一种固液结合合成奈西立肽的制备方法
阅读说明：本技术 一种固液结合合成奈西立肽的制备方法 (Preparation method for synthesizing nesiritide by solid-liquid combination ) 是由 陈永汉 尹传龙 陶安进 袁建成 于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种奈西立肽的制备方法,其包括如下步骤：1)以固相合成方法合成中间体1；2)以固相合成方法合成中间体2,并对中间体2的C端羧基进行活化得到中间体3,并对中间体3脱除侧链保护基,得到中间体4,3)中间体1和中间体4通过二硫键交换反应,形成分子间的二硫键的中间体5；4)中间体5在促环化试剂的作用下形成酰胺键,得到中间体6,然后脱除Fmoc保护基,得到奈西立肽粗产品；5)奈西立肽粗产品进行纯化,得到奈西立肽。本发明采用液相和固相结合的方法,制备效率高,纯度高。(The invention relates to a preparation method of nesiritide, which comprises the following steps: 1) synthesizing an intermediate 1 by a solid-phase synthesis method; 2) synthesizing an intermediate 2 by a solid-phase synthesis method, activating a C-terminal carboxyl group of the intermediate 2 to obtain an intermediate 3, removing a side chain protecting group from the intermediate 3 to obtain an intermediate 4, 3), and forming an intermediate 5 of an intermolecular disulfide bond by performing a disulfide bond exchange reaction on the intermediate 1 and the intermediate 4; 4) forming an amido bond by the intermediate 5 under the action of a cyclization promoting reagent to obtain an intermediate 6, and then removing an Fmoc protecting group to obtain a nesiritide crude product; 5) and purifying the nesiritide crude product to obtain the nesiritide. The invention adopts a method of combining liquid phase and solid phase, and has high preparation efficiency and high purity.)
技术领域
本发明涉及药物合成领域，具体涉及固液结合合成奈西立肽的制备方法。
背景技术
奈西立肽是一类抗心功能不全的药物。是利用重组DNA技术合成的B型利钠肽。通过与利钠钛受体结合。奈西立肽具有明确的扩血管和排钠利尿作用。临床研究表明，这是一个疗效显著、起效快、不良反应少的治疗急性心衰的新药，可改善心衰病人的血流动力学和临床症状。
奈西立肽，英文名称为nesiritide，分子量3464.04，分子式为：Ser1-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys10-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser20-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu-Arg30-Arg-His(Disulfide Bridge:Cys10-Cys26)，其结构如下:
关于奈西立肽的制备方法，US5114923以一种基因工程的方法制备奈西立肽，该方法不利于大规模的生产；
专利CN 101519444 B报道了一种固相逐步偶联制备奈西立肽的方法，肽序中Ser-Ser-Ser-Ser偶联难度大，导致最终产品收率较低；
专利CN 103275207 B报道了采用合成5个肽片段，然后逐步偶联肽片段的方制备奈西立肽。该方法需要合成多个全保护肽片段并进行纯化制备，所需的步骤较多，而且物料需求较大；
专利CN104447979 B报道了采用H-Arg(Boc)2-Arg(Boc)2-His(Trt)-OtBu和全保护奈西立肽1-29肽片段偶联，制备奈西立肽。全保护奈西立肽1-29肽片段采用固相I2氧化方法，会导致全保护肽脱落及其他杂质的形成，影响最终产品的收率。
