一种乌拉立肽的制备方法
阅读说明：本技术 一种乌拉立肽的制备方法 (Preparation method of ularitide ) 是由 汪伟 陈永汉 尹传龙 陶安进 余品香 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种乌拉立肽的制备方法,根据其肽序中含有两个Cys的特点,将乌拉立肽分成片段A：H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-NHNH2、片段B：H-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-NHNH2和片段C：Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH三部分,片段中的酰肼基团分别与亚硝酸钠、MPAA反应生成硫酯,其能够选择性地与N端为Cys的多肽片段发生缩合反应。不同于常规片段法,本发明中的片段侧链没有保护基,在水中有较好的溶解度,不存在偶联困难的问题,得到的产品纯度高,易于纯化,操作简单,生产效率高,产品质量高、成本低、适合工业化生产等。(The invention discloses a preparation method of ularitide, which divides the ularitide into a segment A according to the characteristic that the peptide sequence contains two Cys: H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-NHNH2, fragment B: H-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-NHNH2 and fragment C: Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH, wherein hydrazide groups in the fragments react with sodium nitrite and MPAA respectively to generate thioester, which can selectively perform condensation reaction with polypeptide fragments with Cys at the N end. Different from the conventional fragment method, the fragment side chain in the invention has no protective group, has better solubility in water, does not have the problem of difficult coupling, and the obtained product has high purity, easy purification, simple operation, high production efficiency, high product quality, low cost, suitability for industrial production and the like.)
技术领域
本发明属于制药领域，具体涉及一种乌拉立肽的制备方法。
背景技术
乌拉立肽(Ularitide)是由瑞士Cardiorentis AG公司开发的一款利尿药，具有排钠利尿和扩充血管的作用，可用于失代偿性心力衰竭、急性心力衰竭、急性肾衰竭及支气管哮喘等病症，具有较大的市场前景。其肽序为：H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH(11和27位成二硫键)。
专利US5449751公开了两种制备乌拉立肽的方法：从尿液中提取分离和采用Boc/Bzl策略合成。
专利CN201610947595采用Wang树脂由C端向N端逐个偶联氨基酸，TFA裂解得到线性肽，再经过氧化得到乌拉立肽。
专利CN201511029989采用假脯氨酸二肽Fmoc-Asn(Trt)-Ser(ψMe,MePro)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-Ser(ψMe,MePro)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ψMe,MePro)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-Ser(ψMe,MePro)-OH代替单个氨基酸逐个进行偶联，再经过裂解、氧化得到乌拉立肽。
专利US5449751中介绍的提取方法收率低，成本高；合成方法副反应较多，需要用到危险试剂氢氟酸，纯化困难，产品纯度低。
专利CN201610947595中介绍的方法在偶联过程由于第19位的Ile到第10位的Ser区间内存在肽树脂收缩现象，多个位点氨基酸反应不完全，得到的粗肽纯度低，纯化困难。
专利CN201511029989中介绍的方法虽然能够抑制肽树脂收缩，但作用有限，无法避免因肽链过长所产生的多种缺失肽，同时该假脯氨酸二肽价格昂贵，不易得到。
