一种多肽的制备纯化方法
阅读说明：本技术 一种多肽的制备纯化方法 (Preparation and purification method of polypeptide ) 是由 张贵民 刘�东 李铁健 于 2018-08-21 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,具体公开了一种多肽制备纯化方法。本发明在乌拉立肽制备纯化过程中使用了抑制甲硫氨酸氧化的方法,使得纯化后的乌拉立肽精制品纯度高达99.90％,甲硫氨酸氧化杂质肽控制在0.1％内。(The invention belongs to the technical field of medicines, and particularly discloses a method for preparing and purifying polypeptide. The method for inhibiting methionine oxidation is used in the process of preparing and purifying the ularitide, so that the purity of the purified ularitide refined product is up to 99.90 percent, and the methionine oxidation impurity peptide is controlled within 0.1 percent.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种多肽的制备纯化方法。
背景技术
乌拉立肽的结构为32个氨基酸组成的含有一对分子内二硫键的多肽，一般通过化学合成制得，序列结构为：
H-Thr-Ala-Pro--Arg-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH(S-S)。
乌拉立肽(Ularitide)是从人体尿液中分离出来的一种利钠肽，最初是在1988年由SchulzKnappe等从尿液中分离得到一种属于心房钠尿肽(atrial natriureticpeptide，ANP)家族的肾利钠肽。内源性乌拉立肽在肾远端肾小管细胞合成，由管腔后分泌，在内部髓集合管与下游利钠肽A型受体结合，能够调节肾脏钠和水的***，因此乌拉立肽有舒张血管和利钠利尿的作用，并且已证实乌拉立肽能够降低肾脏对尿液的重吸收。临床上治疗失代偿性心力衰竭(DHF)是以缓解症状和稳定病人的血液动力学为目标，目前使用的治疗药物包括利尿剂、血管舒张药和增强收缩力药物，然而这些药物都存在临床局限性。二期临床研究表明，乌拉立肽能较低心脏充盈压力和改善呼吸困难，且对DHF患者的肾脏功能没有明显的不良影响，可见乌拉立肽在治疗DHF中有广阔前景。
目前，针对乌拉立肽的合成方法，主要有两种，一种是在固相中完成线性肽肽树脂的偶联，然后采用碘固相氧化形成相应的二硫键；另一种方法是先固相合成线性肽前体，然后在浓度非常低的有机溶剂/水溶液中，液相氧化形成相应的二硫键。
前者的合成方法采用Fmoc固相肽合成技术，以Wang树脂为起始原料，依次偶联各个氨基酸残基，得到线性肽树脂，然后加入固体碘单质，氧化形成二硫键，得到氧化后成环的肽树脂，裂解后得到粗品。该合成方法虽然合成步骤简单，但是在偶联肽树脂过程中，部分残基偶联困难，得到粗肽纯度低。同时采用碘在肽树脂上进行氧化，碘在整个过程中共难以完全洗脱，容易导致最终的纯品即原料药中含有微量的碘，导致原料药偏黄色。此外，采用强氧化剂对肽进行氧化，容易破坏肽序自身的二级结构，最终将影响肽本身的生物活性及药效。因此乌拉立肽合成一般采用后者方法。
后者的合成方法中同样采用Fmoc固相肽合成技术，以Wang树脂为起始原料，依次偶联各个氨基酸残基，得到线性肽树脂，线性肽树脂裂解后得到线性肽粗品。粗肽经过HPLC纯化，得到线性肽精肽。线性肽精肽用甲醇或者乙腈溶解，加水稀释空气氧化条件下氧化72h，得到氧化后的环肽粗品。环肽粗品经HPLC纯化后，得到精肽。该方法具有与前者的合成方案相同的缺点，即部分残基偶联困难，线性肽粗品纯度较低。相对前者的优势是，最终产物的空间二级结构能够得到完整的保留，最终精肽的生物活性相对前者要好。但是采用该方案进行氧化，由于乌拉立肽溶解困难，且最终氧化在非常稀的浓度下进行，操作非常困难，同时反应时间长，不利于大规模生产。