目前奈西立肽合成的缺点：
1.肽序中有偶联难度较大的Ser19-Ser-Ser-Ser22片段，采用常规固相逐步偶联的合成方法很难避免缺损Ser杂质或消旋杂质的形成；
2.采用固相片段合成方法可以减少缺损杂质或消旋杂质的形成，但是肽片段需要多倍投料，物料成本非常高；
3.采用固相I2氧化的方法，会导致全保护肽脱落及其他杂质的形成，影响最终产品的收率。
发明内容
本发明目的解决现有技术中问题，提供一种固液结合的合成方法合成奈西立肽，完成二硫键形成和肽链的组装，生产时间可以缩短一半，同时可以减少相关缺损杂质和消旋杂质的形成，提高最终产品的收率。
本发明一个方面提供了一种奈西立肽的制备方法，其包括如下步骤：
1)以固相合成方法合成中间体1，中间体1为H-Ser21-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(Npys)-Lys-Val-Leu-Arg30-Arg-His-OH；
2)以固相合成方法合成中间体2，并对中间体2的C端羧基进行活化得到中间体3，并对中间体3脱除侧链保护基，得到中间体4，所述中间体2为Fmoc-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Phe-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH，中间体3为
中间体4为
3)中间体1和中间体4通过二硫键交换反应，形成分子间的二硫键的中间体5，所述中间体5为
4)中间体5在促环化试剂的作用下形成酰胺键，得到中间体6，所述中间体6为，然后脱除Fmoc保护基，得到奈西立肽粗产品；
任选地，5)奈西立肽粗产品进行纯化，得到奈西立肽。
在本发明的技术方案中，促环化试剂选自吡啶/醋酸溶液或三乙胺/醋酸溶液。
在本发明的技术方案中，所述的固相合成方法为在偶联剂的作用下偶联氨基酸或偶联氨基酸与固相合成树脂，以及脱除Fmoc保护基。
在本发明的技术方案中，所述以固相合成方法合成中间体1的方法为将固相合成树脂与Fmoc-His(Trt)-OH通过偶联剂进行偶联，然后脱除Fmoc保护基，通过偶联剂偶联氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH，然后重复脱除Fmoc保护基，偶联氨基酸的步骤，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Npys)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH和Boc-Ser(tBu)-OH，然后脱除Fmoc保护基，并以第一裂解液裂解得到Npys保护Cys侧链的中间体1。优选地，所述第一裂解液选自TFA、苯甲硫醚、苯甲醚和EDT的混合溶液，更优选地，TFA︰苯甲硫醚︰苯甲醚︰EDT的比例为90︰5︰2︰3。
在本发明的技术方案中，所述以固相合成方法合成中间体2的方法为将固相合成树脂与Fmoc-Ser(tBu)-OH通过偶联剂进行偶联，然后脱除Fmoc保护基，通过偶联剂偶联氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH，然后重复脱除Fmoc保护基，偶联氨基酸的步骤，依次偶联Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Pro-OH，然后以第二裂解液裂解得到中间体2。优选地，所述第二裂解液为TFE和DCM的混合溶液，更优选为TFE和DCM的比例为2：8。
在本发明的技术方案中，所述步骤2)中对中间体2的C端羧基进行活化所用的活化试剂为偶联剂与水杨醛的组合，或者偶联剂与水杨醛乙二醇缩醛的组合，或者偶联剂与水杨醛二甲缩醛的组合。优选地，水杨醛或水杨醛乙二醇缩醛或水杨醛二甲缩醛与中间体2的摩尔比例为5:1-15:1，更优选地，7.5：1,10:1,12.5:1。
在本发明的技术方案中，所述步骤2)中对中间体3脱除侧链保护基的试剂为TFA、TIS和H2O的混合液，优选地，TFA、TIS和H2O的比例为80-95:3-10:3-10，更优选地，TFA、TIS和H2O的比例为90:5:5。
在本发明的技术方案中，所述步骤3)中中间体1和中间体4通过二硫键交换反应的条件为将中间体1和中间体4置于溶液中反应，生成二硫键。
在本发明的技术方案中，所述步骤4)中形成酰胺键的条件为在吡啶和醋酸溶液的条件下反应，优选地，吡啶和醋酸的比例为1:8-15。
在本发明的技术方案中，所述步骤4)中脱除Fmoc保护基的条件为以10％-30％(20％)二乙胺的乙腈水溶液脱除Fmoc保护基。
在本发明的技术方案中，所述步骤1)或2)中脱除Fmoc保护基的试剂为DBLK。
在本发明的技术方案中，所述步骤5)中纯化的方法为高效液相色谱纯化。
在本发明的技术方案中，所述的高效液相色谱使用的色谱柱为C18色谱柱。
在本发明的技术方案中，所述的高效液相色谱的步骤为：
i)将粗品上样，梯度洗脱，流动相A为0.1％TFA，流动相B为乙腈，B相洗脱梯度为21％-36％，收集主峰，分别检测，合格馏分浓缩备用，
