阅读说明：本技术 Car-t细胞体内增殖监测示踪剂及其制备方法和car-t细胞体内增殖的定量方法 (CAR-T cell in vivo proliferation monitoring tracer, preparation method thereof and CAR-T cell in vivo proliferation quantitative method ) 是由 杨敏 缪丽燕 王广基 俞磊 王燕 潘栋辉 王辛宇 于 2019-11-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了CAR-T细胞体内增殖监测示踪剂及其制备方法和CAR-T细胞体内增殖的定量方法,所述示踪剂为<Sup>68</Sup>Ga-DOTA-biotin。为克服直接标记无法监测CAR-T细胞增殖、活化和死亡的不足,同时实现无创、活体、动态、精确定量CAR-T细胞的研究目的,也可为活细胞体内“增殖”药代动力学研究提供新方法。本发明采用<Sup>68</Sup>Ga-DOTA-biotin作为示踪剂对CAR-T细胞进行示踪,开发了一种新的CAR-T细胞增殖监测方法。本发明对CAR-T细胞进行多次成像,同时实现对CAR-T细胞在体内的分布、迁移、增殖、活化的监测,有望明确CART细胞体内作用过程,用于CAR-T免疫治疗疗效预测,预后评估和可视化检测等研究,助力精准靶向的细胞类药物的研发。(The invention discloses a CAR-T cell in vivo proliferation monitoring tracer, a preparation method thereof and a CAR-T cell in vivo proliferation quantitative method 68 Ga-DOTA-biotin. In order to overcome the defect that the proliferation, activation and death of CAR-T cells cannot be monitored by direct labeling, and simultaneously realize the aim of non-invasive, living, dynamic and accurate quantitative research on the CAR-T cells, a new method can be provided for the pharmacokinetics research on the proliferation in vivo of living cells. The invention adopts 68 Ga-DOTA-biotin is used as a tracer to trace the CAR-T cells, and a novel CAR-T cell proliferation monitoring method is developed. The invention images CAR-T cells for multiple times, simultaneously monitors the distribution, migration, proliferation and activation of the CAR-T cells in vivo, and is expected to define CART cellsThe in vivo action process is used for the research of CAR-T immunotherapy curative effect prediction, prognosis evaluation, visual detection and the like, and the research and development of accurate targeted cell medicines are assisted.)

CAR-T细胞体内增殖监测示踪剂及其制备方法和CAR-T细胞体 内增殖的定量方法

技术领域

本发明属于体内细胞检测示踪剂技术领域，具体涉及CAR-T细胞体内增殖监测示踪剂及其制备方法和CAR-T细胞体内增殖的定量方法。

背景技术

全球每年因恶性肿瘤死亡人数为8927.4万人，成为仅次于心脑血管疾病的第二大死因，从2006年到2016年，肿瘤死亡人数增加了17.8％。目前，恶性肿瘤的治疗方法主要有手术、化疗、放疗等多种手段，各种治疗手段均可取得一定治疗效果，但也都存在不足或缺点。肿瘤免疫学治疗作为一种新兴疗法，现已发展成为继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗模式。近年来肿瘤免疫治疗发展迅速，其中最受瞩目的就是2018年美国免疫学家詹姆斯·艾利森(James P Alison)和日本免疫学家本庶佑(Tasuku Honjo)荣获诺贝尔生理学或医学奖以奖励其在肿瘤免疫领域做出的突出贡献。根据不同的作用机制，肿瘤免疫治疗药物分为六类：靶向T细胞免疫调节剂、其他免疫调节剂、肿瘤疫苗、细胞疗法、溶瘤病毒、CD3靶向双特异性抗体等，从2017年9月到2018年9月，细胞疗法在肿瘤免疫治疗领域发展速度最为迅速，增速为113％，其中，处于临床前研究阶段的细胞类药物由179增至448个，处于临床Ⅰ期研究阶段的细胞类药物由112增至176个，处于临床Ⅱ期研究阶段的细胞类药物由109增至227个。肿瘤免疫治疗的嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)由胞外抗原结合区(由来源于单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)组成，中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体、跨膜区域和胞内信号转导区组成。CAR-T疗法是应用患者自身的T淋巴细胞，经过实验室重新改造，装载上具有识别肿瘤抗原的受体及共刺激分子，体外扩增后再次回输入患者体内，从而识别并攻击自身的肿瘤细胞。CART细胞疗法对于血液瘤疗效显著，最为知名的案例是年仅六岁的患有复发难治性白血病的艾米丽·怀特海德(Emily Whitehead)，在2012年成为第一位接受试验性CAR-T疗法的儿童患者，治疗后体内癌细胞完全消失，并且在治疗的7年后仍然健康成长。鉴于CAR-T疗法的突出疗效，2017年8月，全球首个用于治疗25岁以下复发难治性急性B淋巴细胞白血病(r/rB-ALL)的靶向CD19的CAR-T药物(商品名:Kymriah)被美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市。同年10月，治疗复发难治性大B细胞淋巴瘤(r/rLBCL)的CAR-T药物(商品名:Yescarta)获得批准上市。这两种CAR-T疗法药物的上市标志着细胞治疗时代的到来。

