阅读说明：本技术 一种乌拉立肽杂质 (Ursolitin impurity ) 是由 刘�东 任崇飞 于 2018-08-21 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,具体公开了一种乌拉立肽杂质,通过样品跟踪监测,发现乌拉立肽甲硫氨酸氧化物贯穿整个乌拉立肽纯化工艺,并在乌拉立肽纯化后期,成为主要杂质成分。本发明还公开了该杂质的制备方法和检测方法,本发明制备方法,反应时间短,操作简单,收率高,所得到的乌拉立肽杂质HPLC纯度达到99.5％以上,可以作为标准品用于乌拉立肽制备过程中的杂质研究。(The invention belongs to the technical field of medicines, and particularly discloses a urotropine impurity, which is a main impurity component in the later stage of urotropine purification by finding that urotropine methionine oxide penetrates through the whole urotropine purification process through sample tracking and monitoring. The preparation method has the advantages of short reaction time, simple operation and high yield, and the obtained ularitide impurity HPLC purity reaches more than 99.5 percent and can be used as a standard substance for impurity research in the ularitide preparation process.)

一种乌拉立肽杂质

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种乌拉立肽杂质。

背景技术

乌拉立肽(Ularitide)的结构为32个氨基酸组成的含有一对分子内二硫键的多肽，分子式是C₁₄₅H₂₃₄N₅₂O₄₄S₃，分子量约为3506，CAS号：118812-69-4，多肽序列为：

H-Thr-Ala-Pro-Arg-Arg-Ser-Leu-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH(S-S)。

乌拉立肽是从人体尿液中分离出来的利钠肽，是一种心房钠尿肽(atrialnatriureticpeptide，ANP)家族的肾利钠肽。内源性乌拉立肽在肾远端肾小管细胞合成，由管腔后分泌，在内部髓集合管与下游利钠肽A型受体结合，能够调节肾脏钠和水的***，因此乌拉立肽有舒张血管、利钠和利尿的作用，并且已证实乌拉立肽能够降低肾脏对尿液的重吸收。临床上治疗失代偿性心力衰竭(DHF)是以缓解症状和稳定病人的血液动力学为目标，目前使用的治疗药物包括利尿剂、血管舒张药和增强收缩力的药物，然而这些药物都存在临床局限性。二期临床研究表明，乌拉立肽能降低心脏充盈压力和改善呼吸困难，且对DHF患者的肾脏功能没有明显的不良影响，可见乌拉立肽在治疗DHF中有广阔前景。

目前，针对乌拉立肽的合成方法，主要有两种，一种是在固相中完成线性肽肽树脂的偶联，然后采用碘固相氧化形成相应的二硫键；另一种方法是先固相合成线性肽前体，然后在浓度非常低的有机溶剂/水溶液中，液相氧化形成相应的二硫键。

前者的合成方法采用Fmoc固相肽合成技术，以Wang树脂为起始原料，依次偶联各个氨基酸残基，得到线性肽树脂，然后加入固体碘单质，氧化形成二硫键，得到氧化后成环的肽树脂，裂解后得到粗品。该合成方法虽然合成步骤简单，但是在偶联肽树脂过程中，部分残基偶联困难，得到粗肽纯度低。同时采用碘在肽树脂上进行氧化，碘在整个过程中共难以完全洗脱，容易导致最终的纯品即原料药中含有微量的碘，导致原料药偏黄色。此外，采用强氧化剂对肽进行氧化，容易破坏肽序自身的二级结构，最终将影响肽本身的生物活性及药效。因此乌拉立肽合成一般采用后者方法。

后者的合成方法中同样采用Fmoc固相肽合成技术，以Wang树脂为起始原料，依次偶联各个氨基酸残基，得到线性肽树脂，线性肽树脂裂解后得到线性肽粗品。粗肽经过HPLC纯化，得到线性肽精肽。线性肽精肽用甲醇或者乙腈溶解，加水稀释空气氧化条件下氧化，得到氧化后的环肽粗品。环肽粗品经HPLC纯化后，得到精肽。该方法具有与前者的合成方案相同的缺点，即部分残基偶联困难，线性肽粗品纯度较低。相对前者的优势是，最终产物的空间二级结构能够得到完整的保留，最终精肽的生物活性相对前者要好。但是乌拉立肽氧化工艺比较复杂，产物收率不高，副反应较多。这些副反应所生成的杂质，可能会导致乌拉立肽的结构和功能改变。这些杂质的产生对临床用药的安全性存在潜在威胁，为了更好地实现该药品的经济和社会效益，标准中必须严控各项杂质，因此明确各杂质项是急需解决的问题。