乌拉立肽是一种白色或类白色粉末，在水中易溶，常用的单一有机溶剂如甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃中不溶，但可以使用有机溶剂/水混合液，对样品进行溶解。乙腈/水对样品溶解性强于乙醇/水和甲醇/水，且有较高的澄清度，常作为乌拉立肽样品纯化的流动相。国内外专利主要关注多肽合成、产品收率和纯度、生产成本、生产周期等，公开的纯化方法较少。
专利CN103145827中公开一种乌拉立肽的固相合成方法，没有进一步纯化。覃玲莉等(现代药物与临床，2013(28))使用反相高效液相进一步纯化方法得到纯度为98％的乌拉立肽。专利CN106519009中提到使用纯化和转盐的方法获得纯度为98％以上的乌拉立肽，并未进行工艺描述。专利CN106554406和专利CN106554407使用离子液体载体合成和氧化工艺，提高了粗肽纯度，并经过一步反相纯化制得纯度99％以上的乌拉立肽，然而采用离子液体载体成本高昂难以实现工业化。经过分析我们发现现有技术中并没有对氧化过程中的杂质进一步的控制，多肽的常规检测方法并不能有效检测氧化过程杂质，因此在现有技术中的HPLC纯度并不具有指导意义。
肽链中形成二硫键在维持多肽的空间构象及由此决定的生物活性中发挥着重要的作用，形成二硫键的方法很多，大多采用氧化剂氧化，可以采用空气氧化，还可以用二甲亚砜(DMSO)、N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)和氢化碘(ICN)等氧化得到热力学控制的产物。采用较强的氧化剂，如碘、铁***(K3Fe(CN)6)和三氟乙酸铊((CF3COO)3Tl)等氧化则得到动力学控制的产物。铁***(K3Fe(CN)6)和三氟乙酸铊((CF3COO)3Tl)等作为氧化剂，反应复杂而且纯化难以除去，不建议使用。
乌拉立肽制备过程中的氧化步骤是将乌拉立肽序列中的两个半胱氨酸中的巯基通过二硫键氧化成环。然而乌拉立肽中还含有甲硫氨酸，甲硫氨酸中的甲硫基在氧化过程中也将会被氧化生成杂质，导致乌拉立肽结构和功能改变。通过样品跟踪监测，发现乌拉立肽甲硫氨酸氧化物贯穿整个纯化工艺，并在乌拉立肽纯化后期，成为主要杂质成分，在样品冻干后检测可达到2.0～5.0％。甲硫氨酸的氧化反应式如下所示：
甲硫氨酸被活性氧氧化成为甲硫氨酸亚砜，并可被进一步不可逆氧化成甲硫氨酸砜。在多肽的纯化过程中，乌拉立肽纯度越高，甲硫氨酸越容易被氧化。然而这种杂质并不能被一般的多肽检测方法有效检测，所以甲硫氨酸氧化杂质并没有针对性的被研究。目前的多肽药物制备文献和专利中还未有针对多肽氧化物的详细研究，更未见将多肽氨基酸氧化物作为杂质列入质量标准中的案例。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种多肽制备纯化方法，具体来说是提供一种甲硫氨酸氧化杂质可控的多肽制备纯化方法。
本发明提供一种高纯度多肽的制备纯化方法，用以解决上述技术中提出的问题。所述的多肽为乌拉立肽，齐考诺肽，奈西立肽，脑利钠肽，卡培立肽，艾塞纳肽中的一种本发明的方法针对性强，工艺简单，成本低廉，能够有效提高线性肽氧化效率，并检控乌拉立肽甲硫氨酸氧化物至低水平，乌拉立肽纯度可达99.90％以上。
本发明的发明目的是这样实现的：
一种多肽的制备纯化方法，包括如下步骤：
(1)多肽线性肽粗品的溶解和氧化；
(2)氧化液的浓缩；
(3)高效液相制备色谱法纯化；
(4)转盐；
(5)洗脱液的浓缩和冻干。
所述的多肽为乌拉立肽，齐考诺肽，奈西立肽，脑利钠肽，卡培立肽，艾塞纳肽中的一种。
以下就乌拉立肽为例，进行详细阐述本发明技术方案，具体来说包括如下步骤：
(1)将乌拉立肽线性肽粗品溶解在搅拌的缓冲盐-水溶液中，调节pH，进行空气氧化得乌拉立肽氧化液；
(2)根据步骤(1)选择的缓冲盐，使用离子交换树脂或纳滤，进行脱盐浓缩，得浓缩液；
(3)浓缩液上样于高效液相制备色谱柱，以不同体积配比的有机溶剂和缓冲液作为A、B两相流动相梯度洗脱，收集洗脱液；
(4)洗脱液再次上样高效液相色谱柱，采用不同体积配比的有机溶剂和稀酸溶液作为A、C两相流动相进行梯度洗脱，得到乌拉立肽洗脱液。
(5)将上述乌拉立肽洗脱液减压浓缩除去有机溶剂，冻干得乌拉立肽精制品。
