阅读说明：本技术 一种澳洲坚果叶片提取物的制备方法及其应用 (Preparation method and application of macadamia nut leaf extract ) 是由 徐斌 施蕊 万举河 卢淼 马宁 李彪 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物天然产物提取领域,具体涉及一种澳洲坚果叶片提取物的制备方法及其应用。本制备方法包括超声辅助的水提醇沉的步骤,并且利用凝胶柱层析将酚酸类物质除去,再经过脱盐处理,可获得多糖含量较高,不含有酚酸类物质的澳洲坚果叶片提取物。该提取方法可以为澳洲坚果叶片的综合利用创造条件,大量的叶片资源可以不再被弃用,可以被用于制备含有植物多糖的食品或者保健品。(The invention belongs to the field of extraction of natural plant products, and particularly relates to a preparation method and application of a macadimia nut leaf extract. The preparation method comprises the steps of water extraction and alcohol precipitation assisted by ultrasound, phenolic acid substances are removed by utilizing gel column chromatography, and the macadimia nut leaf extract with high polysaccharide content and no phenolic acid substances can be obtained through desalination treatment. The extraction method can create conditions for comprehensive utilization of macadimia nut leaves, and a large amount of leaf resources can not be discarded any more, and can be used for preparing food or health care products containing plant polysaccharides.)

一种澳洲坚果叶片提取物的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于植物天然产物提取领域，具体涉及一种澳洲坚果叶片提取物的制备方法及其应用。

背景技术

澳洲坚果(Macadamia integrifolia F.Muell，又名夏威夷果)是一种原产于澳洲的树生坚果。澳洲坚果果仁可用于食品制作，也可用于榨油，青皮可以用作肥料制作，果壳可以用于制备吸附剂等产品。但是占据大量生物量的澳洲坚果叶片资源一直没有得到有效利用，一般在澳洲坚果种植园中，枝叶被修剪之后被原地丢弃，任其腐烂成为果树肥料，既是对环境的污染，也是对资源的浪费。

中国专利“一种澳洲坚果叶绿茶的加工方法”(CN106035882A)提出了一种将澳洲坚果叶片综合利用制备茶叶的方法，将绿茶和乌龙茶的制备工艺结合起来，对澳洲坚果叶片进行精深加工，获得了澳洲坚果叶绿茶。但是现有技术方案存在如下缺陷：澳洲坚果叶片中含有较为大量的多糖成分，直接将叶片制作成茶叶的形式，人体并不能对多糖成分进行有效利用；澳洲坚果叶片的成分与茶叶成分相差较大，澳洲坚果叶片中酚酸类化合物含量较高，这些酚酸类物质具有杀菌抗炎等作用，但是在人体没有疾病的情况下，并不需要过多的摄入此类物质，过多摄入会对肝脏造成负担，也会增加病原微生物对药物的抗性。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种澳洲坚果叶片提取物的制备方法，通过该制备方案获得的叶片提取物中多糖含量高，且酚酸类等多酚类杂质含量低，增加了叶片提取物的食用安全性。

为解决上述技术问题，本发明提出了以下技术方案：

一种澳洲坚果叶片提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：取澳洲坚果叶片，经预处理后，得叶片粉；

步骤(2)：使用乙醇溶液浸泡所述叶片粉，然后过滤取固相，得脱脂叶片粉；将所述脱脂叶片粉加入水中，得水提体系，超声处理所述水提体系，然后离心取液相，得提取液；在提取液中加入活性炭，搅拌后静置，然后过滤取液相，得脱色提取液；将脱色提取液浓缩，然后加入乙醇溶液，静置后离心取固相，得沉淀；

步骤(3)：将沉淀溶于水，过滤取液相，得溶液A；将溶液A的pH值调节至碱性，然后上样于DEAE琼脂糖凝胶层析柱，静置后用水对层析柱进行洗脱，弃洗脱液；再用氯化钠溶液对层析柱进行洗脱，保留洗脱液，得多糖液；将所述多糖液浓缩，得浸膏；

