一种i型牛疱疹病毒重组蛋白及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种i型牛疱疹病毒重组蛋白及其制备方法和应用 (I-type bovine herpes virus recombinant protein and preparation method and application thereof ) 是由 李晓光 刘毅 于 2019-12-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种I型牛疱疹病毒重组蛋白,涉及生物医药技术领域,一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法包括以下步骤:(1)查找I型牛疱疹病毒中含有主要抗原决定簇的gD抗原；(2)优化I型牛疱疹病毒gD抗原基因的密码子,合成核酸序列并进行表达；(3)构建针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体,调取单链抗体scFv的基因；(4)重组优化的I型牛疱疹病毒gD抗原基因和针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体scFv的基因,并进行诱导表达；(5)纯化及复性I型牛疱疹病毒重组蛋白。本发明在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单链抗体,易于在细胞中表达,可以在真核或者原核细胞中表达,可大量生产,成本较低。(The invention discloses a recombinant protein of bovine herpes virus type I, which relates to the technical field of biomedicine, and a preparation method of the recombinant protein of bovine herpes virus type I comprises the following steps of (1) searching gD antigen containing main antigenic determinant in the bovine herpes virus type I; (2) optimizing codons of the bovine herpes virus I gD antigen gene, synthesizing a nucleic acid sequence and expressing the nucleic acid sequence; (3) constructing a single-chain antibody aiming at the type I bovine herpes virus gD antigen, and calling the gene of the single-chain antibody scFv; (4) recombining and expressing an optimized gene of the gD antigen of the bovine herpes virus type I and a gene of a single-chain antibody scFv aiming at the gD antigen of the bovine herpes virus type I in an induction manner; (5) purifying and renaturing the bovine herpes virus type I recombinant protein. The invention develops the single-chain antibody by recombinant antibody technology on the basis of developing the monoclonal antibody, is easy to express in cells, can express in eukaryotic cells or prokaryotic cells, can be produced in large quantities, and has lower cost.)
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种I型牛疱疹病毒重组蛋白。
背景技术
牛传染性鼻气管炎(IBR)又称“坏死性鼻炎”、“红鼻病”，是I型牛疱疹病毒(BHV-1)引起的一种牛呼吸道接触性传染病。此病目前在世界范围内流行，对乳牛的产奶量、公牛的繁殖力均有较大影响。1980年我国从新西兰进口奶牛中首次报道该病，并分离到一株牛传染性鼻气管炎病毒，随后经血清学调查证实，我国广东、广西等省市的黑白花乳牛、本地黄牛、水牛或牦牛均有IBR病毒存在。在一些交通极不便利的地区，IBR病毒抗体阳性率极高。
体外诊断核心原料的开发是开发相应诊断试剂的前提,只有开发出具有高活性、高性能的抗原抗体,体外诊断试剂产品才能成为现实。因此,针对I型牛疱疹病毒抗体和抗原开发出能够用以生产诊断试剂的原料迫在眉睫,从某种程度上说,原料的开发也必将成为降低I型牛疱疹病毒病蔓延的首要解决问题。
发明内容
本发明提供一种I型牛疱疹病毒重组蛋白,所述重组蛋白包括I型牛疱疹病毒抗原和I型牛疱疹病毒单链抗体。
进一步地,本发明所述I型牛疱疹病毒抗原为含有主要抗原决定簇的gD抗原,所述I型牛疱疹病毒单链抗体为scFv。
本发明还提供了一种I型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法,其制备步骤如下：
(1)查找I型牛疱疹病毒中含有主要抗原决定簇的gD抗原
从NCBI(美国国立生物技术信息中心)中查找到I型牛疱疹病毒含有主要抗原决定簇的 gD抗原。
(2)优化I型牛疱疹病毒gD抗原基因的密码子,合成核酸序列并进行表达
在大肠杆菌中表达蛋白时,不同密码子使用的频率有较大区别,为了使重组蛋白的表达量达到最大,需将I型牛疱疹病毒gD抗原基因序列进行密码子优化,然后合成优化后的核酸序列并进行表达。
(3)构建针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体,调取单链抗体scFv的基因
将纯化之后的gD抗原蛋白免疫小鼠获得高活性的单克隆抗体,再调取单链抗体scFv的基因。
(4)重组优化的I型牛疱疹病毒gD抗原基因和针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体 scFv基因,并进行表达
将优化后的I型牛疱疹病毒gD抗原基因(38-292aa)和针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体scFv基因(能够针对结合gD抗原蛋白的23-30aa部分)通过递归PCR技术连接起来, 测序分析序列正确后,把重组蛋白的基因片段***到表达载体上进行表达。
