阅读说明：本技术 乌拉立肽的制备方法 (Preparation method of ularitide ) 是由 董华建 郭德文 文永均 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种制备高纯度乌拉立肽方法,方法中采用了特殊的保护氨基酸片段：Boc-Thr(tBu)-Ala-Pro-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-OH,缩短了制备工艺周期,提高了规模化制备中产品的纯度和收率。(The invention provides a method for preparing high-purity ularitide, which adopts special protective amino acid fragments: Boc-Thr (tBu) -Ala-Pro-Arg (Pbf) -Ser (tBu) -Leu-Arg (Pbf) -Ser (tBu) -Cys (Trt) -Phe-Gly-OH, shortens the preparation process period and improves the purity and yield of products in large-scale preparation.)

乌拉立肽的制备方法

技术领域

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及乌拉立肽的制备方法。

背景技术

乌拉立肽是存在于血浆及尿液中的内源性利钠肽家族成员之一，该家族包括ANP、BNP、CNP、DNP、血管扩张因子及乌拉立肽。ANP、BNP与乌拉立肽能够通过心房利钠肽受体(NPRA)发挥生理及药理作用，激活鸟苷酸环化酶，增加环鸟苷磷酸(cGMP)水平，触发RAAS系统抑制、血管舒张、纤维化及变松效应(lusitropy)。ANP、BNP及CNP能够与心房利钠肽受体3(NPR-C)结合，实现对血浆中乌拉立肽水平的控制。心脏、肾脏、血管平滑肌细胞及其他器官均有表达NPR-A受体，肾脏远端小管能够合成乌拉立肽，以应对血清钠浓度的升高。乌拉立肽能够在内髓集合管与NPR-A受体结合并发挥生理作用。乌拉立肽与水钠重吸收抑制、尿液及钠***增加、肾小球前血管舒张、肾小球后血管舒张及肾小球滤过率维持有关。临床研究证据显示，乌拉立肽能够作用于肾脏、心脏与血管。因为乌拉立肽与奈西立肽的受体作用途径相同，所以乌拉立肽可能无法带来更好的临床预后，然而，更早针对有害病理机制进行治疗可能转化为良好的长期预后。

乌拉立肽具有以下的结构：

Thr-Ala-Pro-Arg-Ser⁵-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser¹⁰-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg¹⁵-Met-Asp-Arg-Ile-Gly²⁰-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu²⁵-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe³⁰-Arg-Tyr-OH，Cyelic(11，17)-Disulfide

乌拉立肽的制备方法已有很多报道，本发明提供一种高效的乌拉立肽制备方法来制备高纯的产品，以满足医药用途。

发明内容

本发明提供了一种新的高效制备方法，采用Fmoc-Tyr(tBu)树脂为起始树脂，用了特殊的保护氨基酸片段，缩短了制备工艺周期，提高了了规模化制备方法中产品纯度和收率。

本发明提供的乌拉立肽的制备方法，包括：采用Fmoc-Tyr(tBu)树脂为起始树脂，用固相多肽合成法制备，经过多肽固相合成法得到乌拉立肽肽树脂，乌拉立肽肽树脂再经酸解得到乌拉立肽线性肽粗品，再经碘氧化工艺环化，最后经过纯化和冻干，得到乌拉立肽纯品。

其中乌拉立肽多树脂的合成过程中除了使用其他常规的保护氨基酸，同时使用了以下特殊保护氨基酸片段：

Boc-Thr(tBu)-Ala-Pro-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-OH。

乌拉立肽树脂为：

Boe-Thr(tBu)-Ala-Pro-Arg(Pbf)-Ser(tBu)⁵-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)¹⁰-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)¹⁵-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly²⁰-Ala-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Leu²⁵-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe³⁰-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-树脂

上述乌拉立肽的制备方法中，所述的Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～3.5倍。

上述乌拉立肽的制备方法中，所述的Fmoc-Tyr(tBu)树脂是将载体树脂与Fmoc-Tyr(tBu)偶联得到的；其中，所述Fmoc-Gly-树脂的取代值为0.2～1.0mmol/g树脂，优选的取代值为0.3～0.5mmol/g树脂。