血液瘤治疗方面，CART细胞疗效显著，但是绝大部分肿瘤患者为实体瘤，由于缺乏只在肿瘤细胞中存在而不在健康组织表达的特异性靶点，CAR-T治疗在实体瘤治疗中存在靶向性低和毒性大等挑战。如，Her2/ERBB2是通过临床验证的实体瘤单抗药物、抗体偶联药物的靶点，在多种肿瘤组织中极高表达，靶向Her2的CAR-T在第一例临床实验中由于结合并杀伤了肺部少量表达Her2的细胞，导致患者肺功能丧失进而死亡，故实时监测CAR-T细胞进入体内后的分布、增殖及作用靶点等成为了亟待解决的关键问题。体内目前用于监测输注细胞的方法包括与T细胞活化相关的细胞因子的血清分析，外周血中肿瘤特异性T细胞的直接计数及肿瘤活组织活检等，但均无法实现“活细胞”的体内分布及代谢动力学的监测，活体显像是活细胞体内监测的较理想的方法，有望助力活细胞免疫治疗的开发。

临床上广泛使用HSV1-tk作为目的基因用来追踪靶向IL13Rα2和PSMA的CAR T细胞；同时也有报道使用¹⁸F-FHBG作为探针进行PET显像，但面临着成像信号较低和非特异性摄取干扰的问题。因此，目前CAR-T成像的局限性较为明显，为后续CAR-T疗法的临床监测带来许多困难。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

作为本发明其中一个方面，本发明提供一种CAR-T细胞体内增殖监测示踪剂，其中：所述示踪剂由放射性核素通过螯合剂连接biotin组成。

作为本发明所述的CAR-T细胞体内增殖监测示踪剂的一种优选方案：所述螯合剂，包括DOTA、NOTA或NODAGA。

作为本发明所述的CAR-T细胞体内增殖监测示踪剂的一种优选方案：所述放射性核素，包括⁶⁸Ga。

作为本发明所述的CAR-T细胞体内增殖监测示踪剂的一种优选方案：所述示踪剂为⁶⁸Ga-DOTA-biotin。

作为本发明所述的CAR-T细胞体内增殖监测示踪剂的一种优选方案：所述CAR-T细胞，为经SA转导的CAR-T细胞。

作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的CAR-T细胞体内增殖监测示踪剂的方法，其包括，用HCl淋洗ITG 740MBq⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器。

作为本发明所述的CAR-T细胞体内增殖监测示踪剂的方法的一种优选方案：所述用HCl淋洗ITG 740MBq⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器，包括用4mL的0.05mol/L HCl淋洗ITG 740MBq⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器，取淋洗液的峰段2～3mL。

作为本发明所述的CAR-T细胞体内增殖监测示踪剂的方法的一种优选方案：将500L所述淋洗液加入150L 1mol/L NaAc溶液调节pH至4～6，称取50～200g DOTA-biotin粉末，溶于1M的醋酸缓冲溶液中，配制浓度为1～3mg/mL的溶液，混匀震荡。

作为本发明所述的CAR-T细胞体内增殖监测示踪剂的方法的一种优选方案：还包括，将所述淋洗液与100～300L DOTA-biotin溶液混匀，反应10min～30min；所述反应，其温度为室温或95℃。

作为本发明的另一个方面，本发明提供一种CAR-T细胞体内增殖的定量方法：采用权利要求1所述的示踪剂定量CAR-T细胞体内增殖情况。

本发明的有益效果：为克服直接标记无法监测CAR-T细胞增殖、活化和死亡的过程，同时实现非侵入性实时成像CAR-T细胞的研究目的，本发明采用⁶⁸Ga-DOTA-biotin作为示踪剂对CAR-T细胞进行示踪，开发了一种新的CAR-T细胞增殖监测方法。结果发现我们的探针⁶⁸Ga-DOTA-biotin能够对CAR-T细胞进行多次成像，同时实现对CAR-T细胞在体内的分布、迁移、增殖、活化的监测，有望明确CART细胞体内作用过程，用于CAR-T免疫治疗疗效预测，预后评估和可视化检测等研究，助力精准靶向的细胞类药物的研发。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为室温下，在pH2～6条件下反应，测得标记率。