(5)纯化及复性I型牛疱疹病毒重组蛋白。
本发明的表达系统为大肠杆菌表达系统,它具有周期短,费用低,表达量大等特点。
为了使得重组蛋白更好地保持活性位点,本发明选择比较温和的培养和诱导条件,其表达时的诱导温度为20℃、25℃、28℃、37℃,进一步优选的诱导温度为25℃、37℃,更进一步优选的诱导温度为25℃。诱导转速为250rpm,诱导的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浓度为 0.5mM。这样使得重组蛋白有了更加缓慢的表达,有充分的时间进行空间构象的形成。
本发明可以采用超声的方式破碎细菌。在破碎菌体的时候,为了避免剧烈条件,将破碎条件定为200w,每次超声6s,间隔3s超声一次,共180次。
本发明重组蛋白的纯化方式有离子交换层析,凝胶过滤层析和亲和层析等方法,进一步优选为亲和层析。
本发明在重组蛋白中加入了6XHis标签,使亲和层析纯化方式能够达到较高的纯度。
本发明的重组蛋白利用基因工程重组技术,在大肠杆菌系统中表达I型牛疱疹病毒抗原和单链抗体的重组蛋白方法,具有生产周期短、产量高、成本低等优点。
本发明的I型牛疱疹病毒重组蛋白可做为I型牛疱疹病毒免疫诊断试剂盒的一部分。
本发明具有以下优点及有益效果：
(1)首次开发针对I型牛疱疹病毒主要抗原gD的单链抗体scFv。
本发明在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单链抗体,单链抗体具有以下优点：1)具有完整的抗原结合位点,不含抗体恒定区；2)分子量小,减少了抗体的非特异性结合,降低了诊断产品的假阳性风险；3)结构简单,易于基因工程改造；4)易于在细胞中表达,可以在真核或者原核细胞中表达,可大量生产,成本较低。
(2)国内外首次开发I型牛疱疹病毒主要抗原表位及针对gD抗原的scFv重组蛋白。
由于感染I型牛疱疹病毒初期不产生抗体,致使在此段时间我们检测不到相应的I型牛疱疹病毒抗体,从而导致漏检,为了解决此问题必须在检测I型牛疱疹病毒抗体的同时增加对抗原的检测,开发针对I型牛疱疹病毒gD抗原的抗体成为关键。
(3)制备了同时结合I型牛疱疹病毒抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白。
在主要抗原表位和针对I型牛疱疹病毒gD抗原的抗体开发出后,利用基因工程技术将筛选出的高效抗原表位(I型牛疱疹病毒gD抗原的38-292aa)和针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体scFv(23-30aa)重组,制备成具有同时结合I型牛疱疹病毒抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白,该重组蛋白具有以下优点：1)在快诊试剂条中只需要使用一种原料即可,这样可以避免多种原料间的交叉反应；2)在原料的生产上,只需要稳定一种原料的生产工艺即可,这样可以减少生产成本的投入,缩短原料生产周期,降低生产批间差；3)节省了开发I型牛疱疹病毒诊断试剂的成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明,但并不将本发明局限于这些具体实施方式。本领域技术人员应该认识到,本发明涵盖了权利要求书范围内所可能包括的所有备选方案、改进方案和等效方案。
实施例1I型牛疱疹病毒gD抗原基因的密码子优化及表达载体构建
从NCBI查找gD抗原基因GenBank：AFB76672.1,其38-292aa蛋白质序列如下： PRYNYTERWHTTGPIPSPFADGREQPVEVRYATSAAACDMLALIADPQVGRTLWEAVRRHARAYNATVIWYKIESGCARPLY YMEYTECEPRKHFGYCRYRTPPFWDSFLAGFAYPTDDELGLIMAAPARLVEGQYRRALYIDGTVAYTDFMVSLPAGDCWFS KLGAARGYTFGACFPARDYEQKKVLRLTYLTQYYPQEAHKAIVDYWFMRHGGVVPPYFEESKGYEPPPAADGGSPAPPGD DEAREDEGETED
经过密码子优化后序列如下：
CCTCGTTATAATTACACCGAACGCTGGCATACCACCGGTCCGATTCCGAGCCCGTTTGCCGATGGCCGCGAA CAGCCGGTGGAAGTTCGTTATGCAACCAGTGCAGCCGCCTGCGATATGCTGGCCCTGATTGCCGATCCGCAGGTGGGTCGCACCCTGTGGGAAGCAGTGCGTCGTCATGCACGCGCCTATAATGCAACCGTTATTTGGTATAA AATCGAAAGTGGCTGTGCACGCCCGCTGTATTATATGGAATATACCGAATGTGAACCGCGCAAACATTTTGG TTATTGCCGTTATCGTACCCCGCCGTTTTGGGATAGCTTTCTGGCAGGCTTTGCCTATCCGACCGATGATGAA CTGGGTCTGATTATGGCCGCACCGGCCCGTCTGGTGGAAGGCCAATATCGTCGCGCACTGTATATTGATGGC ACCGTTGCATATACCGATTTTATGGTTAGTCTGCCGGCCGGCGATTGCTGGTTTAGTAAACTGGGTGCCGCA CGTGGTTATACCTTTGGCGCATGCTTTCCGGCCCGTGATTATGAACAGAAAAAAGTGCTGCGCCTGACCTAT CTGACCCAGTATTATCCGCAGGAAGCCCATAAAGCAATTGTGGATTATTGGTTTATGCGCCATGGCGGCGTT GTTCCGCCGTATTTTGAAGAAAGCAAAGGCTATGAACCGCCGCCGGCAGCAGATGGTGGTAGTCCGGCAC CGCCGGGTGACGATGAAGCCCGTGAAGATGAAGGTGAAACCGAAGAT
设计引物如下：
P1u：GCCCATATGCCTCGTTATAATTACACCGAACGCTGGCATACCACCGGTCCGATTCCG
P1d：ATAACGAACTTCCACCGGCTGTTCGCGGCCATCGGCAAACGGGCTCGGAATCGGACCGGT
P2u：GTGGAAGTTCGTTATGCAACCAGTGCAGCCGCCTGCGATATGCTGGCCCTGATTGCCG
P2d：GACGACGCACTGCTTCCCACAGGGTGCGACCCACCTGCGGATCGGCAATCAGGGCCA
P3u：AAGCAGTGCGTCGTCATGCACGCGCCTATAATGCAACCGTTATTTGGTATAAAATC
P3d：GGTATATTCCATATAATACAGCGGGCGTGCACAGCCACTTTCGATTTTATACCAAAT
P4u：TATATGGAATATACCGAATGTGAACCGCGCAAACATTTTGGTTATTGCCGTTATCGTAC
