一种人工密码子优化的伪狂犬病毒类gE蛋白及其用途
阅读说明：本技术 一种人工密码子优化的伪狂犬病毒类gE蛋白及其用途 (Artificial codon optimized pseudorabies virus gE protein and application thereof ) 是由 付永锋 周晶雨 程训佳 于 2018-06-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,具体涉及一种人工密码子优化的伪狂犬病毒类gE蛋白及其编码基因及其用途,本发明通过人工密码子优化与合成可被伪狂犬病毒gE抗体识别的类gE蛋白基因,利用人工合成核苷酸序列构建表达载体,并经过western blotting、ELISA、测序分析伪狂犬病毒类gE蛋白与伪狂犬病毒gE抗体的特异性识别能力。本发明获得的伪狂犬病毒类gE蛋白能用于制备猪感染伪狂犬病毒野生株的鉴别诊断试剂盒。(The invention belongs to the field of biotechnology, and particularly relates to a pseudorabies virus gE protein with optimized artificial codons, an encoding gene thereof and application thereof. The pseudorabies virus gE protein obtained by the invention can be used for preparing a differential diagnosis kit for a wild strain of the porcine pseudorabies virus.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及伪狂犬病毒类gE蛋白，具体涉及一种人工密码子优化的伪狂犬病毒类gE蛋白及其编码基因及其用途。获得的伪狂犬病毒类gE蛋白可用于制备猪感染伪狂犬病毒野生株的鉴别诊断试剂盒。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是世界动物卫生组织(OIE)通报的传染病，也是“国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020)”中被列为优先防治的猪病之一，该疾患是由伪狂犬病病毒(Pseudo rabievims,PRV)引起的多种家畜和野生动物如猪、牛、羊、犬、家兔小鼠、水貂、狐等发病的一种急性传染病。实践中猪感染PRV后临床表现多样，新生仔猪呈现神经系统紊乱和死亡，成年猪表现呼吸困难、母猪繁殖障碍为特征，给养猪业造成严重的经济损失。近年来随着PRV缺失疫苗的广泛应用，该疾患的防控取得了显著效果，但随着猪场混合感染的发生，导致伪狂犬病的发病逐年上升。因此，建立快速有效的诊断检测方法对控制和根除伪狂犬病具有重要意义。
研究公开了伪狂犬gE蛋白是一种囊膜糖蛋白，其功能是促进细胞融合，介导PRV在神经细胞内的传导，一旦缺失gE基因，PRV不能有效的在神经细胞之间运输，严重影响PRV对神经系统的侵害；但是，缺失gE基因并不影响PRV侵入宿主细胞，也不影响PRV在宿主细胞内的复制，因此，gE基因的缺失是PRV疫苗的必须缺失基因，在鉴别诊断中具有重要的意义。
由于猪伪狂犬病gE基因缺失疫苗的使用，可通过检测猪血清中gE抗体的存在，鉴别诊断是否猪感染PRV野毒株。目前，已有研究利用大肠杆菌或酵母等表达系统的表达产物制备猪伪狂犬病毒gE蛋白并建立了相应的血清中gE抗体的ELISA鉴别诊断方法，但由于gE基因中有大量GC核苷酸碱基的存在，其所占比例高达74％，所以大肠杆菌或酵母表达系统中难以表达或产量低，因而，目前PRV的gE制备，多采用将gE基因进行截断而制备gE蛋白的多肽片段，从而提高gE在大肠杆菌或酵母表达系统中表达产量。因此，能够制备被抗完整伪狂犬病毒gE蛋白抗体所识别的抗原，将有利于提高血清抗体的检测率及特异性，更适用于鉴别诊断。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种人工密码子优化的伪狂犬病毒类gE蛋白及其编码基因及其用途，获得的伪狂犬病毒类gE蛋白可用于制备猪感染伪狂犬病毒野生株的鉴别诊断试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一种人工密码子优化的可被抗伪狂犬病毒gE抗体所识别的类gE蛋白及其编码基因，及其用途。
本发明通过人工密码子优化与合成可被伪狂犬病毒gE抗体识别的类gE蛋白基因，利用人工合成核苷酸序列构建表达载体，经过western blotting、ELISA、测序分析伪狂犬病毒类gE蛋白与伪狂犬病毒gE抗体的特异性识别能力，获得伪狂犬病毒类gE蛋白；本发明获得的伪狂犬病毒类gE蛋白能用于制备猪感染伪狂犬病毒野生株的鉴别诊断试剂盒。
具体的，
本发明提供了一种人工密码子优化的可被抗伪狂犬病毒gE抗体所识别的类gE蛋白及其编码基因，然而产生本发明的基因序列的方法不受特别的限制。
