阅读说明：本技术 产高活性纤溶酶的植物乳杆菌及用其发酵的果蔬汁饮料 (Lactobacillus plantarum for producing high-activity plasmin and fruit and vegetable juice beverage fermented by same ) 是由 胡欣洁 朱琦琦 何维 曹阳 吴任之 余东梅 赵俊梅 刘书亮 秦文 韩国全 *** 于 2019-11-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一株产高活性纤溶酶的植物乳杆菌,所述产高活性纤溶酶的植物乳杆菌的分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum,保藏于中国科学院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CGMCC No.17372,保藏时间为2019年3月20日。本发明还提供了利用上述植物乳杆菌发酵制备得到的果蔬汁饮料。本发明所得的产高活性纤溶酶的植物乳杆菌发酵上清液纤溶酶的酶活性为497.72U/mL；菌株发酵上清液具有较强抑菌能力；并且菌株本身对多种抗生素均无多重耐药,对于胃肠液具有较高耐受性,还具有潜在的肠道附着能力。本发明饮料达到国家相关活菌数标准,具有良好商业化价值。(The invention provides a Lactobacillus plantarum for producing high-activity plasmin, which is classified and named as Lactobacillus plantarum and is preserved in China general microbiological culture collection management center of institute of microbiology, China academy of sciences, with the preservation number of CGMCC No.17372 and the preservation time of 2019, 3 months and 20 days. The invention also provides a fruit and vegetable juice beverage prepared by fermenting the lactobacillus plantarum. The enzymatic activity of the lactobacillus plantarum fermented supernatant plasmin capable of producing the high-activity plasmin is 497.72U/mL; the strain fermentation supernatant has strong bacteriostatic ability; and the strain has no multiple drug resistance to various antibiotics, has higher tolerance to gastrointestinal fluids, and also has potential intestinal attachment capability. The beverage of the invention reaches the national relevant viable count standard and has good commercial value.)

产高活性纤溶酶的植物乳杆菌及用其发酵的果蔬汁饮料

技术领域

本发明涉及生物技术和食品技术领域，具体涉及产高活性纤溶酶的植物乳杆菌及用其发酵的果蔬汁饮料

背景技术

植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)是乳酸杆菌中的一种，常存在于发酵的蔬菜和果汁中。植物乳杆菌作为人体胃肠道的益生菌，具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种功能。在食品发酵过程中，植物乳杆菌可将食品原料中的糖转变为乳酸，同时产生抗菌肽、胞外多糖和其他代谢产物。植物乳杆菌在食品中的应用主要是在乳制品、肉制品、果蔬制品、豆制品、谷物和薯类制品等方面，具有广阔市场。根据《可用于食品的菌种名单》(卫办监督发〔2010〕65号)相关规定，植物乳杆菌可以直接用于食品生产。但目前鲜有植物乳杆菌产纤溶酶及相关研究报道。

血栓性疾病以前多发于老年人群，但是因当代人不健康的生活习惯和饮食方式是血栓性疾病对人们健康的威胁不再仅限于老年人群。根据《中国居民营养与慢性疾病状况报告(2015年)》数据显示，2012 年全国十八岁以上成年人中因属于血栓性疾病的心脑血管疾病导致的死亡率为271.8/10万，是主要的死亡原因。利用溶栓剂溶栓是血栓类疾病主要的治疗方法之一，同时利用溶栓剂实现对血栓类慢性疾病的预防也备受关注。目前治疗主要用的溶栓剂存在副作用大或者价格昂贵等缺点，不适用于血栓性疾病的预防。微生物种类繁多、代谢产物丰富多样，且微生物易培养，繁殖快，因此成为发掘新型溶栓剂的重要资源。微生物源纤溶酶如链激酶、葡激酶、纳豆激酶等都表现出良好的溶栓特性，特别是枯草芽孢杆菌分泌产生的纳豆激酶已经制备保健食品实现商业化。筛选能直接用于食品发酵生产的，同时能产高活性纤溶酶的乳酸菌用于研发具有纤溶酶活性的食品可以作为预防血栓性疾病，降低此类疾病发病率的有效措施。