发明内容

乌拉立肽制备过程中的氧化步骤是将乌拉立肽序列中的半胱氨酸中的含硫氨基酸残基氧化。同时，乌拉立肽的第16位是甲硫氨酸，也属于易氧化的含硫氨基酸残基。甲硫氨酸易被氧化成为甲硫氨酸-R，S-亚砜，并可被进一步不可逆氧化成为甲硫氨酸-R，S-砜。多肽氧化成环和纯化过程中均会造成甲硫氨酸氧化，进一步的生成杂质，导致乌拉立肽的结构和功能改变。

在乌拉立肽的纯化过程中，多肽纯度越高，甲硫氨酸越容易被氧化。经过试验分析，我们发现多肽的甲硫氨酸氧化杂质并不能被一般的多肽检测方法检测出来。现有的多肽药物制备文献和专利技术中并没有检控多肽氧化过程的方法研究，更未见将该杂质作为重点杂质列入质量标准中。

针对现有技术的不足，本发明在乌拉立肽检测方法开发的过程中，试验优化多肽分析方法，筛选得到可有效检出乌拉立肽杂质的分析方法。通过序列分析证实该乌拉立肽杂质为多肽甲硫氨酸氧化物。通过样品跟踪监测，发现乌拉立肽甲硫氨酸氧化物贯穿整个纯化工艺，并在乌拉立肽纯化后期，成为主要杂质成分，在样品冻干后检测可达到2.0～5.0％。乌拉立肽纯品及纯品在空气中放置2h和6h后HPLC检测图谱见图1、图2和图3。因此，对乌拉立肽制备过程中的杂质研究非常有必要。

本发明的目的在于提供一种乌拉立肽杂质，该多肽杂质氨基酸序列连接如下：

其结构式如式I所示：

本发明还提供了式I乌拉立肽杂质的制备方法，由乌拉立肽纯品经过氧化得到乌拉立肽杂质。具体地，该制备方法包括如下步骤：

(1)双氧水氧化反应

将乌拉立肽纯品溶解在水中，加入双氧水溶液，室温搅拌反应10～30min。

(2)样品纯化

将步骤(1)所得氧化后的溶液上样高效液相制备色谱柱，以A相有机溶剂和B相缓冲盐溶液作为流动相，进行梯度洗脱，收集洗脱液。

(3)转盐

将步骤(2)所得洗脱液，继续上柱于高效液相制备色谱柱，以A相有机溶剂和C相稀酸溶液作为流动相，进行梯度洗脱转盐，紫外检测收集流出液。

(4)冻干

将步骤(3)所得洗脱流出液浓缩除去有机溶剂，在真空度≤10mbar，隔板控温20℃条件下冻干10～16h得式I乌拉立肽杂质。

优选地，步骤(1)中乌拉立肽样品溶液浓度为5～20mg/ml，双氧水溶液中双氧水的质量分数为2～5％，乌拉立肽样品溶液与双氧水溶液的体积比为1∶0.8～1.2。

步骤(1)中双氧水的质量浓度可以增大，双氧水质量浓度的增大会使得氧化收率有一定程度的提高，但是随之而来会产生其他杂质，这些杂质的产生会影响式I乌拉立肽杂质的分离纯化。

式I乌拉立肽杂质制备方法中，氧化剂双氧水还可以选择其他氧化剂来代替，例如，过氧化钠、高锰酸钾、氯酸钾、次氯酸等能提供活性氧的氧化剂，这些氧化剂也可以氧化乌拉立肽纯品中的甲硫氨酸，但同时也会产生其他杂质，影响式I乌拉立肽杂质的分离纯化。