编码所述的可被抗伪狂犬病毒gE抗体所识别的类gE蛋白编码核苷酸序列为SEQ1，其氨基酸序列为SEQ2。
含有编码本发明的可被抗伪狂犬病毒gE抗体所识别的类gE蛋白及其编码基因的质粒载体构成了本发明的一个部分。
本发明提供了一种质粒载体，含有编码所述的可被抗伪狂犬gE抗体所识别的类gE蛋白的DNA，它能***编码本发明的被抗伪狂犬gE抗体所识别的类gE蛋白的编码基因。本发明的质粒不受特别限制，优选pET19b。
表达本发明的含有被抗伪狂犬gE抗体所识别的类gE蛋白的宿主细胞构成了本发明的一个部分。
本发明提供了一种大肠杆菌JM109感受态细胞为宿主细胞，它能表达本发明的被抗伪狂犬gE抗体所识别的类gE蛋白。本发明的宿主细胞不受特别的限制。
在本发明的实施例中，筛选能表达被抗伪狂犬gE抗体所识别的类gE蛋白的质粒载体的方法不受特别的限制，可通过例如免疫印迹、ELISA等进行选择。
本发明的实施例中，纯化被抗伪狂犬gE抗体所识别的类gE蛋白的方法不受特别的限制，但首选是通过表达蛋白上携带的6×His Tag经Ni-NTA柱纯化。
本发明所制备被抗伪狂犬gE抗体所识别的类gE蛋白鉴定的方法不受特别限制，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blotting等。
本发明的另一个目的在于提供含有如前所述被抗伪狂犬gE抗体所识别的类gE蛋白活性成分的血清学检测方法。
本发明的进一步目的在于提供所述的被抗伪狂犬gE抗体所识别的类gE蛋白用于制备检测伪狂犬病的血清学检测试剂盒中的用途。
本发明的被抗伪狂犬gE抗体所识别的类gE蛋白能够在大肠杆菌表达系统中高效表达，并可被伪狂犬病野毒株感染的猪的血清所特异性识别，而不被疫苗免疫的猪的血清识别，对伪狂病鉴别诊断具有实践应用价值。
附图说明
图1，伪狂犬病毒gE蛋白基因GC分析图。
图2，伪狂犬病毒gE蛋白密码子分析图。
图3，伪狂犬病毒类gE蛋白GC分析图。
图4，伪狂犬病毒类gE蛋白密码子分析图。
图5，重组伪狂犬病毒类gE蛋白western blot检测，
其中，M为低分子量蛋白marker；1为重组重组伪狂犬病毒类gE蛋白经CBB染色；2重组重组伪狂犬病毒类gE蛋白与mouse anti-his IgG抗体反应结果。
表1伪狂犬病毒类gE蛋白与猪血清中gE抗体ELSIA检测值。
具体实施方式
实施例1伪狂犬病毒gE基因分析及编码的优化与改造
对伪狂犬病毒gE基因进行GC含量及分布进行分析，评估gE基因中密码子在原核表达系统中的翻译效率，结果显示gE基因中GC在整个序列中平均分布在70％(如图1所示)，其中仅有40％的密码子可在原核表达表达系统高效翻译，38％的密码子翻译效率仅在50-60％(如图2所示)，说明伪狂犬病毒的完整gE蛋白不适合在原核表达系统中表达。根据原核表达系统对密码子的选择性，将gE基因上不适合的翻译的密码子进行逐一优化，经过优化后，GC在整个序列中平均含量降低到50％(如图3所示)，95％的密码子在原核表达系统中翻译效率在90％以上(如图4所示)；为了提高gE蛋白结构稳定性，将N末端的10个疏水性氨基酸碱基去除，并将295位的精氨酸残基突变为脯氨酸，最后形成一个伪狂犬病毒类gE蛋白基因SEQ1，氨基酸序列为SEQ2。
实施例2构建重组伪狂病毒类gE蛋白表达质粒pET19b-like-gE
将人工合成的伪狂犬病毒类gE蛋白基因通过NdeI和BamHI酶切PCR扩增产物***pET19b载体中，转入大肠杆菌JM109，将菌液涂布于LB琼脂板(含氨苄青100μg/ml，氯霉素34μg/ml)，37℃过夜培养后，挑取克隆，抽提重组质粒进行双酶切鉴定，结果显示，成功构建了伪狂犬病毒类gE蛋白的重组质粒pET19b-like-gE，经测序鉴定(由上海英俊生物有限公司对该重组质粒进行测序鉴定)，并采用Vector NTI 10软件，推定氨基酸序列，其结果于原始设计的伪狂犬病毒类gE基因一致。
实施例3表达及纯化重组伪狂犬病毒类gE蛋白
重组质粒pET19b-like-gE转化大肠杆菌BL21 Star(DE3)pLysS后，涂布于LB琼脂板(含氨苄青100μg/ml，氯霉素34μg/ml)，37℃温箱中培养过夜，挑选单一菌落入800ml LB培养液(含氨苄青50μg/ml，氯霉素34μg/ml)中，37℃220rmp振摇，培养至OD600约为0.5时，加入1mM的IPTG，37℃诱导3小时，4℃8000rpm离心10分钟，弃上清，收集细菌沉淀。细菌裂解后，上清通过选用His结合树脂(Novagen,Madison,Wis.)进行提纯，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其纯度。经12.5％的SDS-PAGE检测，IPTG诱导的菌液在分子量大约50kD处出现目的蛋白表达条带(如图5所示)。
实施例4重组伪狂犬病毒类gE蛋白Western blotting检测