图2为95℃下，在pH2～6条件下反应，测得标记率。

图3为DOTA-biotin用量对标记率的影响。

图4为反应时间对标记率的影响。

图5为室温下反应后，⁶⁸Ga-DOTA-biotin在溶媒中的稳定性。

图6为室温下反应后，⁶⁸Ga-DOTA-biotin在人血清中稳定性。

图7为⁶⁸Ga-DOTA-biotin的细胞摄取与CAR-T细胞数的关系。

图8为随着CAR-T细胞注射体内的时间延长，靶组织处放射性物质摄取值。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

主要仪器与装置：

Mini-Scan TLC薄层放射性扫描仪：美国Bio SCAN公司；Curiementor 3型活度计：德国PTW公司；AC 210S型电子天平：德国Sartorius公司；microPET：德国Simens公司；小动物麻醉机：SAR-830/P型，美国CWE公司。

主要材料与试剂：

DOTA-Biotin:上海优卡迪公司提供；⁶⁸Ga:江苏省原子医学研究所淋洗；盐酸，丙酮:国药集团化学试剂有限公司；异氟烷:上海雅培制药有限公司。

细胞与实验动物：

CAR-T细胞、SA(Streptavidin)转导CAR-T细胞：上海优卡迪公司提供；模型鼠由上海优卡迪公司提供，由江苏省原子能医学研究所实验动物中心清洁级环境IVC系统正常饲养；实验动物使用许可证号：SCXK(苏)2014-0023。

实施例1：

⁶⁸Ga-DOTA-biotin的合成：

用4mL的0.05mol/L HCl淋洗ITG 740MBq⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器，取淋洗液的峰段2mL，取其中500L淋洗液加入150L 1mol/L NaAc溶液调节pH至4，称取200g DOTA-biotin粉末，溶于1M的醋酸缓冲溶液中，配制浓度为1mg/mL的溶液，混匀震荡，将调好pH的淋洗液与200LDOTA-biotin溶液室温(20℃)下混匀，反应10min，无需纯化，标记率和放化纯95％。将反应温度调整为95℃，反应10min，无需纯化，标记率和放化纯>99％。

TLC质控：配制展开剂(丙酮：水＝1：1v/v)，载体为玻璃纤维纸。取反应液点样后吹干，用展开剂展开，利用TLC薄层放射性扫描仪检测标记率。同样方法监测体外6h内稳定性。监测溶媒和血清体系中稳定性，体外稳定性结果显示4h内⁶⁸Ga-DOTA-biotin在溶媒和血清稳定性良好，放化纯>90％。

图1为室温下，在pH2～6条件下反应，测得标记率。图2为95℃下，在pH2～6条件下反应，测得标记率。图3为DOTA-biotin用量对标记率的影响。图4为反应时间对标记率的影响。图5为室温下反应后，⁶⁸Ga-DOTA-biotin在溶媒中的稳定性，图6为室温下反应后，⁶⁸Ga-DOTA-biotin在人血清中稳定性。

⁶⁸Ga-DOTA-biotin在体外与CAR-T细胞结合：

取⁶⁸Ga-biotin溶液分别与3×10⁵、9×10⁵、2.7×10⁶个转导SA的CART细胞在PBS中于37℃水浴锅中孵育30min后用PBS洗三次。γ计数仪/活度计测上清液和细胞内放射性。实验结果见图7。可以看出，⁶⁸Ga-DOTA-biotin的细胞摄取与CAR-T细胞数呈线性关系，随着细胞数目的增加，细胞摄取⁶⁸Ga-DOTA-biotin的剂量也越高，说明示踪剂⁶⁸Ga-DOTA-Biotin体外能够定量细胞数目，可为体内细胞数定量提供方法学支持。

Micro PET显像：

⁶⁸Ga-DOTA-biotin显像时间：使用小动物正电子放射断层显像(Micro PET)对预先已经注射过CAR-T细胞的动物模型小鼠通过尾静脉注射⁶⁸Ga-DOTA-biotin进行显像监测，检测时间点为0～1h动态扫描及2h、4h和6h静态检测，结果发现示踪剂在注射2～4h体内作为CART细胞体内增殖情况监测的时间点最佳。