步骤(4)：将浸膏溶于水，过滤取液相，得溶液B；将溶液B上样于葡聚糖凝胶层析柱，静置后用水对层析柱进行洗脱，保留洗脱液，得脱盐多糖液；

步骤(5)：将脱盐多糖液浓缩后，得叶片提取物。

采用上述技术方案，技术原理为：将澳洲坚果叶片粉碎成叶片粉之后，用乙醇溶液浸泡，对叶片粉进行脱脂处理，避免脂类物质对后续多糖提取的影响。然后使用超声辅助水提的方法，对叶片粉中的水溶性物质进行提取。完成提取之后，使用活性炭对提取液进行脱色处理，避免叶绿素等色素对最终产品品质的影响。为了排除水溶性的杂质，将脱色后的提取液进行醇沉处理，进一步富集多糖等目的物质。为了排除酚酸类物质对最终产品的影响，在本方案中加入了DEAE(diethylaminoethyl)琼脂糖凝胶层析步骤，在碱性条件下，酚酸类物质不会吸附在DEAE琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose，二乙基氨基乙基-琼脂糖凝胶)上，使用水洗脱DEAE琼脂糖凝胶层析柱，便可以将酚酸类物质洗脱，而多糖类物质还吸附在层析柱上。接下来使用氯化钠溶液对层析柱进行洗脱，多糖类物质与DEAE琼脂糖凝胶脱吸附，被洗脱下来。通过葡聚糖凝胶(Sephadex)层析脱盐，再经过浓缩干燥，便可以获得叶片提取物。叶片提取物中的多糖含量高，且不含有酚酸类物质。

在本方案中，酚酸类化合物是指在一个苯环上有多个酚羟基取代的芳香羧酸类化合物，其结构不稳定，易发生氧化变质。植物多糖，又称植物多聚糖，是植物细胞代谢产生的聚合度超过10的糖类。

本方案的有益效果在于：

(1)获得多糖含量高的叶片提取物，植物多糖具有多种生物活性，例如，免疫调节、抗肿瘤、降血糖等保健作用。该提取方法可以为澳洲坚果叶片的综合利用创造条件，大量的叶片资源可以不再被弃用，可以被用于制备含有植物多糖的食品或者保健品。

(2)有效去除了多糖中的酚酸类物质，减少了摄入叶片提取物可能会带来的肝毒性，也减少了病原微生物产生药物抗性的几率。由于澳洲坚果叶片成分不同于普通茶叶，其中含有大量的酚酸类物质，直接食用叶片可能会对人体消化道造成一定刺激，甚至会产生一定的毒性作用。所以想要利用澳洲坚果叶片资源制备相关食品或者保健品，需要将酚酸类物质充分去除，以提高叶片提取物的安全性。发明人研究发现，澳洲坚果叶片中的酚酸类物质在碱性条件下与DEAE琼脂糖凝胶不吸附，可以通过这个特点将酚酸类物质和多糖充分分离。而现有技术中将酚酸类物质和多糖分离，需要使用大孔吸附树脂对多糖进行多级纯化和分离，才能将酚酸类物质充分去除，操作复杂、周期长。

(3)酚酸类物质(例如绿原酸等)易发生氧化，从而使叶片提取物颜色发生褐变，影响最终产品的品质。而通过本制备方法将酚酸类物质去除，避免了此类物质对产品色泽的影响。

(4)本制备方法操作简便、安全，生产周期短，提高了澳洲坚果叶片的综合利用率，所得产品多糖纯度高，并适合工业化生产。

进一步，在步骤(1)中，取新鲜的澳洲坚果叶片洗净后阴干，粉碎后获得叶片粉。

采用上述技术方案，将叶片洗净，避免杂质对提取过程的影响；将叶片阴干可以避免叶片中的水分对提取效率的影响；将叶片粉碎，提高了物料与提取液的有效接触面积。

进一步，在步骤(2)中，使用90-98％的乙醇溶液在30-40℃的条件下浸泡所述叶片粉2-3h，叶片粉和乙醇溶液的用量比为1g：(5-8)ml，然后过滤取固相，将乙醇挥发干，得脱脂叶片粉。