发明内容

针对现有技术的缺点和需求，本发明的目的之一在于获得一种可产高活性纤溶酶、具有良好抑菌性且对多种抗生素无多重耐药的植物乳杆菌。

为了实现上述目的，本发明提供了一株产高活性纤溶酶的植物乳杆菌，所述产高活性纤溶酶的植物乳杆菌的分类命名为植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum，保藏于中国科学院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101)，保藏号为CGMCC No.17372，保藏时间为2019年3月20日。

如无特别说明，在本发明的说明书中，本发明所述的产高活性纤溶酶的植物乳杆菌简称为植物乳杆菌HQ-3。

本发明的另一个目的在于提供一种果蔬汁饮料，所述果蔬汁饮料是以果蔬作为原料，并利用上述产高活性纤溶酶的植物乳杆菌发酵而得。

作为本发明的一个可选实施方式，所述果蔬为猕猴桃。

本发明还提供了制备上述果蔬汁饮料的方法，所述方法的步骤包括：

将猕猴桃进行榨汁后，加水进行调配，然后利用所述产高活性纤溶酶的植物乳杆菌进行发酵，即得。

作为本发明的一个可选的实施方案，所述方法包括如下步骤：

(1)猕猴桃的选择和处理：挑选8～9分成熟度的红阳猕猴桃，除去病虫和腐烂果实，备用；将挑选出的红阳猕猴桃用螺旋榨汁机进行榨汁并果皮分离，留果浆；

(2)调配：红阳猕猴桃果浆与水按体积比1:1混合均匀后，添加80mg/100g羧甲基纤维素钠、12g/100g白砂糖，并用柠檬酸钠调节pH＝5.5；

(3)杀菌：调配好的红阳猕猴桃果浆在83℃加热10min以杀灭有害微生物和致病菌；

(4)发酵：灭菌处理后的红阳猕猴桃浆冷却至室温，加入1％经活化后的所述产高活性纤溶酶的植物乳杆菌发酵，37℃静止发酵 28h，即得。

本发明的有益效果：

本发明所得的产高活性纤溶酶的植物乳杆菌的纤溶酶发酵上清液酶活性为497.72U/mL；发酵上清液具有较强的抑菌能力；同时，本发明所得的产高活性纤溶酶的植物乳杆菌对多种抗生素均无多重耐药性；对于胃肠液具有较高耐受性，还具有潜在的肠道附着能力。

本发明所得的饮料达到国家关于乳酸菌发酵活菌饮料活菌数标准，同时饮料中含有高活性纤溶酶，具有良好的商业化价值。

附图说明

图1为产纤溶酶乳酸菌的筛选的初筛结果图；

图2为产纤溶酶乳酸菌的筛选的复筛结果图；

图3为本发明植物乳杆菌HQ-3的纤溶酶活性测定时的尿激酶标准曲线；

图4和图5为本发明植物乳杆菌HQ-3的形态学鉴定结果图；

图6为本发明植物乳杆菌HQ-31的16S rDNA扩增电泳图；

图7为本发明植物乳杆菌HQ-3的系统发育树；

图8为本发明植物乳杆菌HQ-3的生长曲线图；

图9为本发明植物乳杆菌HQ-3的特异性黏附素基因PCR电泳图；

图10和图11为本发明植物乳杆菌HQ-3发酵上清液水解纤维蛋白方式确定的实验结果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1试验方法：

1.1材料与试剂

1.1.1实验样品

从四川各地采集的豆豉，东北发酵大豆酱、发酵虾酱等传统发酵食品59份和雅安农贸市场采购的新鲜蔬菜叶等食品原料8份。

1.1.2培养基

MRS培养基、E-liker培养基、蔗糖硫胺培养基、LB培养基、蛋白胨水培养基、硝酸盐培养基、MH培养基、血平板、CM培养基、脱脂乳琼脂平板。

1.1.3主要试剂

牛纤维蛋白原、凝血酶(生化试剂，40U/mg)、尿激酶标准品(生化试剂，50U/mg)购自上海源叶生物科技有限公司；胃蛋白酶(生化试剂，30000U/mg)、胰蛋白酶(生化试剂，250U/mg)购自上海瑞永生物科技有限公司；SDS-PAGE试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.4菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 25923，沙门氏菌(salmonella)由四川农业大学食品微生物实验室提供。