针对以上问题，本发明提供了一种片段缩合制备乌拉立肽的方法，根据其肽序中含有两个Cys的特点，将乌拉立肽分成片段A(H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-NHNH2)、片段B(H-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-NHNH2)和片段C(Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH)三部分，片段中的酰肼基团分别与亚硝酸钠、MPAA反应生成硫酯，其能够选择性地与N端为Cys的多肽片段发生缩合反应。不同于常规片段法，本发明中的片段侧链没有保护基，在水中有较好的溶解度，不存在偶联困难的问题，得到的产品纯度高，易于纯化，操作简单，生产效率高。
发明内容
为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种乌拉立肽的制备方法。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种乌拉立肽的制备方法，包括以下步骤：
片段A的合成：
H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-NHNH2；
片段B的合成：
H-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-NHNH2；
片段C的合成：
Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH；
片段D的合成：
H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-NHNH2；
线性肽的合成：
H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH；
粗肽的合成。
进一步地，所述片段A或B的合成方法为：以2-Cl-CTC Resin为载体，根据多肽固相合成法，先偶联水合肼，再按照肽序从C端至N端依次偶联氨基酸，最后经过裂解即可得到片段A或B。
进一步地，2-Cl-CTC Resin的替代度为0.1～1.6mmol/g。
进一步地，所述片段C的合成方法为以Wang Resin或2-Cl-CTC Resin为载体，根据多肽固相合成法，按照肽序从C端至N端依次偶联氨基酸，然后裂解即可得到片段C。
进一步地，Wang Resin的替代度为0.1～3.0mmol/g，2-Cl-CTC Resin的替代度为0.1～1.6mmol/g。
进一步地，所述片段D的合成方法为片段A首先在酸性条件下与亚硝酸钠反应生成叠氮化物，再与MPAA反应生成硫酯，最后在中性条件下与片段B反应得到片段D。
进一步地，所述线性肽的合成方法为片段D首先在酸性条件下与亚硝酸钠反应生成叠氮化物，再与MPAA反应生成硫酯，最后在中性条件下与片段C反应得到线性肽。
进一步地，所述粗肽的合成方法为将线性肽溶于醋酸溶液，用碘氧化即可得到乌拉立肽粗肽。
进一步地，所述粗肽的合成步骤后还包括纯化步骤；所述纯化步骤以高压液相色谱法进行纯化。
进一步地，所述高压液相色谱法采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，反相C18柱为固定相，0.1％TFA溶液和乙腈为流动相体系，收集目标馏分，旋转蒸发浓缩，冻干。
乌拉立肽的制备方法，具体包括以下步骤：
片段A的合成：
将2-Cl-CTC Resin加入固相反应柱中，用溶剂洗涤并溶胀树脂后，抽去溶剂；将水合肼和三乙胺在溶剂中溶解，冰浴下加入固相反应柱中，室温反应2小时，抽去溶剂，溶剂洗涤；将Fmoc-Ser(tBu)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，加入固相反应柱中，至反应完全，溶剂洗涤；脱除Fmoc保护基团，溶剂洗涤；按照片段A的肽序，重复上述氨基酸偶联和脱除Fmoc保护基团的步骤，采用偶联剂依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Thr(tBu)-OH；得到的肽树脂用裂解液裂解得到片段A；
优选地，脱除Fmoc保护基团的试剂为20％哌啶溶液，20％哌啶溶液所用的溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，偶联剂为HOBt/DIPCDI、HOBt/PyBop/DIPEA、HBTU/HOBt/DIPEA、HOAt/DIPCDI、HATU/HOAt/DIPEA和HOAt/PyAop/DIPEA中的一种或几种；
优选地，裂解液为含有捕捉剂的TFA溶液，捕捉剂为PhSMe、PhOH、EDT、H2O、TIS、PhOMe中的一种或几种，更优选地，裂解液为TFA/PhSMe/PhOH/EDT/H2O的组合物，其中TFA、PhSMe、PhOH、EDT、H2O的体积比为85：5：5：3：2；
片段B的合成：
操作方法与片段A的合成类似，先偶联水合肼，再依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH和Boc-Cys(Trt)-OH，得到的肽树脂用裂解液裂解得到片段B；
