具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图,对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例,本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。除非另作定义,此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性,而只是用来区分不同的组成部分。同样,除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一个”“一”或者“该”等类似词语也不表示数量限制,而是表示存在至少一个。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现在“包括”或者“包含”前面的元件或者物件涵盖出现在“包括”或者“包含”后面列举的特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件,并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。“上”“下”“左”“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变后,则该相对位置关系也可能相应地改变。

定义：

PET 正电子断层扫描仪

PMOD 医学分析软件

％ID/g 每克组织的百分注射剂量率

SUV 标准摄取值

活度计 测量放射性核素活度的仪器

μCi 微居里，放射性活度的原用单位

ROI 指图像处理中的术语“感兴趣区”

RCP 放射性化学纯度

SUV 标准摄取值

⁸⁹Zr 锆-89

主要材料与试剂：

iPSC-CM：南京艾尔普再生医学科技有限公司提供；

Oxine：于Sigma Aldrich公司购买；

⁸⁹Zr-oxalate：购于南京安迪科；

⁸⁹Zr-心肌细胞：⁸⁹Zr标记心肌细胞。

食蟹猴，2只，由米度(南京)生物技术有限公司正常饲养；实验动物使用许可证：SYXK(苏)2017-0065。

KM鼠1只，NCG小鼠1只，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，由江苏省原子医学研究所实验动物中心清洁级环境IVC系统正常饲养。所有动物研究均严格遵守国家法律法规，所有动物实验均经江苏省原子医学研究所实验动物管理与伦理委员会批准。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例1、生物体标记区分

1)食蟹猴(非人灵长类动物)组织分布实验

正常食蟹猴2只，雄性，每只食蟹猴都有唯一的动物识别号，分别记为G1-M-01与G2-M-01。本试验中食蟹猴分组和给药方案，详见下表1：

表1

2)昆明(KM)小鼠组织分布实验

正常昆明(KM)小鼠1只，雄性，分别记为KM小鼠。本试验中KM小鼠给药方案，详见下表2：

表2

3)免疫缺陷小鼠(NCG小鼠)组织分布实验

正常NCG小鼠1只，雄性，本试验中NCG小鼠给药方案，详见下表3：

表3

实施例2、细胞复苏

(1)从液氮罐取出需要复苏的细胞原液，包括3组心肌细胞(iPSC-CM)，每组均为8×10⁸个，将其分别放于干冰中暂存；将20％人血白蛋白溶液从4℃冰箱中取出，15～25℃避光平衡10分钟；