优选地，步骤(1)中，所述的缓冲盐为钠盐、钾盐或铵盐，可以是其无机盐或有机盐；所述的无机盐可以为盐酸盐、碳酸盐、磷酸盐或硫酸盐等，所述的有机盐可以是甲酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐等。更加优选地，所述的缓冲盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、碳酸氢钠、硫酸铵、乙酸铵、氯化铵、甲酸钠等。
优选地，步骤(1)所述的缓冲盐的浓度为0.1～5.0mol/L；更加优选地，所述的缓冲盐浓度为1.0～1.5mol/L。
在一个实施例中，步骤(1)所述的pH为6.0～8.0；在另一个实施例中，步骤(1)所述的pH为7.0～8.0，当pH为7.0～8.0与pH6.0～7.0相比，氧化时间明显缩短；在另一个实施例中，步骤(1)所述的pH大于8.0，氧化过程甲硫氨酸氧化杂质明显增大。
优选地，步骤(1)所述的氧化过程，反应温度为20～30℃，空气氧化时间为5～10h，氧化过程中取样检测，当氧化液中不含有半胱氨酸残基时即可停止氧化。
优选地，步骤(2)中，所述的脱盐浓缩过程，可采用离子交换树脂脱盐浓缩，当缓冲盐为一价盐时还可以选择纳滤浓缩，将氧化液浓缩至原体积的1/10～1/8；离子交换树脂优选为阳离子交换树脂。
优选地，步骤(3)中，高效液相制备色谱所用的填料为反相色谱填料，可选择C18键合填料，填料孔径为
优选地，步骤(3)所述的流动相为A、B两种溶液的混合溶液；A相为有机溶剂，B相为缓冲盐溶液；所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇和乙腈中的一种；缓冲盐为钾盐、钠盐或铵盐，可以是无机盐或有机盐。优选地，选自磷酸盐、硫酸盐、甲酸盐和乙酸盐中的一种；更加优选地，所述的缓冲盐为磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、硫酸铵、乙酸铵、甲酸钠等；所述的缓冲盐的浓度为10～100mmol/L；所述缓冲液pH为2.0～7.5。
优选地，步骤(3)所述的流动相，A、B两相的梯度洗脱程序见表1，根据紫外在线检测结果收集洗脱液。
表1纯化过程中的洗脱梯度表
更加优选地，步骤(3)所述的梯度洗脱程表如下表2：
表2纯化过程中的洗脱梯度表
步骤(4)中将步骤(3)所得的洗脱液，继续上样于制备色谱柱进行转盐，梯度洗脱，紫外检测，收集乌拉立肽洗脱液。
所述的转盐步骤所用的流动相为A、C两相混合溶液，其中A相为有机溶剂，可以选自甲醇、乙醇或乙腈中的一种，C相为稀酸溶液，所述的酸为甲酸、乙酸、三氟乙酸或盐酸中的一种，优选地，当所述酸为甲酸或乙酸时，甲酸或乙酸的体积分数为0.1～1.0％，当所述酸为三氟乙酸时，三氟乙酸的体积分数为0.05～0.1％，当所述酸为盐酸时，盐酸的体积分数为0.01～0.05％。A、C两相的梯度洗脱程序见表3。
表3转盐过程中的洗脱梯度表
更加优选地，转盐过程中的洗脱梯度表见下表4。
表4转盐过程中的洗脱梯度表
步骤(5)中，所述的冻干条件为真空度≤10mbar，隔板控温20℃，冻干时间12～36h。
氧化步骤结束后，在后续的步骤(3)～(5)中纯化、转盐和冻干等步骤中需要抑制多肽氧化，优选地，所述方法为调节pH，气体置换、使用无氧水代替纯化水、添加氨基酸保护剂、添加抗氧化剂中的一种或几种。
进一步优选地，通过调节pH抑制多肽氧化，所述的pH为3.0～5.0，所用的酸为甲酸、乙酸、三氟乙酸或盐酸中的一种。
进一步优选地，通过气体置换来抑制多肽氧化，气体置换是指洗脱液收集装置、减压浓缩系统和冻干系统的空气转换，所采用的置换气为高纯氮气或二氧化碳。
进一步优选地，通过使用无氧水来代替纯化水进行抑制多肽氧化，所述的无氧水是一种相对的无氧，制备方法为纯化水加热回流处理后放冷，再使用高纯氮吹除氧气，得无氧水；可应用在步骤(3)或(4)中作为流动相用水。
进一步优选地，通过添加氨基酸保护剂来抑制多肽氧化，所述的氨基酸保护剂为甲硫氨酸、脯氨酸、组氨酸、甘氨酸和赖氨酸中的一种；优选地为甲硫氨酸或赖氨酸。氨基酸保护剂的添加浓度为2.0～10.0mmol/L。
进一步优选地，通过添加抗氧化剂来抑制多肽氧化，所述抗氧化剂选自抗坏血酸、柠檬酸、维生素E和EDTA的一种，优选为柠檬酸或EDTA，抗氧化剂的添加浓度为0.1～0.3mmol/L。
