阅读说明：本技术 一种羊肚菌多糖的提取方法及应用 (Extraction method and application of morchella polysaccharide ) 是由 李峻志 霍文严 祁鹏 刘愚 张黎光 戴璐 乔婷 谢薇梅 李安利 于 2019-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种羊肚菌多糖的提取方法及应用,首先将羊肚菌粉碎后与复合菌剂混合发酵；其中,复合菌剂包括酵母菌和能够分泌几丁质酶的枯草芽孢杆菌；然后将得到的发酵液与复合酶制剂混合,获得酶解液；其中,复合酶制剂包括几丁质酶与酸性蛋白酶；最后,将酶解液离心、取上清并进行浓缩,加入无水乙醇进行醇析、干燥,得到羊肚菌多糖。本发明的提取工艺简单,工艺条件温和,所得的羊肚菌多糖含量高、生物活性强,在促进外周血白细胞及淋巴细胞的增殖方面具有显著效果。(The invention discloses an extraction method and application of morchella polysaccharide, which comprises the steps of firstly, crushing morchella and then mixing the crushed morchella with a composite microbial inoculum for fermentation; wherein the compound microbial inoculum comprises saccharomycetes and bacillus subtilis capable of secreting chitinase; then mixing the obtained fermentation liquor with a complex enzyme preparation to obtain an enzymolysis liquid; wherein the complex enzyme preparation comprises chitinase and acid protease; and finally, centrifuging the enzymolysis liquid, taking the supernatant, concentrating, adding absolute ethyl alcohol, performing alcohol precipitation and drying to obtain the morchella polysaccharide. The extraction process is simple, the process conditions are mild, the obtained morchella polysaccharide is high in content and strong in biological activity, and the morchella polysaccharide has an obvious effect on promoting the proliferation of peripheral blood leucocytes and lymphocytes.)

一种羊肚菌多糖的提取方法及应用

技术领域

本发明属于多糖提取技术领域，具体涉及一种羊肚菌多糖的提取方法及应用。

背景技术

羊肚菌隶属于子囊菌亚门、盘菌纲、盘菌目、羊肚菌科、羊肚菌属，因其形似羊肚而得名。羊肚菌兼可药用和食用，传统中医认为，羊肚菌性平、味甘，具有益肠胃、消化助食的作用。现代研究则表明，羊肚菌含有丰富的多糖、蛋白质、氨基酸、维生素以及锌、硒、铁、锗、铜等多种微量元素。特别是羊肚菌多糖，现代医学研究发现，羊肚菌多糖具有抗肿瘤、抗菌、抗疲劳、增强免疫力等作用，在现代医学上有重要的开发和利用价值。

目前，羊肚菌多糖的提取一般有溶剂浸提法、酸提法、碱提法、酶法等。溶剂浸提法的提取效率低且费时；酸碱提法的程序繁琐，且极易破坏多糖中的糖苷键，使其生物活性降低；酶解法能作用于限定的底物，限制了它的广泛应用。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种羊肚菌多糖的提取方法及应用，以解决现有方法提取效率低、费时、程序繁琐、易降低多糖生物活性的问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：

一种羊肚菌多糖的提取方法，包括：

步骤1：将羊肚菌粉碎后与复合菌剂混合发酵；其中，复合菌剂包括酵母菌和能够分泌几丁质酶的枯草芽孢杆菌；

步骤2：将步骤1得到的发酵液与复合酶制剂混合，获得酶解液；其中，复合酶制剂包括几丁质酶与酸性蛋白酶；

步骤3：将酶解液离心、取上清并进行浓缩，加入无水乙醇进行醇析、干燥，得到羊肚菌多糖。

具体的，所述的复合菌剂的添加质量为羊肚菌质量的1％～5％。

具体的，复合菌剂中酵母菌与芽孢杆菌的质量比为1：2。

具体的，所述的步骤1中发酵温度为29～33℃，pH值为3.5～4.5，发酵时间为12～16小时。

具体的，复合酶制剂添加质量为羊肚菌质量的1.5％～2.0％。

具体的，复合酶制剂中几丁质酶与酸性蛋白酶的质量比为1：1。

具体的，所述的步骤2中酶解过程温度为36～40℃，pH值为3.5～4.2，作用时间为8～12小时。

本发明还公开了上述制备方法制备的羊肚菌多糖用于淋巴细胞和白细胞增殖方面的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的提取工艺简单，工艺条件温和，所得的羊肚菌多糖含量高、生物活性强，在促进外周血白细胞及淋巴细胞的增殖方面具有显著效果。

具体实施方式

本发明下列实施例中所使用的酵母菌为安琪酵母股份有限公司购买，酵母菌的保藏编号为CGMCC No.2.1638。芽孢杆菌也为市购，芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.9166。

以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例中，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。

实施例1

步骤1，发酵：将干燥的羊肚菌子实体粉碎后加入5～7倍水膨胀，并加入1％(w/w)的由酵母菌和能分泌几丁质酶的枯草芽孢杆菌(以下简称芽孢杆菌)的复合菌剂进行摇床发酵。酵母菌与芽孢杆菌的重量比为1：2，发酵温度为29℃，pH值为4.5，发酵时间为16小时。

步骤2，酶解：发酵一段时间后，将发酵液混合均匀，加入复合酶制剂，该复合酶制剂由几丁质酶与酸性蛋白酶按照重量比为1：1的比例混合而成。复合酶制剂的添加量为1.5％，作用温度为36℃，pH值为4.2，作用时间为 12小时。