P4d：CGGATAGGCAAAGCCTGCCAGAAAGCTATCCCAAAACGGCGGGGTACGATAACGGCAA
P5u：AGGCTTTGCCTATCCGACCGATGATGAACTGGGTCTGATTATGGCCGCACCGGCC
P5d：GCCATCAATATACAGTGCGCGACGATATTGGCCTTCCACCAGACGGGCCGGTGCGGCCAT
P6u：ACTGTATATTGATGGCACCGTTGCATATACCGATTTTATGGTTAGTCTGCCGGCCGGCG
P6d：AAAGGTATAACCACGTGCGGCACCCAGTTTACTAAACCAGCAATCGCCGGCCGGCAGAC
P7u：TTTGGCGCATGCTTTCCGGCCCGTGATTATGAACAGAAAAAAGTGCTGCGCCTGACCTAT
P7d：CCACAATTGCTTTATGGGCTTCCTGCGGATAATACTGGGTCAGATAGGTCAGGCGCAG
P8u：ATAAAGCAATTGTGGATTATTGGTTTATGCGCCATGGCGGCGTTGTTCCGCCGTATT
P8d：CCATCTGCTGCCGGCGGCGGTTCATAGCCTTTGCTTTCTTCAAAATACGGCGGAACAA
P9u：GCCGGCAGCAGATGGTGGTAGTCCGGCACCGCCGGGTGACGATGAAGCCCGT
P9d：GCCCTCGAGATCTTCGGTTTCACCTTCATCTTCACGGGCTTCATCGTC
实验方法如下：
将引物P1u,P1d,P2u,P2d,P3u,P3d混合,进行PCR反应,所得产物命名为W1；将引物P4u,P4d,P5u,P5d,P6u,P6d混合,进行PCR反应,所得产物命名为W2；将引物 P7u,P7d,P8u,P8d,P9u,P9d混合,进行PCR反应,所得产物命名为W3；然后将上述三个产物 W1,W2,W3混合做为模板,用引物P1u,P9d进行PCR反应即得到优化后I型牛疱疹病毒的gD 基因。上述四个PCR(TOYOBO公司产品,货号：02510D1)反应条件如下：94℃,2分钟X1 个循环；(98℃,15秒,55℃,30秒,68℃,30秒)X30个循环；72℃,7分钟X1个循环。测序证明序列正确后,将此PCR产物用NdeI和XhoI限制性内切酶(购自NEB公司)进行双酶切之后, ***到用相同两个酶切处理的pET30a(Novagen产品,货号69909-3)载体中。
实施例2构建针对I型牛疱疹病毒核心蛋白I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体
(1)单克隆抗体(只针对结合gD抗原蛋白23-30aa的抗体)细胞株的获得
a.将构建成功的pET30a-gD载体转化至BL21表达菌种表达纯化后获得gD抗原蛋白
b.用获得的gD抗原蛋白免疫小鼠
c.用单克隆抗体技术筛选到只针对结合gD抗原蛋白23-30aa的抗体细胞株
(2)细胞RNA的提取
用TRIzolLS(invitrogen产品,货号10296-010)试剂,按照说明书操作步骤提取细胞总RNA。
cDNA第一链的合成
取1μgRNA做逆转录模板,Oligo(d)T1μl做逆转录引物,
加DEPC水至总体积12μl,混匀；
70℃变性5min,迅速冰浴冷却；
依次加入5×缓冲液4μl,RNase抑制剂1μl,dNTP(10mMeach)2μl,混匀
37℃孵育5min；
加入AMV逆转录酶1μl；
37℃反转录60min；
70℃10min终止反应；
冰上冷却。
(3)以逆转录cDNA为模板,按照以下引物,用RT-PCR扩增重链轻链基因。
mHVu1:GATGTGAAGCTTCAGGAGTC
mHVu2:CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC
mHVu3:CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC
mHVu4:CAGGTTACTCTGAAAGAGTC
mHVu5:AAGGTCCAGCTGCAACAATC
mHVu6:GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC
mHVu7:CAGGTCCAACTGCAGCAGCC
mHVu8:GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC
mHVu9:GAGGTGAAGCTGGTGGAATC
mHVu10:GATGTGAACTTGGAAGTGTC
mHVd1:TGCAGAGACAGTGACCAGAGT
mHVd2:TGAGGAGACTGTGAGAGTGGT
mHVd3:TGAGGAGACGGTGACTGAGGT
mHVd4:TGAGGAGACGGTGACCGTGGT
mKVu1:GATGTTTTGATGACCCAAACT
mKVu2:GATATTGTGATGACGCAGGCT
mKVu3:GATATTGTGATAACCCAG
mKVu4:GACATTGTGCTGACCCAATCT
mKVu5:GACATTGTGATGACCCAGTCT
mKVu6:GATATTGTGCTAACTCAGTCT
mKVu7:GATATCCAGATGACACAGACT
mKVu8:GACATCCAGCTGACTCAGTCT
mKVu9:CAAATTGTTCTCACCCAGTCT
mKVd1:CCGTTTCAGCTCCAGCTTG
mKVd2:CCGTTTTATTTCCAGCTTGGT
mKVd3:CCGTTTTATTTCCAACTTTG
用引物mHVu1—mHVu10分别与mHVd1—mHVd4组合；mKVu1—mKVu9分别与mKVd1—mKVd4组合做PCR反应。
PCR反应体系25μl,其中cDNA0.5μl,上游引物0.25μl下游引物0.25μl,Taq酶0.2μldNTP 2μl10×buffer2.5μl。
PCR(TOYOBO公司产品,货号：02510D1),PCR条件为：94℃,2分钟X1个循环；(98℃,5秒,55℃,30秒,68℃,25秒)X30个循环；72℃,7分钟X1个循环。
经测序验证后确定重链和轻链基因,然后通过递归PCR将重链和轻链基因连接起来,此重组基因为rscFv。rscFv序列如下:
GAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCTCCTCGGTGAAGGTCT CCTGCACCAGCAGCGAAGTGACCTTCAGCAGCTTCGCTATCAGCTGGGTGCGCCAGGCCCC GGGTCAAGGCCTGGAGTGGCTGGGTGGTATTAGCCCGATGTTTGGCACCCCGAACTATGCAC AGAAGTTCCAGGGCCGCGTCACGATTACCGCGGACCAGAGCACCCGCACCGCGTATATGGA TCTGCGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGCAGCCCGAGCTATA TTTGCAGCGGCGGCACCTGCGTGTTTGATCATTGGGGCCAGGGCACCTCAGTCACCGTCTCC TCAGGCGGCGGCGGCAGCGATATTGTGATAACCCAGCCGTCGGTGTCCAAGGGCTTGCGCC AGACCGCCACACTGACCTGCACTGGTAACAGCAACAATGTGGGCAACCAAGGTGCAGCTTG GCTGCAGCAGCACCAGGGCCACCCTCCCAAACTGCTGTCCTACAGGAATAACGATCGCCCC TCAGGTATTTCAGAGCGCTTTTCTGCATCCCGCTCAGGTAACACAGCCTCCCTGACCATTACT GGCCTGCAGCCTGAGGACGAGGCTGACTATTACTGCTCAACCTGGGACAGCAGCCTCAGTG CTGTGGTGTTCGGCGGCACAAAGTTGGAAATAAAACGG
实施例3含有I型牛疱疹病毒gD抗原基因(38-292aa)和针对I型牛疱疹病毒gD抗原的单链抗体基因(23-30aa)重组,并进行表达
(1)通过递归PCR将有I型牛疱疹病毒gD抗原基因(38-292aa)和针对I型牛疱疹病毒 gD抗原的单链抗体基因(23-30aa)连接在一起,用NdeI和XhoI限制性内切酶(购自NEB公司)进行双酶切之后,***到用相同两个酶切处理的pET30a(Novagen产品,货号69909-3)载体中。gD-rscFv融合序列如下:
CCTCGTTATAATTACACCGAACGCTGGCATACCACCGGTCCGATTCCGAGCCCGTTTGCCGAT GGCCGCGAACAGCCGGTGGAAGTTCGTTATGCAACCAGTGCAGCCGCCTGCGATATGCTGG CCCTGATTGCCGATCCGCAGGTGGGTCGCACCCTGTGGGAAGCAGTGCGTCGTCATGCACG CGCCTATAATGCAACCGTTATTTGGTATAAAATCGAAAGTGGCTGTGCACGCCCGCTGTATTA TATGGAATATACCGAATGTGAACCGCGCAAACATTTTGGTTATTGCCGTTATCGTACCCCGCC GTTTTGGGATAGCTTTCTGGCAGGCTTTGCCTATCCGACCGATGATGAACTGGGTCTGATTAT GGCCGCACCGGCCCGTCTGGTGGAAGGCCAATATCGTCGCGCACTGTATATTGATGGCACCG TTGCATATACCGATTTTATGGTTAGTCTGCCGGCCGGCGATTGCTGGTTTAGTAAACTGGGTG CCGCACGTGGTTATACCTTTGGCGCATGCTTTCCGGCCCGTGATTATGAACAGAAAAAAGTG CTGCGCCTGACCTATCTGACCCAGTATTATCCGCAGGAAGCCCATAAAGCAATTGTGGATTAT TGGTTTATGCGCCATGGCGGCGTTGTTCCGCCGTATTTTGAAGAAAGCAAAGGCTATGAACC GCCGCCGGCAGCAGATGGTGGTAGTCCGGCACCGCCGGGTGACGATGAAGCCCGTGAAGAT GAAGGTGAAACCGAAGATGAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCT GGCTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCACCAGCAGCGAAGTGACCTTCAGCAGCTTCGCTATCA GCTGGGTGCGCCAGGCCCCGGGTCAAGGCCTGGAGTGGCTGGGTGGTATTAGCCCGATGTT TGGCACCCCGAACTATGCACAGAAGTTCCAGGGCCGCGTCACGATTACCGCGGACCAGAGC ACCCGCACCGCGTATATGGATCTGCGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTG TGCGCGCAGCCCGAGCTATATTTGCAGCGGCGGCACCTGCGTGTTTGATCATTGGGGCCAGGGCACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGCGGCGGCGGCAGCGATATTGTGATAACCCAGCCGTCG GTGTCCAAGGGCTTGCGCCAGACCGCCACACTGACCTGCACTGGTAACAGCAACAATGTGG GCAACCAAGGTGCAGCTTGGCTGCAGCAGCACCAGGGCCACCCTCCCAAACTGCTGTCCTA CAGGAATAACGATCGCCCCTCAGGTATTTCAGAGCGCTTTTCTGCATCCCGCTCAGGTAACA CAGCCTCCCTGACCATTACTGGCCTGCAGCCTGAGGACGAGGCTGACTATTACTGCTCAACC TGGGACAGCAGCCTCAGTGCTGTGGTGTTCGGCGGCACAAAGTTGGAAATAAAACGG
(2)将上述重组蛋白基因的表达载体转化至大肠杆菌BL21中,涂布于含100ug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程服务有限公司,货号：KB0286)的LB平板上,37℃过夜培养,挑取单克隆菌落,用含有相同浓度的硫酸卡那霉素的300mlLB培养基37℃培养至OD600达0.6 左右,用浓度为0.5mM的IPTG(生工,货号：IB0168)进行诱导表达,诱导条件为：37℃,转速 250rpm,5h。诱导之后,将培养液4℃5000rpm离心20min收集菌体。
实施例4含有I型牛疱疹病毒重组蛋白的纯化及复性
将菌体用50ml包涵体抽提液(20mMTris-HCl,0.5MUreapH7.5,0.5MNaCl,2％Triton X-100)重悬,然后超声破碎,条件为每次超声3s,间隔6s,共180次,12000rpm,4℃离心收集包涵体沉淀。用上样缓冲液BindingBuffer(50mMTris,8MUrea,0.5MNacl,20mM咪唑pH8.0)50ml 破碎包涵体,上柱纯化,用洗脱缓冲液ElutionBuffer(50mMTris,8MUrea,0.5MNacl,300mM咪唑pH8.0)洗脱目的蛋白。将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液(1mM氧化型谷胱甘肽 GSSH,2mM还原型谷胱甘肽GSH,2mMEDTA,20mMTris,pH8.5)透析,每隔48h换一次透析液。取出透析后的蛋白液,经据乙醇-20000进行浓缩,于-20℃保存备用。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州亿米诺生物科技有限公司