本发明在乌拉立肽氧化后，对其纯化、转盐冻干等步骤，需要选择至少一种或几种方法对乌拉立肽进行氧化抑制。
经过验证，本发明抑制乌拉立肽氧化的方法同样适用于其他含易被氧化甲硫氨酸的多肽，在一个实施例中，利用本发明的方法制备纯化卡培立肽，可使得卡培立肽甲硫氨酸氧化杂质得到有效控制，使得卡培立肽HPLC纯度由98.71％提高至99.85％。在另一个实施例中，利用本发明的方法制备纯化艾塞纳肽，可使得艾塞纳肽甲硫氨酸氧化杂质得到有效控制，使得艾塞纳肽HPLC纯度由98.12％提高至99.56％。
经过验证，本发明抑制乌拉立肽氧化的方法同样适用于齐考诺肽、奈西立肽、脑利钠肽等其他多肽，并且取得相同的技术效果，能使其氧化杂质得到有效控制。
与现有技术相比，本发明取得如下的技术效果：
(1)本发明采用缓冲盐-水溶液来溶解乌拉立肽线性肽粗品，粗品浓度由水溶的0.2mg/ml增加至1.0mg/ml，并将pH调整为6.0～8.0，空气氧化反应时间由24h～48h降低到5～10h，氧化时间大大缩短。
(2)本发明将乌拉立肽氧化后经纯化和转盐两步法纯化可将结构类似物多肽有效的分离除去，纯度高于99.93％。
(3)首次检控乌拉立肽的甲硫氨酸氧化物杂质，采用抑制多肽氧化杂质产生工艺，冻干后使得乌拉立肽精制品纯度达到99.90％，最大单杂多肽甲硫氨酸氧化杂质0.10％。
附图说明
图1是实施例1制备纯化前线性肽粗品氧化液的HPLC图谱；
图2是实施例1转盐后乌拉立肽冻干样品的HPLC图谱；
图3是实施例2转盐后乌拉立肽冻干样品的HPLC图谱；
图4是实施例3转盐后乌拉立肽冻干样品的HPLC图谱；
图5是对比实施例1制备纯化前线性肽粗品氧化液的HPLC图谱；
图6是对比实施例2得到的乌拉立肽冻干样品的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例只是用于例证的目的，不用来限制本发明，这对于本发明所述技术领域的普通技术人员而言是显而易见的。
本发明实施例所使用的乌拉立肽线性肽粗品、卡培立肽线性肽粗品和艾塞那肽粗品均由山东新时代药业有限公司提供，其他现有技术的粗品也同样适用于本发明的方法；其他原料如无特殊说明均可通过商业途径获得。
本发明所使用的高效液相制备色谱柱为50mm×450mm动态轴向压缩制备柱(DAC50柱)，制备色谱柱填料为Sepax-GP-C18-
乌拉立肽的纯化过程和样品杂质分析通过HPLC检测，色谱条件如下：
色谱柱：Welch-Ultimate-LP-C18-5μm,4.6×250mm；
流动相：A相为20mmol/L(NH4)2SO4:ACN＝9:1，B相20mmol/L(NH4)2SO4:ACN＝1:1，其中20mmol/L(NH4)2SO4使用磷酸调节pH2.0；
检测波长：210nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；
梯度洗脱过程运行表5梯度表。
表5乌拉立肽检测过程洗脱梯度表
实施例1乌拉立肽的制备纯化
(1)乌拉立肽线性肽粗品的溶解和氧化
取10.0g线性肽粗品，使用10.0L，pH8.0，1mol/L的乙酸铵水溶液搅拌溶解，于25℃条件下搅拌空气氧化，氧化6h时检测半胱氨酸残基含量为0，停止氧化；HPLC检测氧化液，乌拉立肽HPLC纯度为51.81％，甲硫氨酸氧化杂质(相对保留时间＝0.61)为2.24％(图1)。
(2)氧化液浓缩
对步骤(1)所得乌拉立肽氧化液10.0L进行纳滤浓缩，当浓缩至体积为1.0～1.2L时停止浓缩，乙酸调节浓缩液pH6.0备用。
(3)高效液相色谱法纯化
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Sepax-GP-C18--5μm。配制A、B流动相，其中A为乙腈，B为pH6.0的50mmol/L磷酸二氢钾的无氧水溶液。
将步骤(2)所得pH6.0的浓缩液上样，运行表1中AB两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液经HPLC检测，乌拉立肽HPLC纯度98.48％，甲硫氨酸氧化杂质0.65％。将洗脱液用乙酸调节至pH3.0，待用。
(4)转盐