采用上述技术方案，可以脱去叶片粉中的部分脂溶性物质，减少这部分脂溶性物质对后续提取步骤的影响，并且提高目的成分的纯度。

进一步，在步骤(2)中，在水提体系中，脱脂叶片粉与水的用量比为1g：(20-30)ml；超声处理的功率为200-300W，时长为60-90min，并维持水提体系的温度为70-80℃；超声处理结束后，3000-4000rpm离心20-30min取液相，得提取液。

采用上述技术方案，可以保证有效地将包括多糖在内的水溶性物质提取出来。如果超声时间过长、功率过高，会加剧分子运动，产生大量热量，破坏目的成分的分子结构，并且其他杂质也不断溶出，从而导致提取率下降。如果超声时间过短、功率过低，细胞结构不能被有效破坏，目的成分不能有效溶出，也会导致提取率下降。

进一步，在步骤(2)中，活性炭在提取液中的质量百分数为2-5％，搅拌时长为20-30min，静置时长为10-20min。

采用上述技术方案，可以充分减少叶绿素等色素对叶片提取物成色的影响，控制搅拌时长在20-30min可以防止多糖物质被活性炭吸附，避免物料损失。

进一步，在步骤(2)中，在浓缩后的脱色提取液中加入95％乙醇溶液，浓缩后的脱色提取液与95％乙醇溶液的体积比为1：(4-6)，然后4-6℃静置24-36h，3000-4000rpm离心20-30min后取固相，得沉淀。

采用上述技术方案，使用95％的乙醇沉淀多糖，可提高最终产品中多糖物质的纯度。

进一步，在步骤(3)中，将溶液A的pH值调节至7.8-8.5，然后上样于DEAE琼脂糖凝胶层析柱，静置1.5-2h后用6-8倍柱体积的水对层析柱进行洗脱，弃洗脱液；再用2-3倍柱体积的0.1-0.5mol/L的氯化钠溶液对层析柱进行洗脱，保留洗脱液，得多糖液。

采用上述技术方案，可以除去多糖中的酚酸类物质。发明人研究发现，pH值在7.8-8.5时，澳洲坚果叶片中的酚酸类物质与DEAE琼脂糖凝胶不吸附，但是多糖类物质可以很好地吸附在DEAE琼脂糖凝胶上。先使用水将酚酸类物质洗脱下来，再使用盐溶液将多糖洗脱下来，可以实现酚酸类物质和多糖的有效分离。pH值低于7.8会引起酚酸类物质微量的吸附在凝胶上，不能达到较好的分离效果；而pH值过高容易使部分多糖发生水解，破坏多糖的活性结构、减少多糖得率。

进一步，在步骤(3)中，将沉淀溶于水时，沉淀和水的用量比为(10-20)mg：1ml；溶液A的上样速度为20-30ml/min；使用水对层析柱进行洗脱的流速为9-15ml/min；使用氯化钠溶液对层析柱进行洗脱的流速为7-12ml/min。

采用上述技术方案，可实现水对酚酸类物质的充分洗脱，以及实现氯化钠溶液对多糖类物质的充分收集。

进一步，在步骤(4)中，将溶液B上样于葡聚糖凝胶层析柱，静置1-2h后用3-4倍柱体积的水对层析柱进行洗脱，水的流速为0.7-1.2ml/min，保留洗脱液，得脱盐多糖液。

采用上述技术方案，可将上一步氯化钠溶液洗脱带来的盐类杂质去除，提高最终产品的纯度。

进一步，一种澳洲坚果叶片提取物的制备方法在制备食品中的应用。

采用上述技术方案，由本法提取获得的叶片提取物含有大量多糖物质，多糖物质具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖等保健作用。而且由本法获得的叶片提取物除去了酚酸类杂质，使得叶片提取物更加安全。对叶片提取物进行精深加工，可获得具有免疫调节功能的食品或保健食品。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明，其中：

实施例1：澳洲坚果叶片提取物制备实例

澳洲坚果叶片提取物的制备步骤如下：

一种澳洲坚果叶片提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：取新鲜的澳洲坚果叶片洗净后阴干，粉碎后过40目获得叶片粉。