优选地，步骤(2)中所述的高效液相制备色谱柱所用的填料为反相色谱填料，优选地，所述制备填料选自

中一种；

优选地，步骤(2)所述的流动相为A相有机溶剂和B相缓冲盐溶液的混合溶液，所述的A相有机溶剂选自甲醇、乙醇和乙腈中的一种；B相缓冲盐溶液选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、硫酸铵、乙酸铵、甲酸钠溶液中的一种，所述缓冲盐的浓度为20～100mmol/L，缓冲盐溶液的pH为2.0～4.5。

优选地，步骤(2)所述的梯度洗脱程序见表1，根据在线紫外检测结果收集洗脱液。

表1纯化过程中的洗脱梯度表

更加优选地，步骤(2)所述的梯度洗脱程表如下表2：

表2纯化过程中的洗脱梯度表

优选地，步骤(3)所使用的高效液相色谱柱与步骤(2)相同，流动相A相也与步骤(2)相同；流动相C相为稀酸溶液，所述的酸为甲酸或乙酸，甲酸或乙酸的体积分数为0.1～1％，步骤(3)的洗脱梯度见表3。

表3转盐过程中的洗脱梯度表

更加优选地，转盐过程中的洗脱梯度表见下表4。

表4转盐过程中的洗脱梯度表

将乌拉立肽杂质样品进行氨基酸组成分析。分析结果如下：

1.氨基酸总数

理论氨基酸总数为：32个

2.分子量

理论分子量为：3521.9道尔顿

3.氨基酸组成

多肽氨基酸组成见表5。

表5多肽氨基酸组成信息

从表5可以看出，乌拉立肽杂质中不含有Met，而含有Met(O)，经过质谱分析乌拉立肽纯品的分子量为3505.9，式I杂质的分子量为3521.9。二者分子量相差16，即甲硫氨酸被氧化成了甲硫氨酸亚砜。乌拉立肽纯品的质谱图见图4，制备出的式I杂质质谱图见图5。

本发明另一目的还提供了乌拉立肽杂质的检测方法。用以解决常规多肽分析方法检测不出甲硫氨酸氧化杂质的缺陷。

常规多肽分析方法主要有以下两种：

(1)采用普通C18键合色谱柱，0.1％TFA/H₂O-0.1％TFA/ACN或0.1％HA/H₂O-ACN洗脱体系；

(2)采用普通C18键合或ODS色谱柱，缓冲盐与有机溶剂不同混合的两相流动相体系，常用pH为4.0～7.0。

然而以上两种分析方法并不能有效检测出式I乌拉立肽杂质，本发明提供一种检测甲硫氨酸氧化杂质的方法，使得式I乌拉立肽杂质定量被检测，实现乌拉立肽纯化过程中的对甲硫氨酸氧化杂质进行控制。

本发明提供的一种式I乌拉立肽杂质的检测方法，采用以耐酸型C18键合填料为填充剂的色谱柱，流动相为缓冲盐溶液和有机溶剂不同体积配比的a、b两种流动相，进行梯度洗脱。

优选地，所述填料耐受pH为1～3；更加优选地，所述的填料为Welch-Ultimate-LP-C18-5μm或所使用的色谱柱的规格为4.6mm×250mm；检测波长为210～220nm：流速为0.8～1.0ml/min，优选为1.0ml/min；柱温为25～35℃，优选为30℃。

优选地，所述流动相为a、b两相的混合溶液，a、b两相为不同体积配比的缓冲盐溶液和有机溶剂的混合溶液；更加优选地，a相为缓冲盐溶液与有机溶剂体积比9∶1～7∶3，b相为缓冲盐溶液与有机溶剂体积比4∶6～6∶4；所述的有机溶剂选自甲醇和乙腈的一种；所述的缓冲盐选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、硫酸铵、乙酸铵和甲酸钠中的一种；所述的缓冲盐的浓度为10～30mmol/L；所述缓冲液pH为1.5～3.0，pH调节剂为流动相中缓冲盐所对应的酸。

