一种bnp抗原决定簇多肽及其应用
阅读说明：本技术 一种bnp抗原决定簇多肽及其应用 (BNP antigenic determinant polypeptide and application thereof ) 是由 罗奇斌 申玉林 任毅 廖胜光 于 2021-02-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种BNP抗原决定簇多肽及其应用。其中所述BNP蛋白抗原决定簇多肽的氨基酸序列为Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Tyr。本发明所述的BNP蛋白抗原是通过使用所述的抗原决定簇多肽与载体蛋白偶联制备的。本发明所述的BNP蛋白抗体是由所述抗原制备成的单克隆抗体。本发明所述的单克隆抗体可用于制备BNP蛋白检测试剂盒。本发明所述的BNP蛋白抗原决定簇多肽具有良好的抗原性,使用其制备的抗原免疫动物能够产生特异性的抗体,使用其制备的BNP蛋白抗原具有良好的免疫原性,使用其制备的BNP蛋白可以特异性地结合人血清中的BNP,使用其制备的BNP蛋白检测试剂盒可有效检测人血清中的BNP蛋白水平。(The invention provides a BNP antigenic determinant polypeptide and application thereof. The amino acid sequence of the BNP protein antigenic determinant polypeptide is Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Tyr. The BNP protein antigen is prepared by coupling the antigenic determinant polypeptide and a carrier protein. The BNP protein antibody is a monoclonal antibody prepared from the antigen. The monoclonal antibody can be used for preparing a BNP protein detection kit. The BNP protein antigenic determinant polypeptide has good antigenicity, an antigen immune animal prepared by the BNP protein antigenic determinant polypeptide can generate a specific antibody, a BNP protein antigen prepared by the BNP protein antigenic determinant polypeptide has good immunogenicity, a BNP protein prepared by the BNP protein antigenic determinant polypeptide can be specifically combined with BNP in human serum, and a BNP protein detection kit prepared by the BNP protein detection kit can effectively detect the BNP protein level in the human serum.)
技术领域
本发明涉及多肽化学领域，具体为一种BNP抗原决定簇多肽及其应用。
背景技术
急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血硬气的心肌坏死，患者多发生在冠状动脉粥样硬化狭窄基础上，由于某些诱因致使冠状动脉粥样斑块破裂，血中的血小板在破裂的斑块表面聚集，形成血块（血栓），突然阻塞冠状动脉管腔，导致心肌缺血坏死。急性心肌梗死常引发心律失常、休克或心力衰竭等严重临床后果。中国的急性心肌梗死的发病率呈明显上升趋势，每年新发至少50万，现存患者超过200万。
急性心肌梗死具有发病急、预后差和死亡率高的特点，其预后更是降低疾病死亡率的重要环节。因此临床上多使用各种方式进行病情监测和预后评估，脑利钠肽（Brainnatriuretic peptide，BNP）的水平正是监测病情反应预后情况的标志物之一。