步骤(2)：使用95％的乙醇溶液在40℃的条件下浸泡叶片粉2h，叶片粉和乙醇溶液的用量比为1g：8ml，然后过滤取固相，挥干乙醇，得脱脂叶片粉。

将脱脂叶片粉加入水中，脱脂叶片粉与水的用量比为1g：25ml，得水提体系，超声处理水提体系，超声处理过程中维持水提体系的温度为70℃，超声处理的功率为250W，时长为80min。超声处理完成之后，3500rpm离心30min取液相，得提取液。在提取液中加入活性炭，活性炭在提取液中的质量百分数为2％，搅拌30min后静置10min，然后过滤取液相，得脱色提取液。

使用减压蒸馏装置(

R-300，BUCHI)，在压强0.05MPa和温度45℃的条件下，将脱色提取液浓缩至原体积的一半，然后在浓缩后的脱色提取液中加入95％乙醇溶液，浓缩后的脱色提取液与95％乙醇溶液的体积比为1：5。然后4℃静置24h，4000rpm离心20min后取固相，得沉淀。

步骤(3)：将沉淀溶于水，沉淀和水的用量比为20mg：1ml，过滤取液相，得溶液A；将溶液A的pH值调节至8.0，然后上样于DEAE琼脂糖凝胶层析柱(型号为DEAE-Sepharose FastFlow柱(40mm×20cm))，上样速度为20ml/min。再静置1.5h后用7倍柱体积的水对层析柱进行洗脱，使用水对层析柱进行洗脱的流速为12ml/min，弃洗脱液。再使用3倍柱体积的0.5mol/L的氯化钠溶液对层析柱进行洗脱，使用氯化钠溶液对层析柱进行洗脱的流速为10ml/min，保留洗脱液，得多糖液。使用减压蒸馏装置，在压强0.05MPa和温度45℃的条件下，浓缩处理4h，将多糖液浓缩成浸膏；

步骤(4)：将浸膏溶于水，浸膏和水的用量比为20mg：1ml，过滤取液相，得溶液B。将溶液B上样于葡聚糖凝胶层析柱(型号为：Sephadex-G25(26mm×50cm))，上样速度为2.5ml/min。静置2h后用水对层析柱进行洗脱，水的流速为1.0ml/min，保留洗脱液，得脱盐多糖液。

步骤(5)：使用减压蒸馏装置，在压强0.05MPa和温度45℃的条件下，将脱盐多糖液蒸干，获得干粉状物质，即为叶片提取物。

实施例2：澳洲坚果叶片提取物制备实例

澳洲坚果叶片提取物的制备步骤如下：

一种澳洲坚果叶片提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：取新鲜的澳洲坚果叶片洗净后阴干，粉碎后过40目获得叶片粉。

步骤(2)：使用98％的乙醇溶液在30℃的条件下浸泡叶片粉3h，叶片粉和乙醇溶液的用量比为1g：8ml，然后过滤取固相，挥干乙醇，得脱脂叶片粉。

将脱脂叶片粉加入水中，脱脂叶片粉与水的用量比为1g：20ml，得水提体系，超声处理水提体系，超声处理过程中维持水提体系的温度为75℃，超声处理的功率为200W，时长为60min。超声处理完成之后，3000rpm离心20min取液相，得提取液。在提取液中加入活性炭，活性炭在提取液中的质量百分数为4％，搅拌30min后静置20min，然后过滤取液相，得脱色提取液。

使用减压蒸馏装置(Rotavapor R-300，BUCHI)，在压强0.05MPa和温度45℃的条件下，将脱色提取液浓缩至原体积的一半，然后在浓缩后的脱色提取液中加入95％乙醇溶液，浓缩后的脱色提取液与95％乙醇溶液的体积比为1：6。然后6℃静置36h，4000rpm离心20min后取固相，得沉淀。