ii)将步骤i)合格馏分进行上样，梯度洗脱，流动相A为50mol/L磷酸二氢钠，pH为2.5±0.2，流动相B为乙腈，B相洗脱梯度为22％-37％，收集主峰，分别检测，合格馏分浓缩备用，
iii)将步骤i)合格馏分进行上样，梯度洗脱，流动相A为0.1％HAC，流动相B为乙腈，B相洗脱梯度为20％-55％，收集主峰部分，浓缩得到奈西立肽。
在本发明的技术方案中，所述的偶联剂为DIC、DIPCDI、DIPEA、化合物A、化合物B、DIC和化合物A的组合物、DIC和化合物A和化合物B的组合物、DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A和化合物B的组合物，其中化合物A为HOBt或HOAt，化合物B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU。
本发明奈西立肽的制备方法，包括：
A、中间体1合成：
以2-CTC树脂为载体，首先合成Fmoc-His(Trt)-2CTC树脂，然后采用固相Fmoc合成法，从C端到N端合成肽树脂Boc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Npys)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-His(Trt)-2CTC Resin，裂解后得到Npys保护Cys侧链的中间体1：H-Ser21-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(Npys)-Lys-Val-Leu-Arg30-Arg-His-OH
B、中间体2合成：
以2-CTC树脂为载体，首先合成Fmoc-Ser(tBu)-2CTC树脂，然后采用固相Fmoc合成法，从C端到N端合成肽树脂Fmoc-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Phe-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-2CTC Resin，裂解后得到全保护的中间体2：Fmoc-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Phe-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH。
C、中间体4合成：
用水杨醛乙二醇缩醛活化全保护中间体2后，得到C端羧基被活化的全保护中间体3，裂解后得到C端羧基被活化的中间体4。
D、中间体5合成：
中间体1和中间体4通过二硫键交换反应，形成分子间的二硫键的中间体5
E、粗肽合成：
中间体5在吡啶/醋酸溶液的作用下C端的活化酯与N端的氨基反应形成酰胺键，得到中间体6，然后用二乙胺/乙腈溶液脱除Fmoc保护基，得到奈西立肽粗产品。
本发明中所使用的英文缩写的含义。
缩写及英文
含义
Fmoc
9-芴甲氧羰基
2-CTC树脂
2-氯三苯甲基氯树脂
HOBt
1-羟基苯并三唑
DIEA
N,N-二异丙基乙胺
DMAP
4-二甲氨基吡啶
PyBOP
六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基
Boc
叔丁氧羰基
tBu
叔丁基
Trt
三苯甲基
Pbf
2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基
DMF
N,N-二甲基甲酰胺
DCM
二氯甲烷
DBLK
20％六氢吡啶/DMF溶液
TFE
三氟乙醇
TFA
三氟乙酸
DIC
二异丙基碳二亚胺
有益效果
1)本发明采用Fmoc固相合成方法同时合成两条肽片段，可以缩短一半的生产时间。
2)通过二硫键交换形成分子间二硫键，肽片段1的Cys(Npys)与肽片段4的Cys通过二硫键交换形成分子间二硫键，可以提高二硫键配对的准确性，减少高聚物的产生。
3)肽序中有偶联难度较大的Ser19-Ser-Ser-Ser22片段，采用常规固相逐步偶联的合成方法很难避免缺损Ser杂质或消旋杂质的形成；采用液相片段合成方法合成奈西立肽，减少Ser19-Ser-Ser-Ser22片段偶联难度。
附图说明
图1.实施例14的奈西立肽精肽色谱图。
图2.对比实验实施例15的奈西立肽精肽色谱图。
具体实施方式
实施例1、Fmoc-His(Trt)-2CTC树脂的合成
称取替代度为0.8mmol/g的2-CTC树脂(购于天津南开合成科技有限公司)100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取49.2g Fmoc-His(Trt)-OH(80mmol)用320ml DMF溶解，-10℃～0℃下加入27.2ml(80mmol)DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入40mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，之后用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-His(Trt)-2CTC树脂140g，检测替代度为0.452mmol/g。