优选地，梯度洗脱程序见表6。

表6乌拉立肽杂质HPLC检测洗脱梯度表

更加优选地，一种乌拉立肽氧化杂质HPLC检测色谱条件如下：

色谱柱：Welch-Ultimate-LP-C18-5μm，4.6×250mm；

流动相：a相为20mmol/L硫酸铵溶液与乙腈体积比为9∶1，b相为20mmol/L硫酸铵溶液与乙腈体积比为1∶1，其中20mmol/L硫酸铵溶液使用磷酸调节pH2.0；

检测波长：210nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；

梯度洗脱见表7。

表7乌拉立肽杂质HPLC检测洗脱梯度表

本发明制备出的式I乌拉立肽杂质HPLC图谱见图6所示，该分析方法采用耐酸型填料色谱柱，色谱柱耐受pH1～3，低于普通C18反相柱耐受pH2～8；流动相采用缓冲盐溶液和有机溶剂不同体积配比的a、b两种流动相，进行梯度洗脱；该分析方法可有效检测出乌拉立肽和式I乌拉立肽杂质，可实现乌拉立肽制备纯化过程中式I乌拉立肽杂质的有效检控。

与现有技术相比，本发明取得如下的技术效果：

(1)本发明制备方法，反应时间短，操作简单，收率高，所得到的乌拉立肽杂质HPLC纯度达到99.5％以上，可以作为标准品用于乌拉立肽制备过程中的杂质研究；

(2)本发明的分析方法可完成乌拉立肽样品的高效分析，可应用于检控乌拉立肽和乌拉立肽纯化过程中的甲硫氨酸氧化物杂质，常规多肽检测方法不能有效检出多肽氨基酸氧化杂质，无法实现乌拉立肽的有效检测。

(3)本发明的针对性强，方法简单，本发明方法对其它含硫氨基酸多肽的分析方法的建立具有参考意义。

附图说明

图1：乌拉立肽纯品HPLC检测图谱；

图2：乌拉立肽纯品放置2h后HPLC检测图谱；

图3：乌拉立肽纯品放置6h后HPLC检测图谱；

图4：乌拉立肽纯品质谱图；

图5：式I乌拉立肽杂质质谱图；

图6：式I乌拉立肽杂质HPLC检测图谱；

图7：实施例11乌拉立肽杂质HPLC检测图谱；

图8：实施例12乌拉立肽杂质HPLC检测图谱；

图9：实施例13乌拉立肽纯品HPLC检测图谱；

图10：实施例14乌拉立肽纯品HPLC检测图谱。

具体实施方式

以下通过具体实施例来充分阐述本发明，以下实施例只是本发明的一部分，而不是全部实施例体现，不应以此限定本发明的保护范围，这对于本发明所述的技术领域的普通技术人员而言是显而易见的。

本发明所使用的乌拉立肽纯品由山东新时代药业有限公司提供，其它所使用的原料\填料等，如无特殊说明，均可以通过商业途径获得。本发明乌拉立肽杂质制备过程中所采用的高效液相制备色谱柱采用50mm×450mm的动态轴向压缩制备柱(DAC50柱)，分析检测过程HPLC仪器为Thermo Ultimate3000高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技)。

实施例1乌拉立肽杂质的制备

(1)双氧水氧化

将乌拉立肽纯品(HPLC纯度99.90％)配制成10mg/ml的样品水溶液100ml，加入100ml质量分数为3％的双氧水溶液，室温反应20min得氧化液，取样HPLC分析，氧化收率65.2％。

(2)样品纯化

使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为配制A、B流动相，A为甲醇，B为pH2.0的10mmol/L硫酸铵溶液。

将步骤(1)所得氧化液上样于制备色谱柱，运行表1中A、B两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液取样HPLC分析，纯化收率86.9％，式I杂质HPLC纯度98.23％。

(3)转盐

配制A、C流动相，A为甲醇，C为体积分数为0.1％的甲酸水溶液。

将步骤(2)所得洗脱液上样，运行表3中A、C两相梯度洗脱程序，收集洗脱液，HPLC检测，式I杂质HPLC纯度99.63％。

(4)洗脱液的浓缩和冻干

将步骤(3)所得洗脱液减压浓缩除去甲醇，在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥12h，得式I乌拉立肽杂质，总收率为45.7％，HPLC纯度为99.57％。