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Sepax-GP-C18-
将步骤(3)所得pH3.0的乌拉立肽洗脱液上样，运行表2中AC两相梯度洗脱程序，接收瓶做高纯氮气置换，收集洗脱液。HPLC检测得乌拉立肽HPLC纯度为99.93％，甲硫氨酸氧化杂质0.07％。
(5)洗脱液的浓缩和冻干
高纯氮气置换条件下，将转盐后收集的洗脱液减压浓缩除去乙腈，并在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥时间12h得到乌拉立肽精制品3.26g，HPLC纯度为99.90％，甲硫氨酸氧化杂质0.10％(图2)。
实施例2乌拉立肽的制备纯化
(1)乌拉立肽线性肽粗品的溶解和氧化
取10.0g线性肽粗品，使用10.0L，pH6.0，1.5mol/L的磷酸二氢钾水溶液搅拌溶解，于20℃条件下搅拌空气氧化，氧化8h时检测半胱氨酸残基含量为0，停止氧化；HPLC检测氧化液，乌拉立肽HPLC纯度为52.12％，甲硫氨酸氧化杂质2.15％。
(2)氧化液浓缩
对步骤(1)所得乌拉立肽氧化液10.0L，上样D152阳离子交换树脂柱，0.1N盐酸水溶液脱盐洗脱，洗脱体积为1.0～1.2L备用。
(3)高效液相色谱法纯化
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Welch-XB-C18-
将步骤(2)所得pH2.0的浓缩液上样，运行表1中AB两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液经HPLC检测，乌拉立肽HPLC纯度98.66％，甲硫氨酸氧化杂质为0.50％。将洗脱液添加EDTA至洗脱液中含EDTA0.2mmol/L待用。
(4)转盐
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Welch-XB-C18-
将步骤(3)所得pH2.0含EDTA0.2mmol/L的乌拉立肽洗脱液上样，运行表2中AC两相梯度洗脱程序，收集洗脱液。将洗脱液添加EDTA至洗脱液中含EDTA0.1mmol/L。HPLC检测得乌拉立肽HPLC纯度为99.94％，甲硫氨酸氧化杂质0.06％。
(5)洗脱液的浓缩和冻干
高纯二氧化碳置换条件下，将转盐后收集的洗脱液减压浓缩除去甲醇，并在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥时间12h得到乌拉立肽精制品2.78g，HPLC纯度为99.91％，甲硫氨酸氧化杂质0.09％(图3)。
实施例3乌拉立肽的制备纯化
(1)乌拉立肽线性肽粗品的溶解和氧化
取10.0g线性肽粗品，使用10.0L，pH6.5，5.0mol/L的氯化铵水溶液搅拌溶解，于30℃条件下搅拌空气氧化，氧化5h时检测半胱氨酸残基含量为0，停止氧化；HPLC检测氧化液，乌拉立肽HPLC纯度为51.78％，甲硫氨酸氧化杂质2.18％。
(2)氧化液浓缩
对步骤(1)所得乌拉立肽氧化液10.0L进行纳滤浓缩，当浓缩至体积为1.0～1.2L时停止浓缩，稀盐酸调节洗脱浓缩液pH6.0备用。
(3)高效液相色谱法纯化
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Daiso-SP-ODS-
将步骤(2)所得pH6.0的浓缩液上样，运行表1中AB两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液经HPLC检测，乌拉立肽HPLC纯度98.07％，甲硫氨酸氧化杂质0.63％。将洗脱液添加终浓度10mmol/L赖氨酸和0.1mmol/L的EDTA待用。
(4)转盐
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Daiso-SP-ODS-
将步骤(3)所得含赖氨酸10mmol/L的乌拉立肽洗脱液上样，运行表2中AC两相梯度洗脱程序，收集洗脱液，并添加终浓度10mmol/L赖氨酸和0.1mmol/L的EDTA。HPLC检测得乌拉立肽HPLC纯度为99.95％，甲硫氨酸氧化杂质0.05％。
(5)洗脱液的浓缩和冻干