实施例2、中间体1的合成
称取实施例1制备的替代度为0.452mmol/g的Fmoc-His(Trt)-2CTC44g(20mmol)，加入固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，用DMF溶胀30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。取39.0gFmoc-Arg(Pbf)-OH(60mmol)，9.8g HOBt(72mmol)，溶于120ml体积比为1︰1的DCM和DMF混合溶液中，-10℃～0℃下加入12.1mL DIC(72mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸进行偶联的步骤，按肽片段1的肽序，依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Npys)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH和Boc-Ser(tBu)-OH的偶联。将所得产物用DMF洗涤3次，DCM洗5次，用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到肽树脂72.8g。
将72.8g肽树脂，加入到1000mL反应釜中，按TFA︰苯甲硫醚︰苯甲醚︰EDT＝90︰5︰2︰3的体积比配制裂解试剂730mL，将裂解试剂倒入肽树脂中，室温反应2.5小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用50mL TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到7.3L无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到固体26.0g，纯度86.7％，收率88.6％。
实施例3、Fmoc-Ser(tBu)-2CTC树脂的合成
称取替代度为0.8mmol/g的2-CTC树脂(购于天津南开合成科技有限公司)100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取46.0g Fmoc-Ser(tBu)-OH(120mmol)用320ml DMF溶解，-10℃～0℃下加入10.8ml(120mmol)DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入40mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，之后用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Ser(tBu)-2CTC树脂126g，检测替代度为0.515mmol/g。
实施例4、中间体2的合成
称取实施例3制备的替代度为0.515mmol/g的Fmoc-Ser(tBu)-2CTC 38.8g(20mmol)，加入固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，用DMF溶胀30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。取23.0g Fmoc-Ser(tBu)-OH(60mmol)，9.8g HOBt(72mmol)，溶于120ml体积比为1︰1的DCM和DMF混合溶液中，-10℃～0℃下加入12.2mL DIC(72mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸进行偶联的步骤，按肽片段2的肽序，依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Pro-OH的偶联。将所得产物用DMF洗涤3次，DCM洗5次，用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到肽树脂100.6g。
将100g肽树脂，加入到2000mL反应釜中，按TFE：DCM＝2：8的体积比配制裂解试剂1000mL，将裂解试剂倒入肽树脂中，室温反应2.5小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用100mL DCM洗涤树脂，合并滤液，将滤液旋蒸至150ml，加入到2000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到中间体2固体62.3g，收率80.7％。
实施例5、中间体4合成：