步骤(3)：将沉淀溶于水，沉淀和水的用量比为15mg：1ml，过滤取液相，得溶液A；将溶液A的pH值调节至8.5，然后上样于DEAE琼脂糖凝胶层析柱(型号为DEAE-Sepharose FastFlow柱(40mm×20cm))，上样速度为20ml/min。再静置2h后用6倍柱体积的水对层析柱进行洗脱，使用水对层析柱进行洗脱的流速为9ml/min，弃洗脱液。再使用2倍柱体积的0.3mol/L的氯化钠溶液对层析柱进行洗脱，使用氯化钠溶液对层析柱进行洗脱的流速为7ml/min，保留洗脱液，得多糖液。使用减压蒸馏装置，在压强0.05MPa和温度45℃的条件下，浓缩处理4h，将多糖液浓缩成浸膏；

步骤(4)：将浸膏溶于水，浸膏和水的用量比为10mg：1ml，过滤取液相，得溶液B。将溶液B上样于葡聚糖凝胶层析柱(型号为：Sephadex-G25(26mm×50cm))，上样速度为2.5ml/min。静置1h后用水对层析柱进行洗脱，水的流速为0.7ml/min，保留洗脱液，得脱盐多糖液。

步骤(5)：使用减压蒸馏装置，在压强0.05MPa和温度45℃的条件下，将脱盐多糖液蒸干，获得干粉状物质，即为叶片提取物。

实施例3：澳洲坚果叶片提取物制备实例

澳洲坚果叶片提取物的制备步骤如下：

一种澳洲坚果叶片提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：取新鲜的澳洲坚果叶片洗净后阴干，粉碎后过40目获得叶片粉。

步骤(2)：使用90％的乙醇溶液在40℃的条件下浸泡叶片粉3h，叶片粉和乙醇溶液的用量比为1g：8ml，然后过滤取固相，挥干乙醇，得脱脂叶片粉。

将脱脂叶片粉加入水中，脱脂叶片粉与水的用量比为1g：20ml，得水提体系，超声处理水提体系，超声处理过程中维持水提体系的温度为75℃，超声处理的功率为300W，时长为90min。超声处理完成之后，4000rpm离心20min取液相，得提取液。在提取液中加入活性炭，活性炭在提取液中的质量百分数为5％，搅拌20min后静置10min，然后过滤取液相，得脱色提取液。

使用减压蒸馏装置(

R-300，BUCHI)，在压强0.05MPa和温度45℃的条件下，将脱色提取液浓缩至原体积的一半，然后在浓缩后的脱色提取液中加入95％乙醇溶液，浓缩后的脱色提取液与95％乙醇溶液的体积比为1：4。然后5℃静置24h，3000rpm离心30min后取固相，得沉淀。

步骤(3)：将沉淀溶于水，沉淀和水的用量比为10mg：1ml，过滤取液相，得溶液A；将溶液A的pH值调节至7.8，然后上样于DEAE琼脂糖凝胶层析柱(型号为DEAE-Sepharose FastFlow柱(40mm×20cm))，上样速度为20ml/min。再静置1.5h后用8倍柱体积的水对层析柱进行洗脱，使用水对层析柱进行洗脱的流速为9ml/min，弃洗脱液。再使用3倍柱体积的0.5mol/L的氯化钠溶液对层析柱进行洗脱，使用氯化钠溶液对层析柱进行洗脱的流速为12ml/min，保留洗脱液，得多糖液。使用减压蒸馏装置，在压强0.05MPa和温度45℃的条件下，浓缩处理4h，将多糖液浓缩成浸膏；

步骤(4)：将浸膏溶于水，浸膏和水的用量比为15mg：1ml，过滤取液相，得溶液B。将溶液B上样于葡聚糖凝胶层析柱(型号为：Sephadex-G25(26mm×50cm))，上样速度为2.5ml/min。静置2h后用水对层析柱进行洗脱，水的流速为1.2ml/min，保留洗脱液，得脱盐多糖液。

步骤(5)：使用减压蒸馏装置，在压强0.05MPa和温度45℃的条件下，将脱盐多糖液蒸干，获得干粉状物质，即为叶片提取物。

对比例1

本对比例基本同实施例1，不同点在于：在步骤(3)中，不进行溶液A的pH值的调整，直接上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱。