高纯氮气置换条件下，将转盐后收集的洗脱液减压浓缩除去乙醇，并在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥时间12h得到乌拉立肽精制品3.05g，HPLC纯度为99.92％，甲硫氨酸氧化杂质0.08％(图4)。
实施例4乌拉立肽的制备纯化
(1)乌拉立肽线性肽粗品的溶解和氧化
取10.0g线性肽粗品，使用10.0L，pH7.5，1.5mol/L的甲酸钠水溶液搅拌溶解，于30℃条件下搅拌空气氧化，氧化6h时检测半胱氨酸残基含量为0，停止氧化；HPLC检测氧化液，乌拉立肽HPLC纯度为51.86％，甲硫氨酸氧化杂质2.26％。
(2)氧化液浓缩
对步骤(1)所得乌拉立肽氧化液10.0L进行纳滤浓缩，当浓缩至体积为1.0～1.2L时停止浓缩，稀盐酸调节洗脱浓缩液pH4.5备用。
(3)高效液相色谱法纯化
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Agela-Venusil-C18-
将步骤(2)所得pH4.5的浓缩液上样，运行表1中AB两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液经HPLC检测，乌拉立肽HPLC纯度98.74％，甲硫氨酸氧化杂质0.43％。将洗脱液用三氟乙酸调节pH3.0并添加甲硫氨酸至洗脱液中含甲硫氨酸5mmol/L待用。
(4)转盐
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Agela-Venusil-C18--10μm。配制A、C流动相，其中A为乙腈，C为体积分数为0.05％三氟乙酸的无氧水溶液。
将步骤(3)所得pH3.0含甲硫氨酸5mmol/L的乌拉立肽洗脱液上样，运行表2中AC两相梯度洗脱程序，收集洗脱液。HPLC检测得乌拉立肽HPLC纯度为99.94％，甲硫氨酸氧化杂质0.06％。
(5)洗脱液的浓缩和冻干
高纯二氧化碳置换条件下，将转盐后收集的洗脱液减压浓缩除去乙腈，并在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥时间12h得到乌拉立肽精制品2.86g，HPLC纯度为99.90％，甲硫氨酸氧化杂质0.10％。
实施例5乌拉立肽的制备纯化
(1)乌拉立肽线性肽粗品的溶解和氧化
取10.0g线性肽粗品，使用10.0L，pH8.0，1mol/L的碳酸氢钠水溶液搅拌溶解，于30℃条件下搅拌空气氧化，氧化7h时检测半胱氨酸残基含量为0，停止氧化；HPLC检测氧化液，乌拉立肽HPLC纯度为52.03％，甲硫氨酸氧化杂质2.11％，。
(2)氧化液浓缩
对步骤(1)所得乌拉立肽氧化液10.0L，上样D152阳离子交换树脂柱，0.1N盐酸水溶液脱盐洗脱，洗脱体积为1.0～1.2L备用。
(3)高效液相色谱法纯化
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Welch-XB-C18--10μm。配制A、B流动相，其中A为乙腈，B为pH6.0的20mmol/L乙酸铵无氧水溶液。
将步骤(2)所得pH6.0的浓缩液上样，运行表1中AB两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液经HPLC检测，乌拉立肽HPLC纯度98.22％，甲硫氨酸氧化杂质0.39％。向洗脱液加入组氨酸和柠檬酸至洗脱液中含组氨酸2mmol/L，含柠檬酸0.3mmol/L待用。
(4)转盐
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Welch-XB-C18-
将步骤(3)所得含组氨酸和柠檬酸的乌拉立肽洗脱液上样，运行表2中AC两相梯度洗脱程序，收集洗脱液，并向洗脱液加入组氨酸和柠檬酸至洗脱液中含组氨酸2mmol/L，含柠檬酸0.3mmol/L。HPLC检测得乌拉立肽HPLC纯度为99.94％，甲硫氨酸氧化杂质0.06％。
(5)洗脱液的浓缩和冻干
高纯氮气置换条件下，将转盐后收集的洗脱液减压浓缩除去乙腈，并在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥时间12h得到乌拉立肽精制品3.05g，HPLC纯度为99.91％，甲硫氨酸氧化杂质0.09％。
实施例6卡培立肽的制备纯化
(1)卡培立肽线性肽粗品的溶解和氧化