1.2方法

1.2.1样品处理

分别用MRS液体培养基、E-liker培养基、蔗糖硫胺培养基对样品进行富集培养，获得不同的富集培养液。

1.2.2产纤溶酶乳酸菌的分离

(1)初筛：将筛选获得乳酸菌接种于含脱脂乳平板上，37℃培养48h。在脱脂乳平板上挑取溶解圈明显的单菌落，纯化。

(2)复筛：将筛获得菌株接种于CM液体培养基中，37℃培养 24h。收集菌液1mL于4℃，10000r/min离心10min，取上清液 20μL于纤维蛋白平板小孔中点样。37℃孵育18h，挑选能产生溶解圈的菌株。

1.2.3纤溶活性的测定

(1)标准曲线绘制：分别取31.25，62.5，125，250，500U/mL 尿激酶标准品20μL点在配制好的纤维蛋白平板的点样孔中。以标准尿激酶浓度的对数值为横坐标，溶解透明圈面积的对数值为纵坐标作图。

(2)酶活测定：将复筛所得菌株活化后，按2％的接种量，接种于液体培养基37℃，180r/min培养12h。取菌液1mL于4℃， 10000r/min离心10min，取上清液20μL于纤维蛋白平板小孔中点样。先将点样后的纤维蛋白平板于室温下平稳放置10min，再置于37℃恒温培养18h，测定每个样品溶解透明溶圈的垂直直径，实验重复3次，取平均值，计算其乘积作为溶解透明圈面积，根据标准曲线计算出各测试样品的溶纤活性。

1.2.4产纤溶酶乳酸菌的鉴定

(1)形态学鉴定。

(2)生理生化鉴定：依据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》。

(3)分子鉴定：利用细菌16S rDINA通用引物对目的菌株进行 16Sr DNA扩增。反应后的产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，选取在1500bp左右有清晰的条带的PCR产物测序，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司进行。测序结果利用NCBI的BLAST分析工具与GenBank数据库中已知菌株的对应序列进行比较鉴定，并用MEGA 5.05软件构建系统进化树。

1.2.5植物乳杆菌HQ-3生物学特性

(1)药敏性试验

采用(K-B)纸片扩散法进行药敏试验，把受试菌用无菌生理盐水配制成含活菌数约为1.5～3.0×10⁸CFU/mL的菌悬液，取100μL 均匀涂布于MRS固体培养基上，按使用说明书将药敏片均匀放置在其上。37℃培养18h后，记录各药敏纸片的抑菌圈直径大小。重复3次试验求平均值。采用一菌一药一判断值的原则，根据说明书敏感和药敏性的最小抑菌圈直径判定菌株的药敏性。药敏纸片如下：氨苄西林、阿莫西林、头孢他啶、亚胺培南、万古霉素、四环素、氯霉素、庆大霉素、利福平、头孢哌酮、丁胺卡那、链霉素、青霉素和红霉素。以大肠杆菌ATCC 25922，金黄色葡萄球菌ATCC 25923作为质控标准菌。

(2)抑菌实验

采用牛津杯法对筛选获得的菌株进行致病菌的抑制试验，用生理盐水校正指示菌大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌菌液浓度至1.5～3.0×10⁸CFU/mL，受试菌株菌液离心(4℃，8000r/min) 10min后得到上清液准备待用，以空白LB培养基为阴性对照，检测加入培养上清液对指示菌的抑制作用。