Micro PET显像数据采用OSEM 3D迭代法重建，使用ASIProVM软件勾画肺、脾、肝脏和瘤等组织为感兴趣区域，根据下列公式计算小鼠每克组织的百分注射剂量率(％ID/g)。

％ID/g＝勾选感兴趣区域放射性物质摄取(μCi/g)/总注射剂量(μCi)×100。定量分析各组织摄取值，使用Gaphpad软件画出趋势图。

Micro PET显像：

注射CAR-T细胞后不同时间点尾静脉注射示踪剂⁶⁸Ga-DOTA-Biotin进行活体显像，勾画肺、肝、脾和瘤组织等为感兴趣区域，计算各组织不同时间点放射性物质摄取值，动态监测考察靶组织CART细胞分布及增殖情况。

Micro PET显像结果：⁶⁸Ga-biotin监测CAR-T细胞动态活体Micro PET成像结果显示，随着CAR-T细胞注射体内的时间延长，靶组织(如肿瘤)处放射性物质摄取值不断升高(见图8)，从图8可以看出，96h后放射性物质在瘤组织摄取值％ID/g为1.2，而作为本底的不注射CART细胞的对照组瘤组织摄取值仅为0.2。结合对照组肿瘤部位非特异性摄取值，能够计算出注射CART细胞后的不同时间点瘤组织中放射性物质的剂量，根据体外细胞与示踪剂的结合实验建立的不同细胞数与放射性剂量之间的关系，可定量计算注射CART细胞不同时间后，CART细胞在瘤组织部位的细胞数。表明利用⁶⁸Ga-DOAT-Biotin示踪剂可动态、无创监测生物体内CAR-T细胞分布，并精确定量增殖情况，能够作为一种新的CAR-T细胞体内增殖监测特异性示踪剂，有极大临床应用前景。

为克服直接标记无法监测CAR-T细胞增殖、活化和死亡的不足，同时实现非侵入性实时成像CAR-T细胞的研究目的，本发明采用⁶⁸Ga-DOTA-biotin作为示踪剂对CAR-T细胞进行示踪，开发了一种新的CAR-T细胞增殖监测方法。结果发现我们的探针⁶⁸Ga-DOTA-biotin能够有效对CAR-T细胞进行多次成像，同时也能够实现对CAR-T细胞在体内的增殖、活化的监测，成像信号大大提高，能够特异性摄取，解决了现有示踪剂成像信号较低和非特异性摄取干扰的问题。有望用于CAR-T免疫治疗疗效预测，预后评估和可视化检测等研究，助力精准靶向的细胞类药物的研发。

对照例1：

将实施例1的示踪剂替换为⁶⁸Ga-DOTA-TATE进行SSRT2(type 2 somatostatinreceptors)的监测，可用于CART细胞显像，但SSRT2非特异性摄取较高，从而影响了定量精度。本发明示踪剂⁶⁸Ga-DOTA-Biotin在小鼠体内非靶组织放射性物质摄取值更低，以ICR小鼠为例，注射⁶⁸Ga-DOTA-TATE后30和60min，肝脏摄取值％ID/g为：1.80±0.62和2.11±0.61，而⁶⁸Ga-DOTA-Biotin注射后30和60min肝脏摄取值％ID/g为：0.99±0.27和0.53±0.22，说明⁶⁸Ga-DOTA-Biotin本底更低，图像质量更佳。

对照例2：

将实施例1的示踪剂替换为¹⁸F-FHBG，同样可用于CART细胞体内增殖监测，但¹⁸F-FHBG合成费用高，需要加速器提供核素¹⁸F，合成工艺复杂且合成效率低(低于20％)，同时利用¹⁸F-FHBG进行活体显像时体内非靶组织摄取(如肝、肠等)较高，非特异性差，只能定性反应增殖情况，难以适应CART细胞需要的精确定量。

综上，本发明采用CART细胞增殖监测的特异性正电子示踪剂⁶⁸Ga-DOTA-Biotin能够实现CART细胞精确定量。根据⁶⁸Ga-DOTA-Biotin体外摄取与不同CART细胞结合的实验结果，可对CART细胞体内分布及增殖情况进行精确定量，其具有示踪剂制备简单，合成效率高，活体显像本底低、特异性强、靶组织摄取更高，定量更准确等优点。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。