取6μg重组伪狂犬病毒类gE蛋白，加等体积样品缓冲液、1/10体积β-巯基乙醇，混匀后95℃变性5分钟，14000rpm离心10分钟，上清用于SDS-PAGE上样。电泳结束后，将蛋白电转到PVDF膜上，电转结束后，PBST洗膜30分钟后，加含5％脱脂奶的PBS，湿盒内室温封闭1小时；吸弃封闭液，加对mouse anti-his抗体(1：250稀释)，4℃孵育过夜；PBST洗膜，30分钟；加HRP-Goat Anti-mouse IgG抗体(1:250稀释)，室温孵育1小时；PBST洗膜，30分钟，以Konica Immunostaining HRP-100显色，20min后终止反应，Western blot结果显示重组伪狂犬病毒类gE蛋白可与anti-his蛋白结合，50kD处的蛋白条带为带有his标签的伪狂犬病毒类gE蛋白(如图5所示)。
实施例5重组蛋白敏感性与特异性检测
96孔酶标板每孔加入含0.5μg重组的伪狂犬病类gE蛋白的Coating Buffer 100μl，4℃湿盒中过夜，PBS(含0.05％Tween20)洗板后每孔加入含3％脱脂奶的PBS 400μl，湿盒中室温封闭1h，每孔中分别加入100μl伪狂犬疫苗免疫猪或伪狂犬病毒野毒株感染猪的血清(1:200稀释)，湿盒中室温孵育1h，PBS(含0.05％Tween20)洗板后每孔中加入100μl辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG(1:1000稀释)100μl，湿盒中室温孵育1h，PBS(含0.05％Tween20)洗板后加入显色液200μl/孔，室温下避光反应30min，最后每孔加入2M H2SO4 50μl终止显色反应，酶标仪490nm测定吸光度；
ELISA检测结果显示，重组的伪狂犬病类gE蛋白与11份gE+gB+、11份gE-gB+，2份gE-gB-的猪血清中抗体的反应性，结果如表1所示；重组的伪狂犬病类gE蛋白与11份伪狂犬野毒株感染的gE+gB+血清反应均为阳性，敏感性为100％；14份伪狂犬病毒疫苗免疫的猪血清阴性对照(包括gE-gB+，2份gE-gB-的猪血清)中只有1例gE-gB+血清与伪狂犬病类gE蛋白反应阳性，特异性为92.9％(如表1所示)。
表1
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学
<120> 一种人工密码子优化的伪狂犬病毒类gE蛋白及其用途
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1689
<212> DNA
<213> pseudorables virus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1686)
<400> 1
atg acc gaa gca ccg agc ctg agc gca gaa acc aca ccg ggt cct gtt 48
Met Thr Glu Ala Pro Ser Leu Ser Ala Glu Thr Thr Pro Gly Pro Val
1 5 10 15
acc gaa gtt ccg agt ccg agt gcc gaa gtt tgg gat gat ctg agc acc 96
Thr Glu Val Pro Ser Pro Ser Ala Glu Val Trp Asp Asp Leu Ser Thr
20 25 30
gaa gca gat gat gat gac ctg aat ggt gat ctg gat ggt gat gat cgt 144
Glu Ala Asp Asp Asp Asp Leu Asn Gly Asp Leu Asp Gly Asp Asp Arg
35 40 45
cgt gca ggt ttt ggt agc gca ctg gca agc ctg cgt gaa gca ccg cct 192
Arg Ala Gly Phe Gly Ser Ala Leu Ala Ser Leu Arg Glu Ala Pro Pro
50 55 60
gca cat ctg gtt aat gtt agc gaa ggt gca aac ttt acc ctg gat gca 240
Ala His Leu Val Asn Val Ser Glu Gly Ala Asn Phe Thr Leu Asp Ala
65 70 75 80
cgt ggt gat ggt gca gtt ctg gca ggt att tgg acc ttt ctg ccg gtt 288
Arg Gly Asp Gly Ala Val Leu Ala Gly Ile Trp Thr Phe Leu Pro Val
85 90 95
cgt ggt tgt gat gca gtt agc gtt acc acc gtt tgt ttt gaa acc gca 336
Arg Gly Cys Asp Ala Val Ser Val Thr Thr Val Cys Phe Glu Thr Ala
100 105 110
tgt cat ccg gat ctg gtt ctg ggt cgt gca tgt gtt ccg gaa gca ccg 384
Cys His Pro Asp Leu Val Leu Gly Arg Ala Cys Val Pro Glu Ala Pro
115 120 125