BNP是利钠肽家族的成员之一，来源于心脏，是一种心脏激素。BNP于1988首次在猪脑中发现，后来在人的心脏中分离纯化出且发现心脏的分泌量高于脑部。当心肌细胞受到压力或牵拉刺激后，首先形成B型利钠肽原前体（pre-proBNP），pre-proBNP是由134个氨基酸组成的分子，并在心肌细胞内储存，当pre-proBNP在由心肌细胞中向外分泌时或分泌后会被蛋白酶分解为N端的26个氨基酸组成的信号肽和由108个氨基酸组成的B型利钠肽原（proBNP），后者在内切酶的作用下进一步裂解含有32个氨基酸组成的活性B型利钠肽（BNP）和一个由N端76个氨基酸构成的无活性的B型利钠肽（NT-proBNP）。二者均由心肌细胞分泌到血液中，可作为心血管疾病的标志物。但是NT-proBNP临床上使用复杂且易受肾功能影响，因此BNP作为心衰标志物更优于NT-proBNP。
关于BNP的测定，一些方法是通过识别BNP的环状结构，并据此制备对应抗体；另一些方法是能够通过识别包括SEQ ID NO.2：KVLRRH、SEQ ID NO.3：SPKMVQGSGC、SEQ IDNO.4：VQGSGCFGR、SEQ ID NO.5：MDRISSSSGLG在内的一些抗原决定簇人工序列的单克隆抗体来检测BNP含量的。
本发明提出了一种BNP抗原决定簇多肽及其应用，所述的多肽序列区别于任何一种已知的BNP表面抗原决定簇，且具有抗原性和特异性，可用于制备对应的抗体，同时制备出的抗体也具有良好的免疫原性。
发明内容
本发明提供一种BNP抗原决定簇多肽及其应用，所述的抗原决定簇抗原性高特异性强，可用于制备对应的BNP抗原和抗体，同时提供使用该抗原决定簇多肽制备的抗体进行BNP检测的试剂盒。
第一方面，本发明提供一种BNP抗原决定簇多肽，所述抗原决定簇多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Tyr。
人BNP的氨基酸序列全长为32个氨基酸（Swiss-Prot登录号：P16860.1），本发明提供的抗原决定簇多肽对应全长氨基酸序列的第20至27位，并在C末端加上氨基酸Y得到，总计含有9个氨基酸。
上述BNP抗原决定簇多肽的筛选原则为：1. 亲水性强；2. 抗原性强；3. 易于合成。同时本发明提供的BNP抗原决定簇多肽免疫原性强，使用所述抗原决定簇与载体蛋白结合后，可刺激抗原免疫动物制备单克隆抗体，使用该抗原决定簇制备的抗体可以特异性结合人BNP蛋白。
C末端添加氨基酸Y是为了使抗原决定簇通过双偶氮联苯胺（Bis-diazotizedbenzidine，BDB）交联到载体蛋白上，并作为抗原制备抗体。本发明中Y氨基酸加在C末端，最终制备的抗体为抗多肽N端抗体，Y氨基酸也可加在N末端，制备抗多肽C端抗体。
上述BNP抗原决定簇多肽片段可使用固相法合成，合成方法参见实施例1。BNP抗原决定簇多肽分子量为1045.3，可用质谱确定其分子量。
第二方面，本发明提供一种BNP蛋白抗原，所述BNP蛋白抗原是通过使用如第一方面所述的抗原决定簇多肽与载体蛋白偶联制备。
可用的载体蛋白包括血蓝蛋白（Keyhole limpet hemacyanin，KLH）、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）和卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）等。制备方法采用现有成熟技术，参见实施例2。
第三方面，本发明提供一种BNP蛋白抗体，所述BNP蛋白抗体是通过使用如第二方面所述的抗原制备的单克隆抗体。制备方法采用现有成熟技术，参见实施例2。
第四方面，本发明提供一种如第三方面所述BNP蛋白抗体在制备BNP蛋白检测试剂盒上的应用。
第五方面，本发明提供一种BNP蛋白检测试剂盒。
本发明提供的BNP蛋白检测试剂盒优选采用ELISA竞争法测定人BNP蛋白，所述试剂盒包含包被抗体、酶标记的第二抗体等必要试剂。
此外，所述BNP蛋白检测试剂盒还可以包含测定所需的任何试剂或工具，如预包被板、洗涤液、终止液等。
本发明还提供了所述BNP蛋白检测试剂盒在定量测定BNP蛋白中的应用，参见实施例3。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效益：
1. 本发明提供的一种BNP蛋白抗原决定簇多肽具有良好的抗原性，使用其制备的抗原免疫动物能够产生特异性的抗体；
2. 本发明提供的一种BNP蛋白抗原具有良好的免疫原性，可刺激抗原免疫动物发生免疫应答；
3. 本发明提供的一种BNP蛋白抗体可以特异性地结合人血清中的BNP；
4. 本发明提供的一种BNP蛋白检测试剂盒可有效检测人血清中的BNP蛋白水平。
附图说明
图1为BNP蛋白检测试剂盒中BNP标准品浓度与吸光度标准曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明专利的技术内容，特通过以下具体实施方式的描述进一步说明。
本发明所用数据具有相关领域普通技术人员通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，对一些定义和相关术语的解释如下：
如本发明所使用的术语“抗原决定簇”，指决定抗原性的化学基团，多位于抗原物质表面，可以由连续的氨基酸序列或不连续的蛋白质三维结构组成。本文所使用的“抗原决定簇”特指BNP蛋白的抗原决定簇多肽。
实施例1. BNP蛋白抗原决定簇的制备。
