶剂。

附图说明

图1为不同组织的石蜡切片电泳图。

图2为PCR程序设置图。

图3为不同组织的石蜡切片DNAPCR电泳图。

具体实施方式

主要试剂和仪器

仪器：离心机、水浴锅、恒温混合仪、涡旋震荡仪、垂直混合仪、2mLEP管、磁力架采用常规实验设备。

试剂：1,3-丙二胺、蛋白酶k、Tris、EDTA、NaCl、GuSCN、SDS、PVP、GuHCl由sigma生产；

乙醇、异丙醇由国药集团生产；

磁珠由Qiagen生产(取自MagattractDNAKit)。

提取配方

所述的该试剂盒包括以下的组分：

1)除蜡裂解液：0.1MTris-HCl，20mMEDTA，1.2MNaCl，4MGuSCN,1％SDS，2％PVP，pH8.9；

2)除蜡剂：1,3-丙二胺；

3)结合缓冲液：80％异丙醇；pH7.5；

4)洗涤液I：3MGuHCl，10mMTris，50％乙醇；pH8.0；

5)洗涤液II：10mMTris，80％乙醇；pH7.5；

6)洗脱液：10mMTris，0.1mMEDTA；pH9.0；

7)蛋白酶k20mg/ml。

提取步骤

1)取2～8张FFPE组织切片，转移至2mLEP管中，加入600μL除蜡和裂解液，震荡混匀。

2)加入20μL蛋白酶k，65℃加热震荡30min,随后放置于80℃水浴锅中静置20min，冷却至室温，补加20μL蛋白酶k，65℃加热震荡10min。

3)加入300μLBindingBuffer和10μLMagneticBeads，放置于垂直混合仪上旋转15min。

4)将离心管放到磁力架上1min，直到管内的磁珠完全被吸附。用枪头在不接触到磁珠的前提下尽可能地移走全部液体。

5)将离心管从磁力架中取出，加入500μLWashBufferI，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分分散。然后将离心管置于磁力分离架上1min，直到管内磁珠完全被吸附。移走全部上清液。

6)加入500μLWashBufferII，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分分散。然后将离心管置于磁力分离架上1min，直到管内磁珠完全被吸附。移走全部上清液。

7)重复一遍步骤6)。

8)加入50μLElutionBuffer，在65℃温度下震荡5min。然后将离心管置于磁力分离架上2min，用枪头将上清液移至另一干净离心管中。

9)将石蜡切片组织基因组DNA保存于-20℃。

试验例1

琼脂糖凝胶电泳检测

1.用本申请提取包埋不同组织的石蜡切片，随后进行琼脂糖凝胶电泳。

2.制胶：称取0.05g琼脂糖，加入5ml的1xTAE Buffer，摇晃均匀后，放置于微波炉加热至沸腾。取出静置冷却，加入3ul染色剂，摇晃均匀。倒入电泳板等待凝胶。

3.点胶：取5ul loading Buffer和10ul DNA混匀，点入胶中。打开电泳仪，开始跑胶。

提取4片不同组织的石蜡切片电泳的图如图1所示。

石蜡切片基因组DNA PCR

PCR按如下体系加样

PCR程序设置如图2所示，图3为不同石蜡切片基因组DNA的PCR电泳图。结论：提取得到的石蜡切片基因组DNA浓度较高，且片段较大。

试验例2

取5份不同石蜡组织，每份石蜡组织进行连续切片10片，按照每组5片。将本申请实施例提供的试剂盒对第一组进行核酸提取，同时对比设置一组对照实施例，对照实施例中采用二甲苯替换1,3-丙二胺对第二组样本进行核酸提取，两组均采用本申请提供的方法对核酸进行提取。

将两组提取的核酸样本经核酸微量测试仪(安捷伦2100生化分析仪)进行提取核酸浓度以及纯度的测定，测定的浓度及纯度如表1、表2所示。

表1为一组核酸样本的浓度结果

表2为二组核酸样本的浓度结果

由表1、2可知，第一组提取的核酸浓度明显要好于第二组，但是纯度相差不大，但是说明采用本申请中1,3-丙二胺对样本的脱蜡效果要好于二甲苯，因此，本申请中的1,3-丙二胺可以替代传统使用的二甲苯进行石蜡样本的脱蜡处理。

试验例3

本试验例采用10组***固定石蜡包埋的病小鼠肝组织样本，10组样本组织从固定包埋开始到进行实验的保存时间分别为1个月、2个月、3个月、4个月、8个月、10个月、12个月、2年、3年、4年以及5年。其中，1年内的标本5个，依次编号为1～5；2～5年的标本5个，依次编号为6～10。

采用本申请提供的方法对上述12组样本(各取连续切片10片)进行核酸提取，然后利用核酸微量测试仪(安捷伦2100生化分析仪)测定12组核酸的浓度及纯度，测定的浓度及纯度如下表3所示。

表3样本的浓度结果

从表3可知，本申请提供的试剂盒，能够过超过5年的石蜡切片样本进行DNA提取。

以上为对本申请实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。