进一步优选的，所述载体树脂为Trityl-Cl(三苯甲基氯)类型树脂或羟基类型树脂，其中Trityl-Cl类型树脂优选为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl树脂、4-Methoxytrityl-Cl(4-甲氧基三苯甲基氯)树脂或2-Cl Trity-Cl(2-氯三苯甲基氯)树脂；羟基类型树脂优选为Wang(王)树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂。

作为本发明优选的方案，当载体树脂为三苯甲基氯树脂时，Fmoc-Tyr(tBu)与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Tyr(tBu)的羧基与树脂中的Cl-代烷基在碱的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。

作为本发明优选的方案，当载体树脂为羟基类型树脂时，Fmoc-Tyr(tBu)与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Tyr(tBu)的羧基与树脂中的羟基在偶联剂、活化剂和碱催化剂的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。

作为本发明优选的方案，所述固相偶联合成法为：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应。所述的偶联反应时间为60～300分钟，优选的为100～140分钟。

优选的，乌拉立肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到乌拉立肽粗品：

进一步优选的，所述乌拉立肽树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)和水的混合溶剂；其中，混合溶剂的体积配比为：TFA为80～95％，EDT为1～10％，余量为水。

更进一步优选的，混合溶剂的体积配比为：TFA为89～91％、EDT为4～6％，余量为水。最优的，混合溶剂的体积配比为：TFA为90％、EDT为5％，余量为水。

所述酸解剂用量为每克乌拉立肽树脂需要4～15mL酸解剂；优选的，每克利乌拉立肽树脂需要9～11mL酸解剂。使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～6小时，优选的为3～4小时。

进一步的，乌拉立肽线性肽粗品用醋酸溶解，过滤后用氧化剂氧化环化，得到乌拉立肽粗品溶液。醋酸的体积百分比浓度为20～40％，优选为30％。氧化剂为碘、H₂O₂或DMSO，优选为碘。

进一步的，乌拉立肽粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到乌拉立肽纯品，具体方法为：

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得乌拉立肽纯化中间体浓缩液；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到乌拉立肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得乌拉立肽纯品。

本发明方法直接使用了以下特殊保护氨基酸：

Boc-Thr(tBu)-Ala-Pro-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-OH。

缩短了生产周期，大幅度提高了粗品纯度，提高了产品收率，所得产品纯度大于99.0％，与已有技术相比，本发明工艺更具有广泛的实用价值和应用前景。

具体实施方式

本发明公开了一种合成乌拉立肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。

表1

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1 乌拉立肽树脂的合成

乌拉立肽肽脂树为：

Boc-Thr(tBu)-Ala-Pro-Arg(Pbf)-Ser(tBu)⁵-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)¹⁰-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)¹⁵-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly²⁰-Ala-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Leu²⁵-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe³⁰-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-树脂

用Fmoc-Gly-树脂为起始树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表2所示的保护氨基酸偶联，制得乌拉立肽树脂。本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸或片段如表下所示：

表2

1、接入第2个保护氨基酸

取0.09mol第2个保护氨基酸和0.09mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.09mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。

取0.03mol的Fmoc-Gly-树脂(取代值约0.5mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。

将活化后的第2个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含2个保护氨基酸的树脂。

2、接入第3～20个保护氨基酸或片段

采用上述同样方法，依次接入上述对应的第3～20个保护氨基酸或片段，得利乌拉立肽树脂。

实施例2 乌拉立肽粗品的制备

取实施例1制得的利乌拉立肽树脂，加入体积比为TFA∶水∶EDT＝95∶5∶5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，35～45℃减压干燥得类白色粉。

所得类白色粉末用30％醋酸溶液溶解并制成约3mg/ml的溶液，搅拌下滴加碘/乙醇饱和溶液至完全环化，35～40℃减压浓缩，得阿托西班粗品浓缩溶液，粗品纯度为75.8％。

实施例3 乌拉立肽粗品的纯化

取实施例2制得的乌拉立肽粗品，加水搅拌，用氨水调pH8.5至完全溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得乌拉立肽鲁肽纯化中间体浓缩液；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到乌拉立肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得乌拉立肽纯品42.7g，纯度为99.6％，最大单一杂质0.05％，总收率为40.6％，分子量为3505.9(100％M+H)。

上述实施例表明，本发明提供的方法所得产品纯度大于99.0％，单一杂质均小于0.15％，提高了产品纯度和收率，具有广泛的实用价值和应用前景。