(3)生长曲线的测定

将分离所到菌种活化后，按2％接种于液体培养基中，37℃培养24h。每隔2h测定在600nm处的吸光度，绘制生长曲线。

(4)模拟肠胃道试验

将植物乳杆菌HQ-3MRS培养基37℃静置培养20h，6000r/min 15℃离心10分钟，用10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7)洗涤两次，备用。将菌沉淀用10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7)制备的唾液溶液重悬至初始体积。用HCl调节菌悬液pH梯度，pH梯度为4.0～2.3，在37℃孵育1.5h左右。酸处理后将菌悬液6000r/min 15℃离心10 分钟，悬浮于磷酸盐缓冲液(0.1M pH 8)中制备1％(w/v)的猪胆汁中至初始体积，在37℃下孵育10分钟；将菌悬液离心，悬浮在磷酸盐缓冲液(0.1M pH 8)中制备的胆汁-胰酶溶液(分别为0.3％和0.1％w/v)中，并在37℃下孵育1小时。在不同时间取样(表1)并进行活菌计数。

表1模拟植物乳杆菌HQ-3胃肠道试验方法条件

注：每个步骤之前和之后的取样均进行菌落计数(37℃48h)。

a加入牛胃蛋白酶(3g/L)的唾液溶液(0.125M NaCl，0.007M KCl，0.045MNaHCO3)。

b在磷酸盐缓冲液(0.1M pH 8)中制备胆汁溶液。

c在磷酸盐缓冲液(0.1M pH 8)中制备胆汁-胰酶溶液。

(5)植物乳杆菌HQ-3特异性黏附素基因确定

研究表明，植物乳杆菌特异性黏附素的产生能力对植物乳杆菌在肠道系统中的黏附于肠粘膜表面的能力有显著影响。根据报道文献，设计特异性黏附素基因slp2588A PCR扩增特异性引物，通过PCR确定植物乳杆菌HQ-3基因组中是否存在特异性黏附素基因slp2588A。

1.2.6溶解纤维蛋白作用方式测定

制得两个琼脂糖-纤维蛋白平板，取其中一个平板置于电热恒温培养箱中85℃加热30min,制得加热平板，另一个则为纤维蛋白标准。用直径为3mm的打孔器在平板上打孔，将20μL粗酶液分别加入两个平板中，以等体积的尿激酶为对照，37℃培养18 h后用游标卡尺测量溶解圈直径，根据水解圈面积判断其溶解纤维蛋白作用方式。

1.2.7植物乳杆菌HQ-3果蔬发酵饮料制备方法

(1)红阳猕猴桃的选择：挑选8～9分成熟度的红阳猕猴桃，除去病虫和腐烂果实，备用。将挑选出的红阳猕猴桃用螺旋榨汁机进行榨汁并果皮分离，留果浆进行乳酸发酵。

(2)调配：红阳猕猴桃果浆与水按体积比1:1混合均匀后，添加80mg/100g羧甲基纤维素钠、12g/100g白砂糖，并用柠檬酸钠调节pH＝5.5。

(3)杀菌：调配好的红阳猕猴桃果浆在83℃加热10min以杀灭有害微生物、致病菌等。

(5)发酵：灭菌处理后的红阳猕猴桃浆冷却至室温，加入 1％经活化后的植物乳杆菌HQ-3，37℃静止发酵28h。既得植物乳杆菌HQ-3发酵的红阳猕猴桃活菌饮料。

1.2.8发酵饮料中乳酸菌活菌计数

根据GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验检测植物乳杆菌HQ-3发酵生产的红阳猕猴桃饮料中的乳酸菌总数。

2结果与分析

2.1产纤溶酶乳酸菌的筛选

通过富集培养及产酸菌株脱脂乳初筛，从89份样品中分离到 63株能形成较大蛋白水解圈的菌株，如图1所示。经琼脂糖-纤维蛋白平板验证具有纤溶酶活性菌株有7株，选取水解圈大的菌株进行鉴定，并将其命名为HQ-3，如图2所示。

2.2纤溶活性的测定

通过配制不同浓度的尿激酶标准品，测定在纤维蛋白平板上透明圈面积，以尿激酶纤溶活性对数(lgB)为横坐标，以透明圈面积对数(lgA)为纵坐标，绘制尿激酶标准曲线，如图3所示。根据绘制的尿激酶标准曲线计算出菌株HQ-3的酶活为497.72 U/mL。