gaa atg ggt att ggt gat tat ctg cct ccg gaa gtt ccg cgt ctg cgt 432
Glu Met Gly Ile Gly Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Val Pro Arg Leu Arg
130 135 140
cgt gaa ccg cct att gtt aca ccg gaa cgt tgg agt ccg cat ctg agc 480
Arg Glu Pro Pro Ile Val Thr Pro Glu Arg Trp Ser Pro His Leu Ser
145 150 155 160
gtt ctg cgt gca acc ccg aat gat acc ggt ctg tat acc ctg cat gat 528
Val Leu Arg Ala Thr Pro Asn Asp Thr Gly Leu Tyr Thr Leu His Asp
165 170 175
gca agc ggt ccg cgt gca gtt ttt ttt gtt gca gtt ggt gat cgt cct 576
Ala Ser Gly Pro Arg Ala Val Phe Phe Val Ala Val Gly Asp Arg Pro
180 185 190
ccg gca ccg gca gat ccg gtt ggt ccg gca cgt cat gaa ccg cgt ttt 624
Pro Ala Pro Ala Asp Pro Val Gly Pro Ala Arg His Glu Pro Arg Phe
195 200 205
cat gca ctg ggt ttt cat agc cag ctg ttt agt ccg ggt gat acc ttt 672
His Ala Leu Gly Phe His Ser Gln Leu Phe Ser Pro Gly Asp Thr Phe
210 215 220
gat ctg atg cct cgt gtt gtt agc gat atg ggt gat agc cgt gaa aac 720
Asp Leu Met Pro Arg Val Val Ser Asp Met Gly Asp Ser Arg Glu Asn
225 230 235 240
ttt aca gca acc ctg gat tgg tat tac gca cgt gca ccg cct cgt tgt 768
Phe Thr Ala Thr Leu Asp Trp Tyr Tyr Ala Arg Ala Pro Pro Arg Cys
245 250 255
ctg ctg tat tat gtt tat gaa ccg tgc att tat cat cct cgt gca ccg 816
Leu Leu Tyr Tyr Val Tyr Glu Pro Cys Ile Tyr His Pro Arg Ala Pro
260 265 270
gaa tgt ctg cgt ccg gtt gat cct gca tgt agc ttt acc tca ccg gca 864
Glu Cys Leu Arg Pro Val Asp Pro Ala Cys Ser Phe Thr Ser Pro Ala
275 280 285
cgt gcg cgt ctg gtt gca ccg cgt gcc tat gca agc tgt agt ccg ctg 912
Arg Ala Arg Leu Val Ala Pro Arg Ala Tyr Ala Ser Cys Ser Pro Leu
290 295 300
ctg ggt gat cgt tgg ctg acc gcc tgt ccg ttt gat gca ttt ggt gaa 960
Leu Gly Asp Arg Trp Leu Thr Ala Cys Pro Phe Asp Ala Phe Gly Glu
305 310 315 320
gaa gtt cat acc aac gca acc gca gat gaa agt ggt ctg tat gtt ctg 1008
Glu Val His Thr Asn Ala Thr Ala Asp Glu Ser Gly Leu Tyr Val Leu
325 330 335
gtt atg acc cat aat ggt cat gtt gca acc tgg gat tat acc ctg gtt 1056
Val Met Thr His Asn Gly His Val Ala Thr Trp Asp Tyr Thr Leu Val
340 345 350
gcc acc gca gca gaa tat gtt acc gtt att aaa gaa ctg acc gct ccg 1104
Ala Thr Ala Ala Glu Tyr Val Thr Val Ile Lys Glu Leu Thr Ala Pro
355 360 365
gca cgc gca ccg ggt aca cct tgg ggt cct ggt ggc ggt gat gat gca 1152