<120> 一种I型牛疱疹病毒重组蛋白及其制备方法和应用
<130> 2
<160> 46
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 255
<212> PRT
<213> gD抗原基因GenBank：（AFB76672.1）的38-292aa蛋白质序列
<400> 1
Pro Arg Tyr Asn Tyr Thr Glu Arg Trp His Thr Thr Gly Pro Ile Pro
1 5 10 15
Ser Pro Phe Ala Asp Gly Arg Glu Gln Pro Val Glu Val Arg Tyr Ala
20 25 30
Thr Ser Ala Ala Ala Cys Asp Met Leu Ala Leu Ile Ala Asp Pro Gln
35 40 45
Val Gly Arg Thr Leu Trp Glu Ala Val Arg Arg His Ala Arg Ala Tyr
50 55 60
Asn Ala Thr Val Ile Trp Tyr Lys Ile Glu Ser Gly Cys Ala Arg Pro
65 70 75 80
Leu Tyr Tyr Met Glu Tyr Thr Glu Cys Glu Pro Arg Lys His Phe Gly
85 90 95
Tyr Cys Arg Tyr Arg Thr Pro Pro Phe Trp Asp Ser Phe Leu Ala Gly
100 105 110
Phe Ala Tyr Pro Thr Asp Asp Glu Leu Gly Leu Ile Met Ala Ala Pro
115 120 125
Ala Arg Leu Val Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Ala Leu Tyr Ile Asp Gly
130 135 140
Thr Val Ala Tyr Thr Asp Phe Met Val Ser Leu Pro Ala Gly Asp Cys
145 150 155 160
Trp Phe Ser Lys Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Cys
165 170 175
Phe Pro Ala Arg Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu Arg Leu Thr Tyr
180 185 190
Leu Thr Gln Tyr Tyr Pro Gln Glu Ala His Lys Ala Ile Val Asp Tyr
195 200 205
Trp Phe Met Arg His Gly Gly Val Val Pro Pro Tyr Phe Glu Glu Ser
210 215 220
Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro Ala Ala Asp Gly Gly Ser Pro Ala Pro
225 230 235 240
Pro Gly Asp Asp Glu Ala Arg Glu Asp Glu Gly Glu Thr Glu Asp
245 250 255
<210> 2
<211> 765
<212> PRT
<213> gD抗原基因GenBank：（AFB76672.1）的38-292aa蛋白质经过密码子优化后序列
<400> 2
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Cys Cys Gly Ala Ala Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Ala Thr Ala Cys
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Gly Gly Thr Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Cys Gly Ala Ala Ala Gly
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Ala Thr Ala Cys Cys Gly Ala Ala Thr Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys
260 265 270
Gly Cys Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly Thr
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Thr Ala Thr Thr Gly Cys Cys Gly Thr Thr Ala Thr Cys Gly Thr Ala
290 295 300
Cys Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Thr Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala
305 310 315 320
Thr Ala Gly Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Cys
325 330 335
Thr Thr Thr Gly Cys Cys Thr Ala Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly
340 345 350
Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr
355 360 365
Gly Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Gly
370 375 380
Gly Cys Cys Cys Gly Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly
385 390 395 400
Gly Cys Cys Ala Ala Thr Ala Thr Cys Gly Thr Cys Gly Cys Gly Cys
405 410 415
Ala Cys Thr Gly Thr Ala Thr Ala Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys
420 425 430
Ala Cys Cys Gly Thr Thr Gly Cys Ala Thr Ala Thr Ala Cys Cys Gly
435 440 445
Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Gly Thr Cys Thr