优选地，脱除Fmoc保护基团的试剂为20％哌啶溶液，20％哌啶溶液所用的溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，偶联剂为HOBt/DIPCDI、HOBt/PyBop/DIPEA、HBTU/HOBt/DIPEA、HOAt/DIPCDI、HATU/HOAt/DIPEA和HOAt/PyAop/DIPEA中的一种或几种；
优选地，裂解液为含有捕捉剂的TFA溶液，捕捉剂为PhSMe、PhOH、EDT、H2O、TIS、PhOMe中的一种或几种，更优选地，裂解液为TFA/PhSMe/PhOH/EDT/H2O的组合物，其中TFA、PhSMe、PhOH、EDT、H2O的体积比为85：5：5：3：2；
片段C的合成：
将Wang Resin加入固相反应柱中，用溶剂洗涤并溶胀树脂后，抽去溶剂，将Fmoc-Tyr(tBu)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，加入固相反应柱中，至反应完全，溶剂洗涤；再加入乙酸酐和吡啶的体积比为7:6的混合液封闭树脂6小时，溶剂洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Phe-Wang Resin；参照片段A的合成中的方法，按照片段C的肽序依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH和Boc-Cys(Trt)-OH，得到的肽树脂用裂解液裂解得到片段C；
或将2-Cl-CTC Resin加入固相反应柱中，用溶剂洗涤并溶胀树脂后，抽去溶剂；将Fmoc-Tyr(tBu)-OH溶于溶剂，冰浴下加入DIPEA，加入固相反应柱中，室温反应2小时，溶剂洗涤；再加入甲醇封闭树脂1小时，溶剂洗涤，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Tyr(tBu)-CTCResin；参照片段A的合成中的方法，按照片段C的肽序依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH和Boc-Cys(Trt)-OH，得到的肽树脂用裂解液裂解得到片段C；
优选地，脱除Fmoc保护基团的试剂为20％哌啶溶液，20％哌啶溶液所用的溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，偶联剂为HOBt/DIPCDI、HOBt/PyBop/DIPEA、HBTU/HOBt/DIPEA、HOAt/DIPCDI、HATU/HOAt/DIPEA和HOAt/PyAop/DIPEA中的一种或几种；
优选地，裂解液为含有捕捉剂的TFA溶液，捕捉剂为PhSMe、PhOH、EDT、H2O、TIS、PhOMe中的一种或几种，更优选地，裂解液为TFA和H2O的组合物，其中TFA和H2O的体积比为95：5；
片段D的合成：
将片段A溶于0.3M磷酸氢二钠溶液中，用稀氢氧化钠溶液调节pH＝3，降温至-10℃，缓慢滴加亚硝酸钠溶液，滴完搅拌30分钟，再加入MPAA，用稀氢氧化钠溶液调节pH＝7，最后加入片段B，升温至室温反应，HPLC监测反应完全，加入TCEP终止反应，除去过量的MPAA和TCEP；
线性肽的合成：
将片段D溶于0.3M磷酸氢二钠溶液中，用稀氢氧化钠溶液调节pH＝3，降温至-10℃，缓慢滴加亚硝酸钠溶液，滴完搅拌30分钟，再加入MPAA，用稀氢氧化钠溶液调节pH＝7，最后加入片段C，升温至室温反应，HPLC监测反应完全，加入TCEP终止反应，除去过量的MPAA和TCEP；
粗肽的合成：
称取线性肽溶于体积分数为10％的醋酸溶液中，浓度5mg/ml，缓慢滴加质量分数为1％碘的醋酸溶液，待溶液变黄，停止滴加，HPLC监测反应完全，加入维生素C终止反应即得到乌拉立肽粗肽。
进一步地，洗涤和溶胀的步骤采用的溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
溶解物质的步骤所用的溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种片段缩合制备乌拉立肽的方法，根据其肽序中含有两个Cys的特点，将乌拉立肽分成片段A(H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-NHNH2)、片段B(H-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-NHNH2)和片段C(Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH)三部分，片段中的酰肼基团分别与亚硝酸钠、MPAA反应生成硫酯，其能够选择性地与N端为Cys的多肽片段发生缩合反应。不同于常规片段法，本发明中的片段侧链没有保护基，在水中有较好的溶解度，不存在偶联困难的问题，得到的产品纯度高，易于纯化，操作简单，生产效率高。本发明得到的乌拉立肽的粗肽纯度可得到74.64％，总收率能达到50.2％。经过HPLC纯化精肽纯度可达到99.87％。与现有技术相比，本发明具有产品质量高、成本低、适合工业化生产等特点。
附图说明
图1为乌拉立肽的合成路线图；
图2为乌拉立肽粗肽的HPLC图谱；
图3为乌拉立肽精肽的HPLC图谱。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：