Ala Arg Ala Pro Gly Thr Pro Trp Gly Pro Gly Gly Gly Asp Asp Ala
370 375 380
att tat gtt gat ggt gtt aca aca ccg gca ccg cca gca cgt ccg tgg 1200
Ile Tyr Val Asp Gly Val Thr Thr Pro Ala Pro Pro Ala Arg Pro Trp
385 390 395 400
aat ccg tat ggt cgt acc act ccg ggt cgt ctg ttt gtg ctg gca ctg 1248
Asn Pro Tyr Gly Arg Thr Thr Pro Gly Arg Leu Phe Val Leu Ala Leu
405 410 415
ggt agc ttt gtt atg acc tgt gtt gtt ggt ggt gcc gtt tgg ctg tgt 1296
Gly Ser Phe Val Met Thr Cys Val Val Gly Gly Ala Val Trp Leu Cys
420 425 430
gtt ctg tgt agc cgt cgt cgt gcc gca agc cgt ccg ttt cgt gtt ccg 1344
Val Leu Cys Ser Arg Arg Arg Ala Ala Ser Arg Pro Phe Arg Val Pro
435 440 445
acg cgt gca cgt acc cac atg ctg agt ccg gtt tat acc agc ctg ccg 1392
Thr Arg Ala Arg Thr His Met Leu Ser Pro Val Tyr Thr Ser Leu Pro
450 455 460
aca cat gaa gat tat tat gat ggt gac gat gat gac gac gaa gaa gca 1440
Thr His Glu Asp Tyr Tyr Asp Gly Asp Asp Asp Asp Asp Glu Glu Ala
465 470 475 480
ggc gtt att cgt cgt cgt ccg gca tca cct ggt ggt gat agc ggt tat 1488
Gly Val Ile Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Gly Gly Asp Ser Gly Tyr
485 490 495
gaa ggt ccg tat gca agt ctg gac ccg gaa gat gaa ttt agc agt gat 1536
Glu Gly Pro Tyr Ala Ser Leu Asp Pro Glu Asp Glu Phe Ser Ser Asp
500 505 510
gaa gat gat ggc ctg tat gtg cgt ccg gaa gaa gct ccg cgt agc ggt 1584
Glu Asp Asp Gly Leu Tyr Val Arg Pro Glu Glu Ala Pro Arg Ser Gly
515 520 525
ttt gat gtt tgg ttt cgt gat ccg gaa aaa ccg gaa gtt acc aat ggt 1632
Phe Asp Val Trp Phe Arg Asp Pro Glu Lys Pro Glu Val Thr Asn Gly
530 535 540
ccg aat tat ggt gtg acc gca aat cgt ctg ctg atg agc cgt cct gca 1680
Pro Asn Tyr Gly Val Thr Ala Asn Arg Leu Leu Met Ser Arg Pro Ala
545 550 555 560
taa gga tcc 1689
Gly
<210> 2
<211> 560
<212> PRT
<213> pseudorables virus
<400> 2
Met Thr Glu Ala Pro Ser Leu Ser Ala Glu Thr Thr Pro Gly Pro Val
1 5 10 15
Thr Glu Val Pro Ser Pro Ser Ala Glu Val Trp Asp Asp Leu Ser Thr
20 25 30
Glu Ala Asp Asp Asp Asp Leu Asn Gly Asp Leu Asp Gly Asp Asp Arg
35 40 45
Arg Ala Gly Phe Gly Ser Ala Leu Ala Ser Leu Arg Glu Ala Pro Pro
50 55 60
Ala His Leu Val Asn Val Ser Glu Gly Ala Asn Phe Thr Leu Asp Ala
65 70 75 80
Arg Gly Asp Gly Ala Val Leu Ala Gly Ile Trp Thr Phe Leu Pro Val