450 455 460
Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly Ala Thr Thr Gly Cys
465 470 475 480
Thr Gly Gly Thr Thr Thr Ala Gly Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly
485 490 495
Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Ala Cys Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ala
500 505 510
Thr Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys Gly Cys Ala Thr Gly Cys
515 520 525
Thr Thr Thr Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Thr
530 535 540
Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr
545 550 555 560
Gly Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Ala Thr
565 570 575
Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Ala Thr Thr Ala Thr Cys
580 585 590
Cys Gly Cys Ala Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Thr Ala Ala
595 600 605
Ala Gly Cys Ala Ala Thr Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr Thr Ala Thr
610 615 620
Thr Gly Gly Thr Thr Thr Ala Thr Gly Cys Gly Cys Cys Ala Thr Gly
625 630 635 640
Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Thr Gly Thr Thr Cys Cys Gly Cys Cys
645 650 655
Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys
660 665 670
Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr Ala Thr Gly Ala Ala Cys Cys Gly Cys
675 680 685
Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly
690 695 700
Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly
705 710 715 720
Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Ala Cys Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly
725 730 735
Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly
740 745 750
Thr Gly Ala Ala Ala Cys Cys Gly Ala Ala Gly Ala Thr
755 760 765
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 设计引物（P1u）
<400> 3
gcccatatgc ctcgttataa ttacaccgaa cgctggcata ccaccggtcc gattccg 57
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 设计引物（P1d）
<400> 4
ataacgaact tccaccggct gttcgcggcc atcggcaaac gggctcggaa tcggaccggt 60
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 设计引物（P2u）
<400> 5
gtggaagttc gttatgcaac cagtgcagcc gcctgcgata tgctggccct gattgccg 58
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 设计引物（P2d）
<400> 6
gacgacgcac tgcttcccac agggtgcgac ccacctgcgg atcggcaatc agggcca 57
<210> 7
<211> 56
<212> DNA
<213> 设计引物（P3u）
<400> 7
aagcagtgcg tcgtcatgca cgcgcctata atgcaaccgt tatttggtat aaaatc 56
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> 设计引物（P3d）
<400> 8
ggtatattcc atataataca gcgggcgtgc acagccactt tcgattttat accaaat 57
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 设计引物（P4u）
<400> 9
tatatggaat ataccgaatg tgaaccgcgc aaacattttg gttattgccg ttatcgtac 59
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> 设计引物（P4d）
<400> 10
cggataggca aagcctgcca gaaagctatc ccaaaacggc ggggtacgat aacggcaa 58
<210> 11
<211> 55
<212> DNA
<213> 设计引物（P5u）
<400> 11
aggctttgcc tatccgaccg atgatgaact gggtctgatt atggccgcac cggcc 55
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 设计引物（P5d）
<400> 12
gccatcaata tacagtgcgc gacgatattg gccttccacc agacgggccg gtgcggccat 60