对比例2

本对比例基本同实施例1，不同点在于：在步骤(3)中，将溶液A的pH值调整至10.0，然后上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱。

对比例3

本对比例基本同实施例1，不同点在于：在步骤(3)中，将溶液A的pH值调整至6.5，然后上样于DEAE-Sepharose Fast Flow柱。

对比例4

本对比例基本同实施例1，不同点在于：在步骤(3)中，将DEAE-Sepharose FastFlow柱更换为Sephadex G100(40mm×20cm)。

对比例5

本对比例基本同实施例1，不同点在于：不进行步骤(3)和步骤(4)，直接将溶液A减压蒸馏，获得干粉状的叶片提取物。

实验例：提取率计算、多糖含量检测、酚酸类化合物含量检测

(1)多糖含量检测以及提取率计算

制备0.1mg/ml的葡萄糖对照品标准液。吸取标准品液0，100，200，400，600，800，1000μl分别置于试管中，用蒸馏水补足到2ml，每管中分别加入质量百分数为5％的苯酚溶液1ml，摇匀后加入浓硫酸5ml，静置5min后，加热试管5min，然后冰浴冷却5min，于490nm处测定吸光光度，绘制标准曲线，用吸光度对样品浓度作回归分析。

将实施例1-3和对比例1-5中的叶片提取物10mg分别溶于100ml水中，摇匀后吸取各叶片提取物溶液800ul，然后加蒸馏水至2ml，各管再加入质量百分数为5％的苯酚溶液1ml，摇匀后加入浓硫酸5ml，静置5min后，加热试管5min，然后冰浴冷却5min，于490nm处测定吸光光度，根据标准曲线计算实施例1-3和对比例1-5中的叶片提取物中的多糖含量，实验结果见表1。多糖含量是指在叶片提取物中多糖类物质的质量占叶片提取物质量的百分数。

另外，计算叶片提取物的得率，计算方法如下：叶片提取物的得率＝叶片提取物的质量/叶片粉的质量×100％

(2)酚酸类化合物含量检测

对实施例1-3和对比例1-5中的叶片提取物的酚酸类化合物(以绿原酸为例)进行HPLC检测。实验中使用的绿原酸标准品(纯度大于98％，sigma)，精密称定绿原酸标准品10mg，置于10mL容量瓶中，加乙腈定容至10ml，摇匀后作为对照品溶液，备用。将实施例1-3和对比例1-5中的叶片提取物10mg置于100ml容量瓶中，加乙腈定容至100ml，作为供试品溶液备用。准确吸取供试品溶液5μl，注入高效液相色谱仪进行色谱测定。色谱条件为：色谱仪为安捷伦1200系列，色谱柱为Eclipse XDB-C18(4.6×150mm,5μm)，柱温为25℃，流动相为乙腈：水＝10：90(V/V)，紫外检测波长为280nm，进样量为5μl，流速为0.8mL/min。对绿原酸的检测结果如表1所示，以mg/100g来表示，每100g叶片粉中含有绿原酸的量(mg)。

表1：实施例1-3和对比例1-5中的叶片提取物中成分含量检测结果

实施例1-3中，多糖含量较高，并且多糖中没有绿原酸等酚酸类物质的干扰。对比例1没有对溶液A的pH值进行调整，对比例3将溶液A的pH值调整至酸性，导致在非碱性环境下，酚酸类物质和DEAE琼脂糖凝胶有一定的吸附，使用该步骤的DEAE-Sepharose FastFlow柱层析，不能将酚酸类物质和多糖分离开来。所以在叶片提取物中有绿原酸检出。对比例2将溶液A的pH值调整至了10.0，碱性较强，多糖物质分子结构受到了一定程度破坏，所以叶片提取物中多糖的含量有所下降，叶片提取物的得率也下降了。对比例4使用了不同种类的层析柱，不能产生如DEAE琼脂糖凝胶的分离效果，叶片提取物中含有酚酸类物质。对比例5是传统的多糖提取方法，在提取得到粗多糖之后没有后续的纯化分离步骤，所以得率相对较高，但是叶片提取物中的多糖含量非常低，杂质含量高，含有酚酸类物质。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。