取10.0g线性肽粗品，使用10.0L，pH6.5，1.5mol/L的氯化铵水溶液搅拌溶解，于30℃条件下搅拌空气氧化，氧化7h时检测半胱氨酸残基含量为0，停止氧化；HPLC检测氧化液，卡培立肽HPLC纯度为49.78％，甲硫氨酸氧化杂质2.73％。
(2)氧化液浓缩
对步骤(1)所得卡培立肽氧化液10.0L进行纳滤浓缩，当浓缩至体积为1.0～1.2L时停止浓缩，稀盐酸调节洗脱浓缩液pH6.0备用。
(3)高效液相色谱法纯化
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Daiso-SP-ODS-
将步骤(2)所得pH6.0的浓缩液上样，运行与乌拉立肽相同的表1中AB两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液经HPLC检测，卡培立肽HPLC纯度98.07％，甲硫氨酸氧化杂质0.63％。将洗脱液用稀盐酸调节pH5.0待用。
(4)转盐
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Daiso-SP-ODS-
将步骤(3)所得pH5.0的卡培立肽洗脱液上样，运行与乌拉立肽相同的表2中AC两相梯度洗脱程序，收集洗脱液，并添加终浓度10mmol/L赖氨酸和0.1mmol/L的EDTA。HPLC检测得卡培立肽HPLC纯度为99.88％，甲硫氨酸氧化杂质0.12％。
(5)洗脱液的浓缩和冻干
高纯氮气置换条件下，将转盐后收集的洗脱液减压浓缩除去乙醇，并在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥时间12h得到卡培立肽精制品2.95g，HPLC纯度为99.85％，甲硫氨酸氧化杂质0.15％。
实施例7艾塞纳肽的制备纯化
(1)艾塞那肽粗品的溶解和过滤
取10.0g艾塞那肽粗品，使用2.0L，50mmol/L的乙酸铵水溶液搅拌溶解。对所得艾塞那肽样品液进行0.45μm滤膜过滤。HPLC检测过滤液，艾塞那肽HPLC纯度为39.68％，甲硫氨酸氧化杂质2.35％。
(2)高效液相色谱法纯化
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为YMC-ODS-
将步骤(1)所得样品滤液上样，运行与乌拉立肽相同的表1中AB两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液经HPLC检测，艾塞那肽HPLC纯度97.87％，甲硫氨酸氧化杂质0.53％。将洗脱液添加终浓度10mmol/L甲硫氨酸和0.1mmol/L的EDTA待用。
(3)转盐
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为YMC-ODS-
将步骤(2)所得洗脱液上样，运行与乌拉立肽相同的表2中AC两相梯度洗脱程序，收集洗脱液，并添加终浓度10mmol/L甲硫氨酸和0.1mmol/L的EDTA。HPLC检测得艾塞那肽HPLC纯度为99.68％，甲硫氨酸氧化杂质0.12％。
(4)洗脱液的浓缩和冻干
高纯氮气置换条件下，将转盐后收集的洗脱液减压浓缩除去乙腈，并在真空度≤10mbar，隔板控温20℃，干燥时间10h得到艾塞那肽精制品3.15g，HPLC纯度为99.56％，甲硫氨酸氧化杂质0.18％
对比实施例1乌拉立肽的制备纯化
(1)乌拉立肽线性肽粗品的溶解和氧化
取10.0g线性肽粗品，使用10.0L，pH9.0，1mol/L的乙酸铵水溶液搅拌溶解，于25℃条件下搅拌空气氧化，氧化7h时检测半胱氨酸残基含量为0，停止氧化；HPLC检测氧化液，乌拉立肽HPLC纯度为48.90％，甲硫氨酸氧化杂质(相对保留时间＝0.61)为3.11％(图5)。
(2)氧化液浓缩
对步骤(1)所得乌拉立肽氧化液10.0L进行纳滤浓缩，当浓缩至体积为1.0～1.2L时停止浓缩，乙酸调节浓缩液pH6.0备用。
(4)高效液相色谱法纯化
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Sepax-GP-C18-
将步骤(2)所得pH6.0的浓缩液上样，运行表1中AB两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液经HPLC检测，乌拉立肽HPLC纯度98.17％，甲硫氨酸氧化杂质0.75％。将洗脱液用乙酸调节至pH3.0，待用。