本发明所述的BNP蛋白抗原决定簇的制备方法采用化学固相法合成抗原决定簇，原理是将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后依次进行缩合反应并延长肽链，直至抗原决定簇制备完成。
下面具体描述本发明的BNP蛋白抗原决定簇的制备步骤。
1. 试剂与原料：
HMP resin（P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，Wang树脂）；
Fmoc-AA（9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸）；
NMP（氮甲基吡咯烷酮）；
DCM（二氯甲烷）；
MeoH（甲醇）；
Piperidine（哌啶）；
DMAP（二甲基氨基吡啶）；
HOBT（羟基苯并三唑）；
DCC（二环已基碳二亚胺）；
TFA（三氟乙酸）；
EDT（1，2-乙二硫醇）；
硫代苯甲醚；
结晶苯酚；
乙腈。
2. 使用仪器：
多肽自动合成仪；
高效液相色谱仪。
3. 合成方法与过程。
步骤1. Fmoc-AA的活化。
所述Fmoc-AA的结构式如下所示：
可简写为：
所述Fmoc-AA通过与DCC和HOBT反应活化，反应式如下所示：
步骤2. 将活化的氨基酸连接到树脂上。
将所述活化氨基酸与HMP resin在DMAP条件下反应，得到连接上氨基酸的树脂，反应式如下所示：
步骤3. 脱除连接上氨基酸的树脂的Fmoc基团。
在Piperidine的催化作用下，脱除连接上氨基酸的树脂的Fmoc基团，反应式如下所示：
步骤4. 重复步骤1、步骤2，得到另一个活化氨基酸后，将得到的活化氨基酸与步骤3所得的树脂偶联，并脱去偶联后氨基组分中的氨基，反应式如下所示：
步骤5. 重复步骤3、步骤4，至合成结束，得到连接了所有氨基酸的多肽树脂。
步骤6. 使用步骤5中得到的连接了所有氨基酸的多肽树脂，对其进行分离纯化，即可得到具有免疫活性的BNP蛋白抗原决定簇。关于抗原决定簇纯化的步骤如下：
步骤6-1. 使用TFA结合EDT、硫代苯甲醚和水混合的清除剂与步骤5得到的连接了所有氨基酸的多肽树脂反应，将所述具有免疫活性的BNP蛋白抗原决定簇从多肽树脂上分离，反应时间为3小时；
步骤6-2. 除去清除剂，使用乙醚进行萃取，得到具有免疫活性的BNP蛋白抗原决定簇粗品；
步骤6-3. 将具有免疫活性的BNP蛋白抗原决定簇粗品进行纯化，得到具有免疫活性的BNP蛋白抗原决定簇。
其中，所述纯化采用高效液相色谱分离纯化，条件如下表所示：
实施例2. 使用实施例1中得到的BNP抗原决定簇制备单克隆抗体。
将实施例1所得的BNP蛋白抗原决定簇与载体蛋白连接，并制备SNP蛋白抗原，使用所述抗原免疫动物，制备特异性的单克隆抗体。
本发明的BNP蛋白抗体的制备步骤如下： 1.BNP蛋白抗原的制备。
步骤1. 取实施例1中得到的BNP蛋白抗原决定簇2mg，用500μL偶联缓冲液MES（0.1mol/L pH4.5-5.0）溶解。
步骤2. 取载体蛋白（BSA）2mg，用200μL的去离子水溶解。
步骤3. 混合步骤1和步骤2中所得溶液，冷却至0℃，取BDB偶联剂氯化铬200μL（10g/L），室温下过夜反应，4℃透析3天后分装，即得到BNP蛋白抗原（约2g/L），分装并置于-20℃保存。
2. 使用免疫动物制备单克隆抗体。
步骤1. 动物免疫。取制备好的BNP蛋白抗原作为免疫原，雄性Balb/c小鼠作为免疫动物，使用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂来增加BNP蛋白抗原的免疫原性。将等量的所述抗原与弗氏完全佐剂充分混匀乳化后，以50μg/只的剂量皮下多点注射免疫小鼠，完成初次免疫；间隔每隔三周后，将等量的所述抗原与弗氏不完全佐剂充分混匀乳化后，以50μg/只的剂量皮下多点注射免疫小鼠，完成二次免疫；完成三次免疫，七天后采血检测效价，获得免疫小鼠。融合前的三天，腹腔注射不加弗氏佐剂的抗原50μg/只，完成追加免疫。
步骤2. 细胞融合。对步骤1中所得免疫小鼠，开腹取脾，洗涤后剥去周围结缔组织，制成细胞悬液后使用不完全培养基培养，制得单细胞悬液；使用所述单细胞悬液与准备好的骨髓瘤细胞SP2/0以1:10的比例在50%PEG的介导下进行融合，获得融合细胞。
步骤3. 杂交瘤细胞的筛选与克隆培养。将步骤2中所得融合细胞置于培养箱中37℃培养7-9天后，出现较大的细胞克隆，筛选出阳性孔进行克隆化培养，获得杂交瘤细胞，并冻存。
步骤4. 单克隆抗体的生产。使用成年Balb/c小鼠空腹接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.5mL，7-10天后腹腔接种杂交瘤细胞0.5mL/只，间隔一周后采集腹部明显膨大小鼠收集腹水，离心收集上清并分装冻存，即获得所述BNP蛋白抗原决定簇多肽制备的单克隆抗体。
步骤5. 测定抗体效价。所述利用BNP蛋白抗原决定簇多肽制备的单克隆抗体的价效达到1:32000以上.