(2)在离心管中加入细胞溶媒，所述细胞溶媒按0.9％氯化钠注射液、20％人血白蛋白为3∶1的比例制成，充分混匀后备用；

(3)从干冰中取出细胞原液分别放入冻存管，迅速将冻存管的下1/2没入37℃±1℃水浴中，快速晃动1～2分钟至管中仅剩一小块冰时，将冻存管取出；

(4)用75％酒精擦拭冻存管表面后，使用移液器轻柔吹打5次左右，将每个冻存管中的全部液体分别转移至50mL离心管内；

(5)移液器取1ml细胞溶媒冲洗细胞冻存管，分别将冲洗液缓慢加入上述50ml离心管内；

(6)使用移液器，缓慢加入19mL细胞重悬液，15～25℃，300g离心5min；

(7)离心结束后吸除上清，细胞溶媒重悬后进行计数，加入细胞溶媒将细胞原液稀释至所需浓度，即完成给药制剂。

实施例3、细胞核素标记

取50ul ⁸⁹Zr，测得633uCi；

调节PH＝7，加入200ul HEPES和32.5ul Na₂CO₃，

所述HEPES的浓度为0.1mol/L，Na₂CO₃浓度为1mol/L；

再加入5uL Oxine，所述Oxine的浓度为5ug/uL，得到⁸⁹Zr-Oxine，测得240uCi。

分别取出实施例1中的3组心肌细胞复苏液体，并每组细胞复苏液进行如下标记：

分别取⁸⁹Zr-Oxine至实施例1中3组8×10⁸个心肌细胞中，室温下孵育15min；300g离心1min。

再用5％人血白蛋白重悬，300g离心1min，离心洗涤3次。

分别制得⁸⁹Zr-oxine；与3组⁸⁹Zr-心肌细胞。

受试物给药时稀释液为含5％HSA的生理盐水。

⁸⁹Zr-oxine保存于二甲基亚砜(DMSO)中，给药时DMSO含量≤10％。

实施例4、注射及其PET显像

⁸⁹Zr-心肌细胞在食蟹猴(G1-M-01)心肌注射:给药剂量1×10⁸个细胞/只，注射1.25mL，放射性剂量1.5uCi。通过PET扫描形成第一图像。

⁸⁹Zr-oxine在食蟹猴(G2-M-01)心肌注射:给药剂量1×10⁸个细胞/只，注射1.25mL，放射性剂量1.5uCi。通过PET扫描形成第二图像。

⁸⁹Zr-心肌细胞在KM小鼠心肌注射:给药剂量2×10⁶个细胞/只，注射50uL放射性剂量1uCi。通过PET扫描形成第三图像。

⁸⁹Zr-心肌细胞在NCG小鼠心肌注射:给药剂量5×10⁵个细胞/只，注射200uL，放射性剂量1uCi。通过PET扫描形成第四图像。

第一图像与第二图像在注射后1.5h、2h、4h、8h、24h、2d、3d、8d、14d、21d分别进行PET全身静态扫描。

第三图像与第四图像在注射后1h、4h、6h、16h、24h、40h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h进行PET显像检测。

以上所有扫描时间点原则上与理论时间保持一致，如果有偏差，允许的偏差范围如下:0-4h(含0h及4h)时间点，偏差控制在±5min；4-24h时间点，偏差控制在±10min；≥24h(含24h)时间点，偏差控制在±5％。可实时观测，并减少误差。使用γ计数仪检测反射量，检测细胞组织分布情况

实施例4、勾画主要组织脏器，获取放射性摄取值

PET扫描完成后进行图像重建，采用PMOD软件处理图像及数据，勾画感兴趣区域(ROI)，食蟹猴的感兴趣区域(ROI)包括心脏、肝脏、脾脏、肾脏、全脑、肌肉、膝关节、骨髓和生殖腺等脏器；KM小鼠感兴趣区域(ROI)包括心脏、肺脏、肝脏、脾脏和骨髓；NCG小鼠感兴趣区域(ROI)包括肺脏、肝脏，骨髓和肌肉。获得感兴趣区域(ROI)的放射性活度浓度(即单位体积的放射性活度值)。根据给药剂量计算各脏器每克组织的百分注射剂量率(简称％ID/g值)，或根据动物体重计算各脏器的标准摄取值(简称SUV值)。公式如下：

所述标准摄取值(SUV)，确定SUV方法详细如下：

确定r，其中r是在来自感兴趣区域(ROI)内通过PET扫描完成后进行图像重建，采用PMOD软件处理图像及数据，获得放射性活动浓度(μCi/g)；

确定s，其中s是所注射的受试物的给药剂量(μCi)；

确定w，所述生物体的体重(g)；即，

附图2描述的为标准摄取值(SUV)；附图3、附图5、附图7描述的均为每克组织的百分注射剂量率(简称％ID/g值)，其理论意义一致。

实施例5、PET显像结果与放射性摄取值

验证标记后的心肌细胞、⁸⁹Zr-oxine注入食蟹猴动物体内，示踪细胞的体内分布

G1食蟹猴注射⁸⁹Zr-心肌细胞后，放射性物质主要分布于心、肝脏和脾脏，其次为肺、肾脏、骨关节、骨髓-股骨、骨髓-脊椎和骨髓-胫骨，再次为睾丸和胫骨皮质骨，脑和肌肉分布较低。

G2食蟹猴注射给予⁸⁹Zr-Oxine后，放射性物质主要分布于心、肝脏、脾脏和肾脏，其次为肺和骨髓-脊椎，再次为骨关节和睾丸，骨髓-股骨、骨髓-胫骨、胫骨皮质骨、脑和肌肉分布较低。见附图1

从放射性摄取值及其变化趋势来看，食蟹猴G1、G2分别注射⁸⁹Zr-心肌细胞、⁸⁹Zr-oxine后，肝脏、脾脏、肺、肾脏、骨关节的放射性摄取值有差别：具体如下：

肝脏和脾脏的SUV-平均值(mean)值G1食蟹猴高于G2食蟹猴，且G1食蟹猴肝脏和脾脏的SUV-mean值大体呈现先升后降的趋势，而G2食蟹猴变化不明显；

G1食蟹猴肺的SUV-mean值高于G2食蟹猴，且G1食蟹猴肺的SUV-mean值呈现逐渐下降的趋势，而G2食蟹猴变化不明显；

G1食蟹猴肾脏的SUV-mean低于G2食蟹猴，且G1食蟹猴肾脏的SUV-mean值大体呈现先升后降的趋势，而G2食蟹猴呈现逐渐下降的趋势；

G1食蟹猴肺骨关节的SUV-mean高于G2食蟹猴，两者均呈现先升后降的趋势。详见附图2。

通过对诱导多能干细胞分化的心肌细胞进行标记，将标记后的心肌细胞注入食蟹猴动物体内，借助动物活体成像仪检测细胞注射后放射性标记信号在动物体内的分布，并基于组织中PET扫描图，示踪细胞的体内过程。与单注射⁸⁹Zr-oxine进行对比，表明标记后的心肌细胞注入动物体内，放射性摄取值变化趋势较为明显。