(4)转盐
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Sepax-GP-C18-
将步骤(3)所得pH3.0的乌拉立肽洗脱液上样，运行表2中AC两相梯度洗脱程序，接收瓶做高纯氮气置换，收集洗脱液。HPLC检测得乌拉立肽HPLC纯度为99.92％，甲硫氨酸氧化杂质0.08％。
(6)洗脱液的浓缩和冻干
高纯氮气置换条件下，将转盐后收集的洗脱液减压浓缩除去乙腈，并在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥时间12h得到乌拉立肽精制品2.92g，HPLC纯度为99.81％，甲硫氨酸氧化杂质0.19％。
对比实施例2乌拉立肽的制备纯化
(1)乌拉立肽线性肽粗品的溶解和氧化
取10.0g线性肽粗品，使用10.0L，pH8.0，1mol/L的乙酸铵水溶液搅拌溶解，于25℃条件下搅拌空气氧化，氧化6h时检测半胱氨酸残基含量为0，停止氧化；HPLC检测氧化液，乌拉立肽HPLC纯度为52.21％，甲硫氨酸氧化杂质(相对保留时间＝0.61)为2.17％(图6)。
(2)氧化液浓缩
对步骤(1)所得乌拉立肽氧化液10.0L进行纳滤浓缩，当浓缩至体积为1.0～1.2L时停止浓缩，乙酸调节浓缩液pH6.0备用。
(3)高效液相色谱法纯化
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Sepax-GP-C18-
将步骤(2)所得pH6.0的浓缩液上样，运行表1中AB两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液经HPLC检测，乌拉立肽HPLC纯度98.48％，甲硫氨酸氧化杂质0.67％。
(4)转盐
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Sepax-GP-C18-
将步骤(3)所得pH6.0的乌拉立肽洗脱液上样，运行表2中AC两相梯度洗脱程序，收集洗脱液。HPLC检测得乌拉立肽HPLC纯度为99.59％，甲硫氨酸氧化杂质0.41％。
(5)洗脱液的浓缩和冻干
将转盐后收集的洗脱液减压浓缩除去乙腈，并在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥时间12h得到乌拉立肽精制品3.06g，HPLC纯度为97.42％，甲硫氨酸氧化杂质2.58％(图6)。
对比实施例3乌拉立肽的制备纯化
(1)乌拉立肽线性肽粗品的溶解和氧化
取10.0g线性肽粗品溶解于水中调节pH7～8，于25℃条件下敞口放置搅拌进行空气氧化，氧化48h后，加入质量浓度为30％的双氧水，双氧水的加入量为乌拉立肽线性肽溶液的0.05～0.15％，继续氧化至检测半胱氨酸残基含量为0，停止氧化；HPLC检测氧化液，乌拉立肽HPLC纯度为41.75％，甲硫氨酸氧化杂质(相对保留时间＝0.61)为8.12％。
(2)氧化液浓缩
对步骤(1)所得乌拉立肽氧化液进行纳滤浓缩，当浓缩至体积为原体积的1/10时停止浓缩，乙酸调节浓缩液pH6.0备用。
(3)高效液相色谱法纯化
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Sepax-GP-C18-
将步骤(2)所得pH6.0的浓缩液上样，运行表1中AB两相梯度洗脱程序，设置检测波长，收集制备洗脱液。洗脱液经HPLC检测，乌拉立肽HPLC纯度98.10％，甲硫氨酸氧化杂质0.98％。
(4)转盐
使用DAC50柱，柱外水循环30℃保温，色谱柱填料为Sepax-GP-C18-
将步骤(3)所得pH6.0的乌拉立肽洗脱液上样，运行表2中AC两相梯度洗脱程序，收集洗脱液。HPLC检测得乌拉立肽HPLC纯度为98.66％，甲硫氨酸氧化杂质0.83％。
(5)洗脱液的浓缩和冻干
将转盐后收集的洗脱液减压浓缩除去乙腈，并在真空度≤10mbar，隔板控温10℃，干燥时间12h得到乌拉立肽精制品2.16g，HPLC纯度为96.11％，甲硫氨酸氧化杂质3.89％。
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