实施例2乌拉立肽杂质的制备

(1)双氧水氧化

将乌拉立肽纯品(HPLC纯度99.90％)配制成20mg/ml的样品水溶液100ml，加入80ml质量分数为5％的双氧水溶液，室温反应20min得氧化液，取样HPLC分析，氧化收率61.8％。

(2)样品纯化

使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为

配制A、B流动相，A为乙醇，B为pH3.5的100mmol/L磷酸二氢钠溶液。

将步骤(1)所得氧化液上样于制备色谱柱，运行表2中A、B两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液取样HPLC分析，纯化收率90.3％，式I杂质HPLC纯度98.41％。

(3)转盐

配制A、C流动相，A为乙醇，C为体积分数为1.0％的乙酸水溶液。

将步骤(2)所得洗脱液上样，运行表4中A、C两相梯度洗脱程序，收集洗脱液，HPLC检测，式I杂质HPLC纯度99.64％。

(4)洗脱液的浓缩和冻干

将步骤(3)所得洗脱液减压浓缩除去乙醇，在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥10h，得式I乌拉立肽杂质，总收率为41.6％，HPLC纯度为99.60％。

实施例3乌拉立肽杂质的制备

(1)双氧水氧化

将乌拉立肽纯品(HPLC纯度99.90％)配制成5mg/ml的样品水溶液100ml，加入120ml质量分数为2％的双氧水溶液，室温反应30min得氧化液，取样HPLC分析，氧化收率70.4％。

(2)样品纯化

使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为

配制A、B流动相，A为乙腈，B为pH4.5的20mmol/L甲酸钠溶液。

将步骤(1)所得氧化液上样于制备色谱柱，运行表2中A、B两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液取样HPLC分析，纯化收率87.3％，I杂质HPLC纯度98.37％。

(3)转盐

配制A、C流动相，A为乙腈，C为体积分数为0.5％的甲酸水溶液。

将步骤(2)所得洗脱液上样，运行表4中A、C两相梯度洗脱程序，收集洗脱液，HPLC检测，式I杂质HPLC纯度99.69％。

(4)洗脱液的浓缩和冻干

将步骤(3)所得洗脱液减压浓缩除去乙腈，在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥16h，得式I乌拉立肽杂质，总收率为49.3％，HPLC纯度为99.65％。

实施例4乌拉立肽杂质的制备

(1)双氧水氧化

将乌拉立肽纯品(HPLC纯度99.90％)配制成20mg/ml的样品水溶液100ml，加入120ml质量分数为5％的双氧水溶液，室温反应20min得氧化液，取样HPLC分析，氧化收率73.5％。

(2)样品纯化

使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为

配制A、B流动相，A为乙醇，B为pH4.0的20mmol/L磷酸二氢钾溶液。

将步骤(1)所得氧化液上样于制备色谱柱，运行表2中A、B两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液取样HPLC分析，纯化收率82.6％，式I杂质HPLC纯度98.47％。

(3)转盐

配制A、C流动相，A为乙醇，C为体积分数为0.2％的乙酸水溶液。

将步骤(2)所得洗脱液上样，运行表4中A、C两相梯度洗脱程序，收集洗脱液，HPLC检测，式I杂质HPLC纯度99.63％。

(4)洗脱液的浓缩和冻干

将步骤(3)所得洗脱液减压浓缩除去乙醇，在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥12h，得式I乌拉立肽杂质，总收率为44.3％，HPLC纯度为99.52％。

实施例5乌拉立肽杂质的制备

(1)双氧水氧化

将乌拉立肽纯品(HPLC纯度99.90％)配制成10mg/ml的样品水溶液100ml，加入120ml质量分数为5％的双氧水溶液，室温反应20min得氧化液，取样HPLC分析，氧化收率75.2％。

(2)样品纯化

使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为

配制A、B流动相，A为乙腈，B为pH3.5的20mmol/L磷酸二氢铵溶液。

将步骤(1)所得氧化液上样于制备色谱柱，运行表2中A、B两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液取样HPLC分析，纯化收率89.5％，式I杂质HPLC纯度98.65％。