称取实施例4得到的中间体2固体15.4g(4mmol)，PyBOP 2.5g(4.8mmol)，溶于200ml二氯甲烷中，加入DIPEA 0.6g(4.8mmol)和水杨醛2.5g(20mmol)，搅拌反应4小时。减压浓缩反应液至20ml，加入100ml TFA/TIS/H2O(90/5/5,v/v/v)裂解3小时，加入到1000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到9.0g中间体4，纯度74.4％，收率90.2％。
实施例6、中间体4合成：
称取实施例4得到的中间体2固体15.4g(4mmol)，PyBOP 2.5g(4.8mmol)，溶于200ml二氯甲烷中，加入DIPEA 0.6g(4.8mmol)和水杨醛3.75g(30mmol)，搅拌反应4小时。减压浓缩反应液至20ml，加入100ml TFA/TIS/H2O(90/5/5,v/v/v)裂解3小时，加入到1000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到9.2g中间体4，纯度76.6％，收率92.0％。
实施例7、中间体4合成：
称取实施例4得到的中间体2固体15.4g(4mmol)，PyBOP 2.5g(4.8mmol)，溶于200ml二氯甲烷中，加入DIPEA 0.6g(4.8mmol)和水杨醛5.0g(40mmol)，搅拌反应4小时。减压浓缩反应液至20ml，加入100ml TFA/TIS/H2O(90/5/5,v/v/v)裂解3小时，加入到1000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到9.2g中间体4，纯度77.4％，收率92.0％。
实施例8、中间体4合成：
称取实施例4得到的中间体2固体15.4g(4mmol)，PyBOP 2.5g(4.8mmol)，溶于200ml二氯甲烷中，加入DIPEA 0.6g(4.8mmol)和水杨醛乙二醇缩醛5.2g(40mmol)，搅拌反应4小时。减压浓缩反应液至20ml，加入100ml TFA/TIS/H2O(90/5/5,v/v/v)裂解3小时，加入到1000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到9.4g中间体4，纯度76.3％，收率94.0％。
实施例9、中间体4合成：
称取实施例4得到的中间体2固体15.4g(4mmol)，PyBOP 2.5g(4.8mmol)，溶于200ml二氯甲烷中，加入DIPEA 0.6g(4.8mmol)和水杨醛二甲缩醛5.1g(40mmol)，搅拌反应4小时。减压浓缩反应液至20ml，加入100ml TFA/TIS/H2O(90/5/5,v/v/v)裂解3小时，加入到1000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到9.5g中间体4，纯度77.2％，收率95.1％。
实施例10、粗肽合成
称取实施例2得到的中间体1固体4.4g(3mmol)，溶于200ml纯化水中，再称取实施例5中得到的中间体4固体7.4g(3mmol)加入溶液中，室温下搅拌反应1小时得到肽片段5溶液；然后向溶液加入1ml浓度为10mM的吡啶/醋酸溶液(1/12，mol/mol)，室温下搅拌反应4小时，得到中间体6溶液；然后向溶液加入5ml 10％二乙胺的乙腈/水溶液，室温下搅拌4小时，得到奈西立肽粗肽7的水溶液，纯度为72.2％，收率为65.2％。
实施例11、粗肽合成
称取实施例2得到的中间体1固体4.4g(3mmol)，溶于200ml纯化水中，再称取实施例6中得到的中间体4固体7.4g(3mmol)加入溶液中，室温下搅拌反应1小时得到肽片段5溶液；然后向溶液加入1ml浓度为20mM的吡啶/醋酸溶液(1/12，mol/mol)，室温下搅拌反应4小时，得到中间体6溶液；然后向溶液加入5ml 20％二乙胺的乙腈水溶液，室温下搅拌4小时，得到奈西立肽粗肽7的水溶液，纯度为72.8％，收率为64.8％。
实施例12、粗肽合成
称取实施例2得到的中间体1固体4.4g(3mmol)，溶于200ml纯化水中，再称取实施例7中得到的中间体4固体7.4g(3mmol)加入溶液中，室温下搅拌反应1小时得到肽片段5溶液；然后向溶液加入1ml浓度为30mM的吡啶/醋酸溶液(1/12，mol/mol)，室温下搅拌反应4小时，得到中间体6溶液；然后向溶液加入5ml 30％二乙胺的乙腈/水溶液，室温下搅拌4小时，得到奈西立肽粗肽7的水溶液，纯度为70.9％，收率为63.8％。
实施例13、粗肽合成
称取实施例2得到的中间体1固体4.4g(3mmol)，溶于200ml纯化水中，再称取实施例8中得到的中间体4固体7.4g(3mmol)加入溶液中，室温下搅拌反应1小时得到肽片段5溶液；然后向溶液加入1ml浓度为30mM的吡啶/醋酸溶液(1/12，mol/mol)，室温下搅拌反应4小时，得到中间体6溶液；然后向溶液加入5ml 30％二乙胺的乙腈/水溶液，室温下搅拌4小时，得到奈西立肽粗肽7的水溶液，纯度为68.8％，收率为65.0％。