缩写及英文
含义
HOAt
1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
DIPCDI
二异丙基碳二亚胺
HOBt
1-羟基苯并三唑
HATU
2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HBTU
苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐
DIPEA
N,N-二异丙基乙胺
PyBOP
苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基六氟磷酸盐
PyAOP
(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
EDT
乙二硫醇
DMF
N,N-二甲基甲酰胺
NMP
N-甲基吡咯烷酮
THF
四氢呋喃
DCM
二氯甲烷
DMSO
二甲基亚砜
PG
保护基
AA
氨基酸
TFA
三氟乙酸
Fmoc
芴甲氧羰基
PhSMe
茴香硫醚
PhOH
苯酚
TIS
三异丙基硅烷
PhOMe
苯甲醚
MPAA
4-巯基苯乙酸
TCEP
三(2-羧乙基)膦
一种制备乌拉立肽的方法，包括以下步骤：
1、将片段A(H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-NHNH2)和片段B(H-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-NHNH2)缩合得到片段D(H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-NHNH2)：即片段A的C端首先形成硫酯，再与片段B缩合得到片段D。
2、将片段C(Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH)和片段D缩合得到线性肽(H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH)：即片段D的C端首先形成硫酯，再与片段C缩合得到乌拉立肽线性肽。
实施例1：
片段A(H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-NHNH2)的合成
称取替代度为0.5mmol/g的2-Cl-CTC Resin 20.0g(10mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，抽去溶液，称取5.0g(100mmol)水合肼和5.1g(50mmol)三乙胺溶于DMF，冰浴下加入固相反应柱中，室温反应2小时，抽去溶液，DMF洗涤6次。称取19.17g(50mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH、8.1g(60mmol)HOBt和18.96g(50mmol)HBTU溶于DMF，冰浴下加入12.9g(100mmol)DIPEA，加入固相反应柱中，室温反应2小时，DMF洗涤3次。20％哌啶溶液脱除Fmoc保护基团(反应时间5+7分钟)，DMF洗涤6次。
按照片段A的肽序，重复上述氨基酸偶联和脱除Fmoc保护基团的步骤，采用偶联剂HOBt/DIPCDI或HOBt/PyBop/DIPEA或HBTU/HOBt/DIPEA或HOAt/DIPCDI或HATU/HOAt/DIPEA或HOAt/PyAop/DIPEA，依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Thr(tBu)-OH。
得到的肽树脂用TFA/PhSMe/PhOH/EDT/H2O(85:5:5:3:2，体积比)裂解2小时，乙醚沉降、离心，真空干燥得到片段A12.0g，纯度85％，重量收率105％。
实施例2：
片段B(H-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-NHNH2)的合成
操作方法与实施例1类似，先偶联水合肼，再依次偶联依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH和Boc-Cys(Trt)-OH，得到的肽树脂用TFA/PhSMe/PhOH/EDT/H2O(85:5:5:3:2，体积比)裂解2小时，乙醚沉降、离心，真空干燥得到片段得到片段B17.0g，纯度80％，重量收率104％。
实施例3：
片段C(Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH)的合成
称取替代度为0.8mmol/g的Wang Resin 62.5g(50mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，称取45.96g(100mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、16.2g(120mmol)HOBt和12.2g(10mmol)DMAP溶于DMF，冰浴下加入16.4g(130mmol)DIPCDI，加入固相反应柱中，室温反应2小时，DMF洗涤6次。再加入乙酸酐和吡啶混合液(7:6，体积比)封闭树脂6小时，DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到81.4g Fmoc-Phe-Wang Resin，检测替代度为0.4mmol/g。