(3)转盐

配制A、C流动相，A为乙腈，C为体积分数为0.2％的乙酸水溶液。

将步骤(2)所得洗脱液上样，运行表4中A、C两相梯度洗脱程序，收集洗脱液，HPLC检测，式I杂质HPLC纯度99.69％。

(4)洗脱液的浓缩和冻干

将步骤(3)所得洗脱液减压浓缩除去乙腈，在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥12h，得式I乌拉立肽杂质，总收率为51.6％，HPLC纯度为99.62％。

实施例6乌拉立肽杂质的制备

(1)双氧水氧化

将乌拉立肽纯品(HPLC纯度99.90％)配制成10mg/ml的样品水溶液100ml，加入120ml质量分数为0.5％的双氧水溶液，室温反应30min得氧化液，取样HPLC分析，氧化收率49.6％。

(2)样品纯化

使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为

配制A、B流动相，A为乙腈，B为pH3.5的20mmol/L磷酸二氢铵溶液。

将步骤(1)所得氧化液上样于制备色谱柱，运行表2中A、B两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液取样HPLC分析，纯化收率83.1％，式I杂质HPLC纯度98.15％。

(3)转盐

配制A、C流动相，A为乙腈，C为体积分数为0.2％的乙酸水溶液。

将步骤(2)所得洗脱液上样，运行表4中A、C两相梯度洗脱程序，收集洗脱液，HPLC检测，式I杂质HPLC纯度99.61％。

(4)洗脱液的浓缩和冻干

将步骤(3)所得洗脱液减压浓缩除去乙腈，在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥12h，得式I乌拉立肽杂质，总收率为29.1％，HPLC纯度为99.53％。

实施例7乌拉立肽杂质的制备

(1)空气氧化

将乌拉立肽纯品(HPLC纯度99.90％)配制成10mg/ml的样品水溶液100ml，室温搅拌6h得氧化液，取样HPLC分析，氧化收率16.5％。

(2)样品纯化

使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为

配制A、B流动相，A为乙腈，B为pH3.5的20mmol/L磷酸二氢铵溶液。

将步骤(1)所得氧化液上样于制备色谱柱，运行表2中A、B两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液取样HPLC分析，纯化收率89.5％，式I杂质HPLC纯度98.33％。

(3)转盐

配制A、C流动相，A为乙腈，C为体积分数为0.2％的乙酸水溶液。

将步骤(2)所得洗脱液上样，运行表4中A、C两相梯度洗脱程序，收集洗脱液，HPLC检测，式I杂质HPLC纯度99.53％。

(4)洗脱液的浓缩和冻干

将步骤(3)所得洗脱液减压浓缩除去乙腈，在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥12h，得式I乌拉立肽杂质，总收率为11.3％，HPLC纯度为99.50％。

实施例8乌拉立肽杂质的制备

(1)双氧水氧化

将乌拉立肽纯品(HPLC纯度99.90％)配制成10mg/ml的样品水溶液100ml，加入120ml质量分数为10％的双氧水溶液，室温反应20min得氧化液，取样HPLC分析，氧化收率78.1％。

(2)样品纯化

使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为配制A、B流动相，A为乙腈，B为pH3.5的20mmol/L磷酸二氢铵溶液。

将步骤(1)所得氧化液上样于制备色谱柱，运行表2中A、B两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液取样HPLC分析，纯化收率67.4％，式I杂质HPLC纯度98.12％。

(3)转盐

配制A、C流动相，A为乙腈，C为体积分数为0.2％的乙酸水溶液。

将步骤(2)所得洗脱液上样，运行表4中A、C两相梯度洗脱程序，收集洗脱液，HPLC检测，式I杂质HPLC纯度99.40％。

(4)洗脱液的浓缩和冻干

将步骤(3)所得洗脱液减压浓缩除去乙腈，在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥12h，得式I乌拉立肽杂质，总收率为39.6％，HPLC纯度为99.32％。