实施例14、奈西立肽纯化制备:
将实施例10中的奈西立肽粗肽溶液使用高效液相制备色谱纯化。
第一步纯化，将200ml溶液过0.45μml滤膜，上样进行制备，制备填料为C18，其中，流动相A为0.1％TFA，流动相B为乙腈，检测波长为230nm，流速220ml/min，B相洗脱梯度为21％-36％(45min)，收集主峰分别检测，将合格馏分旋蒸去掉有机相备用。
第二步纯化，将第一步合格馏分，上样进行制备，制备填料为C18，其中，流动相A为50mol/L磷酸二氢钠，pH为2.5±0.2，流动相B为乙腈，检测波长为230nm，流速220ml/min，B相洗脱梯度为22％-37％(60min)，收集主峰分别检测，将合格馏分旋蒸去掉有机相备用。
第三步转盐：将第二步合格馏分，上样进行转盐，制备填料为C18，其中，流动相A为0.1％HAC，流动相B为乙腈，检测波长为230nm，流速220ml/min，B相洗脱梯度为20％-55％(30min)，收集主峰部分，旋蒸冻干即得到醋酸奈西立肽3.95g，纯度为99.62％，收率38.0％。
实施例15(对比实验)、固相合成奈西立肽
采用100g替代度为0.4mmol/g的2CTC树脂(40mmol)为起始树脂，用100mL DMF洗涤两次，再用100mL DMF溶胀30分钟，取24.6g Fmoc-His(Trt)-OH(40mmol)用250ml DMF溶解，-10℃～0℃下加入13.6ml(40mmol)DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入20mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，之后用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-His(Trt)-2CTC树脂140g，检测替代度为0.225mmol/g。
称取替代度为0.225mmol/g的Fmoc-His(Trt)-2CTC 89g(20mmol)，加入固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，用DMF溶胀30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。取39.0g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(60mmol)，9.8g HOBt(72mmol)，溶于200ml体积比为1︰1的DCM和DMF混合溶液中，-10℃～0℃下加入12.1mL DIC(72mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸进行偶联的步骤，按奈西立肽的肽序，依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Pro-OH的偶联。将所得产物用DMF洗涤3次，DCM洗5次，用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到肽树脂159.2g。
将159.2g肽树脂，加入到2000mL反应釜中，按TFA︰苯甲硫醚︰苯甲醚︰EDT＝90︰5︰2︰3的体积比配制裂解试剂1600mL，将裂解试剂倒入肽树脂中，室温反应2.5小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用150mL TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到16L无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到固体40.2g，纯度56.3％，收率58.0％。
将40.2g粗肽溶解到40L纯化水中，用醋酸/氨水调节pH至7.0-8.0，室温下鼓如氧气，搅拌反应6小时，二硫键氧化完成。
第一步纯化，溶液过0.45μml滤膜，上样进行制备，制备填料为C18，其中，流动相A为0.1％TFA，流动相B为乙腈，检测波长为230nm，流速220ml/min，B相洗脱梯度为21％-36％(45min)，收集主峰分别检测，将合格馏分旋蒸去掉有机相备用。
第二步纯化，将第一步合格馏分，上样进行制备，制备填料为C18，其中，流动相A为50mol/L磷酸二氢钠，pH为2.5±0.2，流动相B为乙腈，检测波长为230nm，流速220ml/min，B相洗脱梯度为22％-37％(60min)，收集主峰分别检测，将合格馏分旋蒸去掉有机相备用。
第三步转盐：将第二步合格馏分，上样进行转盐，制备填料为C18，其中，流动相A为0.1％HAC，流动相B为乙腈，检测波长为230nm，流速220ml/min，B相洗脱梯度为20％-55％(30min)，收集主峰部分，旋蒸冻干即得到醋酸奈西立肽8.4g，纯度98.70％，收率11.8％。
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