实施例3. 使用实施例2所得单克隆抗体制备BNP蛋白检测试剂盒。
在本实施例中，使用实施例2中使用BNP蛋白抗原决定簇多肽制备的单克隆抗体作为BNP蛋白检测试剂盒中的包被抗体。
1. 试剂和缓冲液。
包被缓冲液：0.050M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；
洗涤液：pH7.2的10×PBS-Tween20；
稀释液：10×PBS-Tween20（10mL）、FCS（小牛血清）（20mL）、蒸馏水稀释至1000mL，酶稳定剂（1g）、生物防腐剂（1mL）；
底物溶液：柠檬酸缓冲液10mL、10mg/mL TMB缓冲液2mL、5%双氧水200μL、蒸馏水稀释至200mL；
终止液：2M H2SO4。
2. 预包被板制备。 用包被液将实施例2中所述单克隆抗体稀释后，每孔加入100μL稀释后的抗体，低温过夜，甩掉包被液后洗涤，经BSA封闭16小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。
3. 试剂盒的组成。
预包被板：96孔；
BNP冻干标准品：2个；
稀释液：1×50mL；
洗涤液：1×30mL；
HRP酶结合物： 1×20mL；
底物溶液：1×6.0mL；
终止液：1×6.0mL。
4. 试剂盒使用步骤。
将待测样品用稀释液按照1:5比例稀释；将BNP冻干标准品溶于去离子水溶解，浓度为2000pg/mL；用稀释液将标准品溶液依次稀释至梯度为1000、500、250、125、62.5和31.5pg/mL；取等量的待测样品/标准品和60倍稀释的HPR酶结合物混匀后，分别取20μL加到预包被板中，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干；每孔加入200μL底物溶液，37℃孵育60分钟显色；每孔加入100μL终止液终止反应，用酶联检测仪（450nm）检测吸光度。
5. 试剂盒检测结果判定。
根据4中不同浓度的标准品溶液绘制标准品的浓度和吸光度标准曲线，样品浓度与吸光度反相关，样品检测后通过标准曲线计算待测样本的BNP浓度。下表为BNP校准品浓度和对应的平均吸光度值（OD），该平均吸光度值为若干批次的平均吸光度值，仅作为参考使用，实际使用时应当以BNP校准品的实际吸光度值为准。
表1. BNP标准品浓度和对应的平均吸光度（OD）
浓度pg/mL
31.5
62.5
125
250
500
1000
2000
平均吸光度（OD）
1.966
1.591
1.306
0.862
0.568
0.408
0.342
如图1所示，为根据上表中BNP标准品浓度和对应的平均吸光度绘制的标准曲线，标准曲线的拟合优度R2=0.985。
根据4.试剂盒使用步骤和5.试剂盒检验结果判定对94名急性心衰患者和136名健康个体进行血清BNP蛋白检测，检测结果显示如表2所示，心衰患者的血清BNP蛋白含量显著高于健康组（2133.4±327.7 VS. 104.5±13.1，pg/mL），且差异具有统计学意义（P=0.0335）。
表2. 急性心衰患者组与健康组中血清BNP含量比较
另取BNP标准品用培养液稀释3个不同浓度100pg/mL、200pg/mL和400pg/mL，每个浓度加样3个孔，使用4.试剂盒使用步骤和5.试剂盒检验结果判定测定浓度并计算批内和批间变异系数，结果如表3所示。
表3.批内及批间变异系数结果
其中，变异系数是用来衡量重复性的标准，变异系数越小，重复性越好，精密度越高，计算为：变异系数（CV）＝标准差/平均值×100%。
由上述结果可知，本发明的BNP蛋白检测试剂盒能够特异性地检测出血清中BNP含量。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津奇云诺德生物医学有限公司
<120> 一种BNP蛋白抗原决定簇多肽及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Tyr
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Val Leu Arg Arg His
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys
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<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg
1 5
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly
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