阅读说明：本技术 微生物法生产纳米细菌纤维素的方法 (Method for producing nano bacterial cellulose by microbiological method ) 是由 杨加志 李文静 李锦坤 李雪菲 于 2018-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种微生物法生产纳米细菌纤维素的方法。所述方法使用木醋杆菌作为产细菌纤维素的菌种,分别使用芽孢杆菌、木霉菌、曲霉菌或青霉菌作为产纤维素酶的菌种,在木醋杆菌动态培养过程中与产纤维素酶的菌株共培养,制得纳米细菌纤维素。本发明方法简单,可以一步制备出纳米细菌纤维素,制备工艺绿色环保。(The invention discloses a method for producing nano bacterial cellulose by a microbiological method. The method uses acetobacter xylinum as a bacterial strain for producing bacterial cellulose, uses bacillus, trichoderma, aspergillus or penicillium as a bacterial strain for producing cellulase, and co-cultures the bacillus, the trichoderma, the aspergillus or the penicillium with the bacterial strain for producing cellulase in the dynamic culture process of the acetobacter xylinum to prepare the nano bacterial cellulose. The method is simple, the nano bacterial cellulose can be prepared in one step, and the preparation process is environment-friendly.)

微生物法生产纳米细菌纤维素的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物法生产纳米细菌纤维素的方法，属于生物材料技术领域。

背景技术

细菌纤维素(Bacterial Cellulose，简称BC)是以木醋杆菌(Acetobacterxylinum)为代表的少数微生物合成分泌的一种胞外多糖，是一种天然形成的纤维。由于其结晶度高、持水量高、良好的三维结构、良好的生物相容性，广泛应用于许多领域。

将细菌纤维素进一步降解可得到纳米级的细菌纤维素，长度一般在200-900nm范围内。纳米细菌纤维素不但具有细菌纤维素的基本结构与性能，同时又具有极小的尺寸和巨大的比表面积等纳米微粒特性，可显著提高细菌纤维素化学反应的均匀性，可广泛应用在分散剂、强度增强剂、护肤霜等化妆品基质或药物载体中。

纳米细菌纤维素的制备方法有化学法、物理法和生物法。化学法和物理法有很多局限：化学方法需要用强酸水解，对反应设备要求高，处理反应后的残留物较困难(卢麒麟,胡阳,游惠娟,等.纳米纤维素研究进展[J].广州化工,2013,41(20):1-3.)。物理法需要使用高压并采用特殊的设备，能耗较大(叶代勇.纳米纤维素的制备[J].化学进展,2007,19(10):1568-1575.)。现有的生物法制备纳米级细菌纤维素绿色环保，但对尺寸调节的步骤较为繁琐，因此选择较为简单的生物方法很有必要(董凤霞,刘文,刘红峰.纳米纤维素的制备及应用[J].中国造纸,2012,31(6):68-73.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物法生产纳米细菌纤维素的方法。该方法通过在发酵培养罐中对木醋杆菌进行动态培养，待其能稳定产细菌纤维素时接入产纤维素酶的菌种进行共培养，产生的纤维素酶将大尺寸的细菌纤维素分解成纳米细菌纤维素。