步骤3：将步骤2获得的酶解液进行离心，取上清液并进行浓缩，之后加入4倍体积的无水乙醇，得醇析物，之后将醇析物喷雾干燥，得水溶性羊肚菌多糖。测试发现，本实施例获得的羊肚菌多糖的得率为71.7％。

本实施例制备的羊肚菌多糖用于促进外周血白细胞及淋巴细胞的增殖，其增值效果见表1和下述实验结果。

实施例2

步骤1，发酵：将干燥的羊肚菌子实体粉碎后加入5-7倍水膨胀，并加入3％(w/w)的酵母菌和能分泌几丁质酶的枯草芽孢杆菌(以下简称芽孢杆菌)的复合菌剂进行摇床发酵。酵母菌与芽孢杆菌的重量比为1：2，发酵温度为31℃，pH值为4.0，发酵时间为14小时。

步骤2，酶解：发酵一段时间后，将发酵液混合均匀，加入复合酶制剂，该复合酶制剂由几丁质酶与酸性蛋白酶按照重量比为1：1的比例混合而成。复合酶制剂的添加量为1.75％，作用温度为38℃，pH值为3.9，作用时间为 10小时。

将步骤2获得的酶解液进行离心，取上清液并进行浓缩，之后加入4 倍体积的无水乙醇，得醇析物，之后将醇析物喷雾干燥，得水溶性羊肚菌多糖。水溶性羊肚菌多糖的得率为72.5％。

本实施例制备的羊肚菌多糖用于促进外周血白细胞及淋巴细胞的增殖，其增值效果同实施例1。

实施例3

步骤1，发酵：将干燥羊肚菌子实体粉碎后加入5-7倍水膨胀，并加入 5％(w/w)的酵母菌和能分泌几丁质酶的枯草芽孢杆菌(以下简称芽孢杆菌) 的复合菌剂进行摇床发酵。酵母菌与芽孢杆菌的重量比为1：2，发酵温度为33℃，pH值为3.5，发酵时间为12小时。

步骤2，酶解：发酵一段时间后，将发酵液混合均匀，加入复合酶制剂，该复合酶制剂由几丁质酶与酸性蛋白酶按照重量比为1：1混合而成。复合酶制剂添加量为2.0％，作用温度为40℃，pH值为3.5，作用时间为8小时。

步骤3：将步骤2获得的酶解液进行离心，取上清液并进行浓缩，之后加入4倍体积的无水乙醇，得醇析物，之后将醇析物喷雾干燥，得水溶性羊肚菌多糖。水溶性羊肚菌多糖的得率为74.3％。

本实施例制备的羊肚菌多糖用于促进外周血白细胞及淋巴细胞的增殖，其增值效果同实施例1。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于：本对比例中不加入复合菌剂。

本对比例制备的羊肚菌多糖用于促进外周血白细胞及淋巴细胞的增殖，其增值效果见表1和下述实验结果。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于：羊肚菌子实体粉碎后，使用NaOH 溶液取代水使其膨胀(NaOH溶液与水的作用时间为实施例3中发酵与酶解的时间之和)，并且不加入复合菌剂及复合酶制剂。

本对比例制备的羊肚菌多糖用于促进外周血白细胞及淋巴细胞的增殖，其增值效果见表1和下述实验结果。

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于：羊肚菌子实体粉碎后，使用盐酸溶液取代水使其膨胀(盐酸溶液与水的作用时间为实施例3中发酵与酶解的时间之和)，并且不加入复合菌剂及复合酶制剂。

本对比例制备的羊肚菌多糖用于促进外周血白细胞及淋巴细胞的增殖，其增值效果见表1和下述实验结果。

对比例4

本对比例与实施例1的区别在于：不加入复合菌剂及复合酶制剂，且羊肚菌子实体粉碎后加入5-7倍水膨胀，并于95℃的水浴条件下反应一段时间 (反应时间为实施例3中发酵与酶解的时间之和)。

本对比例制备的羊肚菌多糖用于促进外周血白细胞及淋巴细胞的增殖，其增值效果见表1和下述实验结果。

以羊肚菌多糖对小鼠外周血中白细胞和淋巴细胞数量的影响程度表示羊肚菌多糖的生物活性。

(1)实验方法

60只SPF BALB/c小鼠(8周龄，18至20g)被随机分为6组，每组 10只，在无菌、22±1℃的环境下饲养一周后，采用灌胃的方式对小鼠进行多糖给药，实验时间共进行7天。CT组为空白对照组，对小鼠不做任何处理；PC1组为药物对照组，每天为小鼠灌胃碱提法(对比例2)所得羊肚菌多糖(200mg/Kg体重)；PC2组为药物对照组，每天为小鼠灌胃酸提法 (对比例3)所得羊肚菌多糖(200mg/Kg体重)；PC3组为药物对照组，每天为小鼠灌胃溶剂浸提法(对比例4)所得羊肚菌多糖(200mg/Kg体重)； PC4组为药物对照组，每天为小鼠灌胃酶法(对比例1)所得羊肚菌多糖(200 mg/Kg体重)；EG组为本发明组，每天为小鼠灌胃实施例1所得的羊肚菌多糖(200mg/Kg体重)。使用全自动血细胞分析仪对小鼠外周血中的白细胞及淋巴细胞数量进行测定。

(2)实验结果

表1羊肚菌多糖对小鼠外周血中白细胞和淋巴细胞数量的影响

经统计分析，本发明组的小鼠外周血中的白细胞及淋巴细胞数量均显著高于各药物对照组和空白对照组(p<0.05)，说明在促进外周血白细胞及淋巴细胞的增殖方面，本发明组所得的羊肚菌多糖效果显著。