进一步验证⁸⁹Zr标记的心肌细胞注入KM鼠体内的分布

通过附图4可知，KM小鼠注射⁸⁹Zr-心肌细胞：随时间的推移⁸⁹Zr-心肌细胞由心脏向肺，肝，骨等部位转移；心脏摄取量逐渐降低，40h后开始缓慢降低。肝脏先是降低，24h后降低量较小开始趋于平稳。肺部随时间缓慢降低，48h后降低量较小趋于平稳。骨的摄取量随时间逐渐升高，144h后变化量较小。

通过附图3可知，KM小鼠注射⁸⁹Zr-心肌细胞，在动物心脏的摄取量最高，随时间的推移⁸⁹Zr-心肌细胞由心脏逐渐向肺，肝，骨等部位转移。心脏摄取量逐渐降低，48h后开始趋于稳定。肝脏先是降低，24h后降低量较小开始趋于平稳；肺部随时间缓慢降低，48h后降低量较小趋于平稳。在192h时肝脏摄取量是肺部的5.1倍左右。骨的摄取量随时间逐渐升高，144h后变化量较小，在192h达到峰值。在192h时骨的摄取量约是肺部的15.4倍，肝脏的3.0倍。

上述结果表明这种标记后的心肌细胞注入动物体内，放射性摄取值变化趋势同样较为明显。可在生物体内示踪，且具有正常的生物活性，准确反映该细胞的变化过程或分布情况。

进一步验证⁹Zr标记的心肌细胞注入NCG鼠体内的分布

通过附图6可知，NCG小鼠心肌注射⁸⁹Zr-心肌细胞：随时间的推移心肌细胞由肺部逐渐向肝脏，骨等部位转移；肺部的摄取量逐渐降低，48h后开始趋于平稳。肝脏摄取量随时间缓慢升高，48h后趋于平稳。骨部摄取量先是升高，72h后开始降低。

通过附图5可知，NCG小鼠心肌注射⁸⁹Zr-心肌细胞1h后，在动物肺部的摄取量最高，随时间的推移⁸⁹Zr-心肌细胞由肺部逐渐向肝脏，骨部位转移。肺部的摄取量逐渐降低，48h后开始趋于稳定。肝脏摄取量随时间缓慢升高，40h时达到峰值，72h后略微下降，至96h开始保持稳定；在192hr时肝脏摄取量是肺部的1.7倍左右。骨的摄取量在72h达到峰值，之后开始逐渐下降直至192h；在192h时骨的摄取量约是肺部的3.1倍，肝脏的1.8倍。因此可表明这种标记后的心肌细胞注入动物体内，放射性摄取值变化趋势同样较为明显，可准确示踪标记细胞的体内经时分布。

实施例6、细胞组织分布(KM小鼠)

进一步验证活体状态时组织放射物摄取值的准确性

小鼠在192h显像结束后立即处死，取KM鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、关节，使用γ计数仪检测反射量，检测细胞组织分布情况。生物分布：各脏器离体检测；勾图数据：PET活体检测。详细参照附图7。

KM小鼠注射⁸⁹Zr-心肌细胞在192h显像结束后处死，立即取材下心脏、肝脏、脾脏、肺脏、关节，检测组织摄取量。活体检测时，关节摄取值最大，其次是心、肝；在各脏器离体检测时，同样是关节摄取值最大，其次再是是心、肝的摄取值。因此各脏器离体检测与活体检测时具有匹配性。

PET勾画摄取值约为离体心脏摄取值的2倍，PET勾画摄取值约与离体肝脏摄取值没有明显差异，离体脾脏摄取值约为PET勾画摄取值的5倍，离体肺脏摄取值约为PET勾画摄取值的2倍，PET勾画摄取值与离体关节摄取值没有明显差异。见附图7。

综上，本发明实现了对于细胞的早期分布，疗效预测，可视化检测等研究。监测人iPSC来源心肌细胞在体内分布规律，在细胞药物进入机体之后的动态分布和细胞疗效之间建立关系,将有效提高细胞药物的临床疗效,降低风险,减少药物的相互作用。放射性同位素标记是稳定的体内示踪方法，结合活体PET成像分析，为监测细胞在体内分布提供有效作用。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。