实现本发明目的的技术解决方案为：

微生物法生产纳米细菌纤维素的方法，包括如下步骤：

步骤1，将木醋杆菌种子液接种到发酵液中，动态培养，得到絮状细菌纤维素；

步骤2，在发酵液中接种产纤维素酶的菌株种子液，动态培养，发酵结束后，去除残留的细胞及发酵液，水洗至中性，得到纳米细菌纤维素。

步骤1，所述的木醋杆菌种子液的接种量为8％～12％。

步骤1，所述的动态培养，搅拌速度为150～180rpm。

步骤2，所述的产纤维素酶的菌株选自芽孢杆菌、木霉菌、曲霉菌或青霉菌。

步骤2，所述的产纤维素酶的菌株为芽孢杆菌时，接种量为3～5％，混合后动态培养温度为27～30℃，共培养pH为5.5～6.5，共培养时间为24～48h。

步骤2，所述的产纤维素酶的菌株为木霉菌时，接种量为10-15％，混合后动态培养温度为28～30℃，共培养pH为4.0～5.0，共培养时间为72～96h。

步骤2，所述的产纤维素酶的菌株为曲霉菌时，接种量为5～10％，混合后动态培养温度为30～35℃，共培养pH为5.5～6.0，共培养时间为72～96h。

步骤2，所述的产纤维素酶的菌株为青霉菌时，接种量为3-5％，混合后动态培养温度为30～32℃，共培养pH为5.5～6.5，共培养时间为72～96h。

步骤2中，除去残留细胞及发酵液方法为用浓度为1～5g/L的NaOH和1～5g/L的H₂O₂在70～100℃条件下水浴0.5～3.0h。

本发明与现有技术相比，其显著优点是：

(1)发酵过程绿色环保，无毒无害，可以在发酵罐中一步生产出纳米细菌纤维素；

(2)生产出的纳米细菌纤维素后处理容易，去除残留的细胞及发酵液后用水冲洗至中性即可。

附图说明

图1是微生物法生产纳米细菌纤维素的流程图。

图2是对比例尺寸大小未经调节的细菌纤维素的扫描电镜图。

图3是实施例1尺寸大小经调节的纳米细菌纤维素的透射电镜图。

图4是实施例2尺寸大小经调节的纳米细菌纤维素的透射电镜图。

图5是实施例5尺寸大小经调节的纳米细菌纤维素的透射电镜图。

图6是实施例6尺寸大小经调节的纳米细菌纤维素的透射电镜图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。

以下实施例中，种子液配方：葡萄糖22.5g/L，蔗糖27.5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁0.7g/L，乳酸钙0.2g/L，柠檬酸0.6g/L，醋酸1.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉7.5g/L。

发酵液配方：葡萄糖22.5g/L，蔗糖27.5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁0.7g/L，乳酸钙0.2g/L，柠檬酸0.6g/L，醋酸1.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉7.5g/L。