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 设计引物（P6u）
<400> 13
actgtatatt gatggcaccg ttgcatatac cgattttatg gttagtctgc cggccggcg 59
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> 设计引物（P6d）
<400> 14
aaaggtataa ccacgtgcgg cacccagttt actaaaccag caatcgccgg ccggcagac 59
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 设计引物（P7u）
<400> 15
tttggcgcat gctttccggc ccgtgattat gaacagaaaa aagtgctgcg cctgacctat 60
<210> 16
<211> 58
<212> DNA
<213> 设计引物（P7d）
<400> 16
ccacaattgc tttatgggct tcctgcggat aatactgggt cagataggtc aggcgcag 58
<210> 17
<211> 57
<212> DNA
<213> 设计引物（P8u）
<400> 17
ataaagcaat tgtggattat tggtttatgc gccatggcgg cgttgttccg ccgtatt 57
<210> 18
<211> 58
<212> DNA
<213> 设计引物（P8d）
<400> 18
ccatctgctg ccggcggcgg ttcatagcct ttgctttctt caaaatacgg cggaacaa 58
<210> 19
<211> 52
<212> DNA
<213> 设计引物（P9u）
<400> 19
gccggcagca gatggtggta gtccggcacc gccgggtgac gatgaagccc gt 52
<210> 20
<211> 48
<212> DNA
<213> 设计引物（P9d）
<400> 20
gccctcgaga tcttcggttt caccttcatc ttcacgggct tcatcgtc 48
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu1）
<400> 21
gatgtgaagc ttcaggagtc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu2）
<400> 22
caggtgcagc tgaaggagtc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu3）
<400> 23
caggtgcagc tgaagcagtc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu4）
<400> 24
caggttactc tgaaagagtc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu5）
<400> 25
aaggtccagc tgcaacaatc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu6）
<400> 26
gaggtccagc tgcagcagtc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu7）
<400> 27
caggtccaac tgcagcagcc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu8）
<400> 28
gaggtgaagc tggtggagtc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu9）
<400> 29
gaggtgaagc tggtggaatc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVu10）
<400> 30
gatgtgaact tggaagtgtc 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVd1）
<400> 31
tgcagagaca gtgaccagag t 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVd2）
<400> 32
tgaggagact gtgagagtgg t 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mHVd3）
<400> 33
tgaggagacg gtgactgagg t 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物(9mHVd4)
<400> 34
tgaggagacg gtgaccgtgg t 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu1）
<400> 35
gatgttttga tgacccaaac t 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu2）
<400> 36
gatattgtga tgacgcaggc t 21
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu3）
<400> 37
gatattgtga taacccag 18
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu4）
<400> 38
gacattgtgc tgacccaatc t 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu5）
<400> 39
gacattgtga tgacccagtc t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu6）
<400> 40
gatattgtgc taactcagtc t 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu7）
<400> 41
gatatccaga tgacacagac t 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu8）
<400> 42
gacatccagc tgactcagtc t 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVu9）
<400> 43
caaattgttc tcacccagtc t 21