实施例9乌拉立肽杂质的制备

(1)双氧水氧化

将乌拉立肽纯品(HPLC纯度99.90％)配制成10mg/ml的样品水溶液100ml，加入120ml质量分数为5％的双氧水溶液，室温反应30min得氧化液，取样HPLC分析，氧化收率71.7％。

(2)样品纯化

使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为配制A、B流动相，A为乙腈，B为pH6.5的20mmol/L磷酸二氢铵溶液。

将步骤(1)所得氧化液上样于制备色谱柱，运行表2中A、B两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液取样HPLC分析，纯化收率72.6％，式I杂质HPLC纯度96.77％。

(3)转盐

配制A、C流动相，A为乙腈，C为体积分数为0.2％的乙酸水溶液。

将步骤(2)所得洗脱液上样，运行表4中A、C两相梯度洗脱程序，收集洗脱液，HPLC检测，式I杂质HPLC纯度98.16％。

(4)洗脱液的浓缩和冻干

将步骤(3)所得洗脱液减压浓缩除去乙腈，在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥12h，得式I乌拉立肽杂质，摩尔收率为35.3％，HPLC纯度为98.11％。

实施例10乌拉立肽杂质的检测

将实施例4所得的乌拉立肽杂质进行检测，取样品10mg使用3ml20％乙腈的水溶液溶解，备用检测。

检测条件如下：

色谱柱：Welch-Ultimate-LP-C18-5μm，4.6×250mm；

流动相：a相为20mmol/L硫酸铵溶液与乙腈体积比为9∶1，b相为20mmol/L硫酸铵溶液与乙腈体积比为1∶1，其中20mmol/L硫酸铵溶液使用磷酸调节pH2.0；

检测波长：210nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10μL；

运行表7洗脱梯度表。

乌拉立肽杂质检测图谱见图6。

实施例11乌拉立肽杂质的检测

将实施例4所得的乌拉立肽杂质进行检测，取样品10mg使用2.5ml20％乙腈的水溶液溶解，备用检测。

检测条件如下：

色谱柱：

4.6×250mm；

流动相：a相为30mmol/L磷酸二氢钾溶液与乙腈体积比为7∶3，b相为30mmol/L硫酸铵溶液与乙腈体积比为4∶6，其中30mmol/L硫酸铵溶液使用磷酸调节pHl.5；

检测波长：210nm；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；进样量：10μL；

运行表6洗脱梯度表。

乌拉立肽杂质检测图谱见图7。

实施例12乌拉立肽杂质的检测

将实施例4所得的乌拉立肽杂质进行检测，取样品10mg使用2.0ml20％乙腈的水溶液溶解，备用。

检测条件如下：

色谱柱：普通C18柱，

4.6×250mm；

流动相：a相为0.1％TFA/H₂O溶液，b相为0.1％TFA/ACN溶液；

检测波长：210nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10μL；

运行表8的洗脱梯度。

表8乌拉立肽HPLC检测洗脱梯度表

乌拉立肽杂质检测图谱见图8。

实施例13乌拉立肽纯品的检测

将实施例1-9所用的乌拉立肽纯品进行检测，取样品10mg使用2.5m120％乙腈的水溶液溶解，备用检测。

检测条件如下：

色谱柱：Welch-Ultimate-LP-C18-5μm，4.6×250mm；

流动相：a相为20mmol/L硫酸铵溶液与乙腈体积比为9∶1，b相为20mmol/L硫酸铵溶液与乙腈体积比为1∶1，其中20mmol/L硫酸铵溶液使用磷酸调节pH2.0；

检测波长：210nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10μL；

运行表7洗脱梯度表。

乌拉立肽纯品检测图谱见图9。

实施例14乌拉立肽杂质的检测

将实施例1-9所用的乌拉立肽纯品进行检测，取样品10mg使用2.0m120％乙腈的水溶液溶解，备用。

检测条件如下：

色谱柱：普通C18柱，

4.6×250mm；

流动相：a相为0.1％TFA/H₂O溶液，b相为0.1％TFA/ACN溶液；

检测波长：210nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10μL；

运行表8的洗脱梯度。

乌拉立肽纯品检测图谱见图10。