参照实施例1中的方法，按照片段C的肽序依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH和Boc-Cys(Trt)-OH，得到的肽树脂用TFA/H2O(95:5，体积比)裂解2小时，乙醚沉淀，得到片段C纯度90％，重量收率102％。
或称取替代度为1.1mmol/g的2-Cl-CTC Resin 45.45g(50mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，抽去溶液，称取45.96g(100mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH溶于DMF，冰浴下加入51.7g(400mmol)DIPEA，加入固相反应柱中，室温反应2小时，DMF洗涤6次。再加入15ml甲醇封闭树脂1小时，DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到62.2gFmoc-Tyr(tBu)-CTC Resin，检测替代度为0.8mmol/g。
参照实施例1中的方法，按照片段C的肽序依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH和Boc-Cys(Trt)-OH，得到的肽树脂用TFA/H2O(体积比，95:5)裂解2小时，乙醚沉淀，得到片段C纯度92％，重量收率92％。
实施例4：
片段D(H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-NHNH2)的合成
称取片段A12.0g(10mmol)溶于0.3M磷酸氢二钠溶液于三口瓶中，用稀氢氧化钠溶液调节pH＝3，降温至-10℃，缓慢滴加亚硝酸钠溶液(34.5g，500mmol)，滴完搅拌30分钟，再加入MPAA 100.8g(600mmol)，用稀氢氧化钠溶液调节pH＝7，最后加入片段B17.0g(10mmol)，升温至室温反应，HPLC监测反应完全，加入TCEP终止反应。
将上述溶液经过HPLC简单纯化，除去过量的MPAA和TCEP，即采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，固定相为反相C18柱，0.1％TFA溶液和乙腈为流动相体系，收集目标馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到片段D 28.7g，纯度75.3％。
实施例5：
线性肽(H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH)的合成
称取片段D 28.7g(10mmol)溶于0.3M磷酸氢二钠溶液于三口瓶中，用稀氢氧化钠溶液调节pH＝3，降温至-10℃，缓慢滴加亚硝酸钠溶液(20.3g，300mmol)，滴完搅拌30分钟，再加入MPAA 67.2g(400mmol)，用稀氢氧化钠溶液调节pH＝7，最后加入片段C 8.0g(10mmol)，升温至室温反应，HPLC监测反应完全，加入TCEP终止反应。
将上述溶液经过HPLC简单纯化，除去过量的MPAA和TCEP，即采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，固定相为反相C18柱，0.1％TFA溶液和乙腈为流动相体系，收集目标馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到线性肽36.4g，纯度72.4％。
实施例6：
粗肽的合成
称取线性肽溶于10％的醋酸溶液中，浓度5mg/ml，缓慢滴加1％碘的醋酸溶液，待溶液变黄，停止滴加，HPLC监测反应完全，加入维生素C终止反应。即得到乌拉立肽粗肽，纯度74.64％。
将上述溶液经过HPLC纯化，即采用NOVASEP RP-HPLC系统，波长220nm，固定相为反相C18柱，0.1％TFA溶液和乙腈为流动相体系，收集目标馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽20.0g，纯度99.87％，总收率50.2％。下表为本发明、CN201610947595、CN201511029989所保护的乌拉立肽的制备方法中粗肽纯度、精肽纯度、总收率之间的对比。
专利名称
粗肽纯度
精肽纯度
总收率
CN201610947595
～19％
98％
15％
CN201511029989
～50％
99.2％
40％
本发明
74.64％
99.87％
50.2％
以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳翰宇药业股份有限公司
<120> 一种乌拉立肽的制备方法
<130> CP11901943C
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met
1 5 10 15
Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
20 25 30
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：结肠癌肿瘤特异TCR序列及其应用