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVd1）
<400> 44
ccgtttcagc tccagcttg 19
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVd2）
<400> 45
ccgttttatt tccagcttgg t 21
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计引物（mKVd3）
<400> 46
ccgttttatt tccaactttg 20
<210> 47
<211> 714
<212> DNA
<213> rscFv
<400> 47
gaggtgaagc tggtggaatc tggcgctgag gtgaagaagc ctggctcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcacca gcagcgaagt gaccttcagc agcttcgcta tcagctgggt gcgccaggcc 120
ccgggtcaag gcctggagtg gctgggtggt attagcccga tgtttggcac cccgaactat 180
gcacagaagt tccagggccg cgtcacgatt accgcggacc agagcacccg caccgcgtat 240
atggatctgc gcagcctgcg ctctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgcagcccg 300
agctatattt gcagcggcgg cacctgcgtg tttgatcatt ggggccaggg cacctcagtc 360
accgtctcct caggcggcgg cggcagcgat attgtgataa cccagccgtc ggtgtccaag 420
ggcttgcgcc agaccgccac actgacctgc actggtaaca gcaacaatgt gggcaaccaa 480
ggtgcagctt ggctgcagca gcaccagggc caccctccca aactgctgtc ctacaggaat 540
aacgatcgcc cctcaggtat ttcagagcgc ttttctgcat cccgctcagg taacacagcc 600
tccctgacca ttactggcct gcagcctgag gacgaggctg actattactg ctcaacctgg 660
gacagcagcc tcagtgctgt ggtgttcggc ggcacaaagt tggaaataaa acgg 714
<210> 48
<211> 1479
<212> DNA
<213> gD-rscFv融合序列
<400> 48
cctcgttata attacaccga acgctggcat accaccggtc cgattccgag cccgtttgcc 60
gatggccgcg aacagccggt ggaagttcgt tatgcaacca gtgcagccgc ctgcgatatg 120
ctggccctga ttgccgatcc gcaggtgggt cgcaccctgt gggaagcagt gcgtcgtcat 180
gcacgcgcct ataatgcaac cgttatttgg tataaaatcg aaagtggctg tgcacgcccg 240
ctgtattata tggaatatac cgaatgtgaa ccgcgcaaac attttggtta ttgccgttat 300
cgtaccccgc cgttttggga tagctttctg gcaggctttg cctatccgac cgatgatgaa 360
ctgggtctga ttatggccgc accggcccgt ctggtggaag gccaatatcg tcgcgcactg 420
tatattgatg gcaccgttgc atataccgat tttatggtta gtctgccggc cggcgattgc 480
tggtttagta aactgggtgc cgcacgtggt tatacctttg gcgcatgctt tccggcccgt 540
gattatgaac agaaaaaagt gctgcgcctg acctatctga cccagtatta tccgcaggaa 600
gcccataaag caattgtgga ttattggttt atgcgccatg gcggcgttgt tccgccgtat 660
tttgaagaaa gcaaaggcta tgaaccgccg ccggcagcag atggtggtag tccggcaccg 720
ccgggtgacg atgaagcccg tgaagatgaa ggtgaaaccg aagatgaggt gaagctggtg 780
gaatctggcg ctgaggtgaa gaagcctggc tcctcggtga aggtctcctg caccagcagc 840
gaagtgacct tcagcagctt cgctatcagc tgggtgcgcc aggccccggg tcaaggcctg 900
gagtggctgg gtggtattag cccgatgttt ggcaccccga actatgcaca gaagttccag 960
ggccgcgtca cgattaccgc ggaccagagc acccgcaccg cgtatatgga tctgcgcagc 1020
ctgcgctctg aggacacggc cgtgtattac tgtgcgcgca gcccgagcta tatttgcagc 1080
ggcggcacct gcgtgtttga tcattggggc cagggcacct cagtcaccgt ctcctcaggc 1140
ggcggcggca gcgatattgt gataacccag ccgtcggtgt ccaagggctt gcgccagacc 1200
gccacactga cctgcactgg taacagcaac aatgtgggca accaaggtgc agcttggctg 1260
cagcagcacc agggccaccc tcccaaactg ctgtcctaca ggaataacga tcgcccctca 1320
ggtatttcag agcgcttttc tgcatcccgc tcaggtaaca cagcctccct gaccattact 1380
ggcctgcagc ctgaggacga ggctgactat tactgctcaa cctgggacag cagcctcagt 1440
gctgtggtgt tcggcggcac aaagttggaa ataaaacgg 1479
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