实施例1

第一步：木醋杆菌进行种子扩增，摇床震荡培养，培养温度30℃，摇床转速160rpm，培养时间48h；

第二步：发酵液配制完成后，121℃高温灭菌30min，冷却至室温；

第三步：木醋杆菌以8％的接种量进行接种，接种后在发酵罐中动态培养36h，动态培养温度30℃；

第四步：待第三步培养后，芽孢杆菌以3％的接种量向发酵罐中接入，接种后在27℃、pH6.5条件下动态培养36h；

第五步：发酵结束后，用质量分数3g/L的NaOH和3g/L的H₂O₂在80℃条件下水浴2.0h，除去残留的细胞及发酵液；

第六步：用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。

由实施例1获得的纳米细菌纤维素如图3所示，可以看出细菌纤维素尺寸大小分布在纳米级尺寸范围内，纳米细菌纤维素尺寸在500-900nm。

实施例2

第一步：木醋杆菌进行种子扩增，摇床震荡培养，培养温度30℃，摇床转速160rpm，培养时间48h；

第二步：发酵液配制完成后，121℃高温灭菌30min，冷却至室温；

第三步：木醋杆菌以8％的接种量进行接种，接种后在发酵罐中动态培养36h，动态培养温度30℃；

第四步：待第三步培养后，木霉菌以12％的接种量向发酵罐中接入，接种后28℃、pH5.0动态培养96h；

第五步：发酵结束后，用质量分数3g/L的NaOH和3g/L的H₂O₂在80℃条件下水浴2.0h，除去残留的细胞及发酵液；

第六步：用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。

由实施例2获得的纳米细菌纤维素如图4所示，可以看出细菌纤维素尺寸大小分布在纳米级尺寸范围内，纳米细菌纤维素尺寸在900-1500nm。

实施例3

第一步：木醋杆菌进行种子扩增，摇床震荡培养，培养温度30℃，摇床转速160rpm，培养时间48h；

第二步：发酵液配制完成后，121℃高温灭菌30min，冷却至室温；

第三步：木醋杆菌以8％的接种量进行接种，接种后在发酵罐中动态培养36h，动态培养温度30℃；

第四步：待第三步培养后，曲霉菌以6％的接种量向发酵罐中接入，接种后30℃、pH5.5动态培养72h；

第五步：发酵结束后，用质量分数3g/L的NaOH溶液和3g/L的H₂O₂在80℃条件下水浴2.0h，除去残留的细胞及发酵液；

第六步：用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。

由实施例3获得的纳米细菌纤维素尺寸较大，在1200-1800nm。

实施例4

第一步：木醋杆菌进行种子扩增，摇床震荡培养，培养温度30℃，摇床转速160rpm，培养时间48h；

第二步：发酵液配制完成后，121℃高温灭菌30min，冷却至室温；

第三步：木醋杆菌以8％的接种量进行接种，接种后在发酵罐中动态培养36h，动态培养温度30℃；

第四步：待第三步培养后，青霉菌以3％的接种量向发酵罐中接入，接种后30℃、pH5.5动态培养72h；

第五步：发酵结束后，用质量分数3g/L的NaOH溶液和3g/L的H₂O₂在80℃条件下水浴2.0h，除去残留的细胞及发酵液；

第六步：用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。

由实施例4获得的纳米细菌纤维素尺寸较大，在1600-2000nm。

实施例5

第一步：木醋杆菌进行种子扩增，摇床震荡培养，培养温度30℃，摇床转速160rpm，培养时间48h；

第二步：发酵液配制完成后，121℃高温灭菌30min，冷却至室温；

第三步：木醋杆菌以8％的接种量进行接种，接种后在发酵罐中动态培养36h，动态培养温度30℃；

第四步：待第三步培养后，芽孢杆菌以5％的接种量向发酵罐中接入，接种后在27℃、pH6.5条件下动态培养36h；

第五步：发酵结束后，用质量分数3g/L的NaOH和3g/L的H₂O₂在80℃条件下水浴2.0h，除去残留的细胞及发酵液；

第六步：用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。

由实施例5获得的纳米细菌纤维素如图5所示，可以看出细菌纤维素尺寸大小分布在纳米级尺寸范围内，纳米细菌纤维素尺寸在700-1000nm。

实施例6

第一步：木醋杆菌进行种子扩增，摇床震荡培养，培养温度30℃，摇床转速160rpm，培养时间48h；

第二步：发酵液配制完成后，121℃高温灭菌30min，冷却至室温；

第三步：木醋杆菌以8％的接种量进行接种，接种后在发酵罐中动态培养36h，动态培养温度30℃；

第四步：待第三步培养后，芽孢杆菌以5％的接种量向发酵罐中接入，接种后在32℃、pH6.5条件下动态培养36h；

第五步：发酵结束后，用质量分数3g/L的NaOH和3g/L的H₂O₂在80℃条件下水浴2.0h，除去残留的细胞及发酵液；

第六步：用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。

由实施例6获得的纳米细菌纤维素如图6所示，可以看出细菌纤维素尺寸大小分布在纳米级尺寸范围内，纳米细菌纤维素尺寸在240-500nm。同时可以看出实施例6培养条件相对于其他几组更为合适，所得到的纳米细菌纤维素尺寸最小。

对比例

未调节细菌纤维素尺寸大小的方法：

第一步：木醋杆菌进行种子扩增，摇床震荡培养，培养温度30℃，摇床转速160rpm，培养时间48h；

第二步：发酵液配制完成后，121℃高温灭菌30min，冷却至室温；

第三步：木醋杆菌以8％的接种量进行接种，接种后在发酵罐中动态培养36h，动态培养温度30℃；

第四步：发酵结束后，用质量分数3g/L的NaOH溶液和3g/L的H₂O₂在80℃条件下水浴2.0小时，除去残留的细胞及发酵液；

第五步：用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。

由对比例获得的未经调节的细菌纤维素如图2所示，可以看出单根细菌纤维素尺寸较大，弯曲缠绕。