2.3 HQ-3菌株的鉴定

2.3.1形态学鉴定

菌落均呈圆形，直径为3.0mm±1mm，乳白色、凸起、微白色、湿润、不透明、边缘光滑的单菌落，见图4。显微镜下为杆状、呈单个或成对或链状排列球菌，见图5。

2.3.2生理生化鉴定

根据生理生化特征不能判断该菌的归属，需要综合更多鉴定指标对其分类地位进行分析，具体生理生化指标结果见表2。

表2细菌生理生化特征

注：表中“-”表示反应呈阴性；“+”表示反应呈阳性；“生长”表示可以生长。

2.3.3分子鉴定

16s rDNA序列PCR扩增得到目标条带大约为1500bp，见图6，将PCR产物送交上海生工测序，PCR产物测序结果在NCBI数据库中进行比对，并利用MEGA 5.0建立系统发育树，见图7，该菌株与Genbank中Lactobacillus plantarum lp-15(FJ763580.1)16S rRNA 同源性达到99％，结合生理生化鉴定结果初步确定HQ-3为植物乳杆菌。

2.4菌株HQ-3的生物学特性

2.4.1药敏性试验

利用临床常用抗生素对进行HQ-3药敏性试验，药敏性实验结果如表3所示，试验结果证明HQ-3对以下14种抗生素均无多重耐药。

表3菌株HQ-3对抗生素敏感性

注：S：敏感；I：中间敏感；R：耐药；表中数据为平均数±标准差

2.4.2抑菌试验

以常见食源性细菌为指示菌，以HQ-3发酵上清液为样品进行抑菌试验，抑菌试验结果如表4所示，植物乳杆菌对大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923及沙门氏菌ATCC 13311抑菌圈直径均大于16mm，表明植物乳杆菌对这三种致病菌有较强的抑菌效果。

表4菌株HQ-3对3种致病菌的抑菌效果

2.4.3菌株HQ-3生长曲线的测定

测定株菌在36h内的生长曲线如图8所示，取培养16h左右的菌液进行模拟消化道环境耐受试验。

2.4.4模拟肠胃道试验

在不同时间取样37℃MRS固体平板培养48h并进行菌落计数，试验结果见表5。由表5可知，经过一系列的胃肠道处理后，该菌株存活率较高，最后其菌落计数为UFC/ml。通过胃肠道后的高阻力对于任何潜在的益生菌微生物都是必不可少的，因为它必须到达肠道仍具有较高的活菌数(大约10⁵到10⁶UFC/g或ml)才会对消费者的健康产生有益的影响。所以该菌株在应用于食品研制上具有较高的价值。

表5模拟肠胃道试验菌落计数结果

2.4.5植物乳杆菌HQ-3特异性黏附素基因确定

以植物乳杆菌HQ-3菌液为模板，利用植物乳杆菌特异性黏附素基因slp2588A引物扩增特异性黏附素基因，PCR产物凝胶电泳结果如图9所示。PCR扩增结果表明植物乳杆菌HQ-3基因组中含有特异性黏附素基因slp2588A，说明植物乳杆菌HQ-3可能会产生植物乳杆菌特异性黏附素，具有潜在的肠道附着能力。

2.5植物乳杆菌HQ-3产生的纤溶酶溶解纤维蛋白作用方式确定

植物乳杆菌HQ-3产生的纤溶酶溶解纤维蛋白方式确定试验结果如图10和图11所示，阳性对照纳豆激酶在加热和未经加热的纤维蛋白平板中都有明显的溶解圈，而菌株HQ-3发酵上清液及酶处理后发酵上清液与阴性对照尿激酶一样，在加热后的纤维蛋白平板中无明显的溶解圈，推断该纤溶酶是通过激活纤溶酶原的方式间接溶解纤维蛋白。

2.5植物乳杆菌HQ-3发酵猕猴桃饮料功能性

利用植物乳杆菌HQ-3发酵红阳猕猴桃果浆后制得的红阳猕猴桃活菌功能饮料乳酸菌活菌数和纤溶酶活性检测结果如表6所示。

表6饮料实验数据

试验数据表明植物乳杆菌HQ-3发酵生产的红阳猕猴桃活菌饮料中乳酸菌含量达到国家关于乳酸菌发酵活菌饮料活菌数标准，具有潜在商业化价值。