85 90 95
Arg Gly Cys Asp Ala Val Ser Val Thr Thr Val Cys Phe Glu Thr Ala
100 105 110
Cys His Pro Asp Leu Val Leu Gly Arg Ala Cys Val Pro Glu Ala Pro
115 120 125
Glu Met Gly Ile Gly Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Val Pro Arg Leu Arg
130 135 140
Arg Glu Pro Pro Ile Val Thr Pro Glu Arg Trp Ser Pro His Leu Ser
145 150 155 160
Val Leu Arg Ala Thr Pro Asn Asp Thr Gly Leu Tyr Thr Leu His Asp
165 170 175
Ala Ser Gly Pro Arg Ala Val Phe Phe Val Ala Val Gly Asp Arg Pro
180 185 190
Pro Ala Pro Ala Asp Pro Val Gly Pro Ala Arg His Glu Pro Arg Phe
195 200 205
His Ala Leu Gly Phe His Ser Gln Leu Phe Ser Pro Gly Asp Thr Phe
210 215 220
Asp Leu Met Pro Arg Val Val Ser Asp Met Gly Asp Ser Arg Glu Asn
225 230 235 240
Phe Thr Ala Thr Leu Asp Trp Tyr Tyr Ala Arg Ala Pro Pro Arg Cys
245 250 255
Leu Leu Tyr Tyr Val Tyr Glu Pro Cys Ile Tyr His Pro Arg Ala Pro
260 265 270
Glu Cys Leu Arg Pro Val Asp Pro Ala Cys Ser Phe Thr Ser Pro Ala
275 280 285
Arg Ala Arg Leu Val Ala Pro Arg Ala Tyr Ala Ser Cys Ser Pro Leu
290 295 300
Leu Gly Asp Arg Trp Leu Thr Ala Cys Pro Phe Asp Ala Phe Gly Glu
305 310 315 320
Glu Val His Thr Asn Ala Thr Ala Asp Glu Ser Gly Leu Tyr Val Leu
325 330 335
Val Met Thr His Asn Gly His Val Ala Thr Trp Asp Tyr Thr Leu Val
340 345 350
Ala Thr Ala Ala Glu Tyr Val Thr Val Ile Lys Glu Leu Thr Ala Pro
355 360 365
Ala Arg Ala Pro Gly Thr Pro Trp Gly Pro Gly Gly Gly Asp Asp Ala
370 375 380
Ile Tyr Val Asp Gly Val Thr Thr Pro Ala Pro Pro Ala Arg Pro Trp
385 390 395 400
Asn Pro Tyr Gly Arg Thr Thr Pro Gly Arg Leu Phe Val Leu Ala Leu
405 410 415
Gly Ser Phe Val Met Thr Cys Val Val Gly Gly Ala Val Trp Leu Cys
420 425 430
Val Leu Cys Ser Arg Arg Arg Ala Ala Ser Arg Pro Phe Arg Val Pro
435 440 445
Thr Arg Ala Arg Thr His Met Leu Ser Pro Val Tyr Thr Ser Leu Pro
450 455 460
Thr His Glu Asp Tyr Tyr Asp Gly Asp Asp Asp Asp Asp Glu Glu Ala
465 470 475 480
Gly Val Ile Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Gly Gly Asp Ser Gly Tyr
485 490 495
Glu Gly Pro Tyr Ala Ser Leu Asp Pro Glu Asp Glu Phe Ser Ser Asp
500 505 510
Glu Asp Asp Gly Leu Tyr Val Arg Pro Glu Glu Ala Pro Arg Ser Gly
515 520 525
Phe Asp Val Trp Phe Arg Asp Pro Glu Lys Pro Glu Val Thr Asn Gly
530 535 540
Pro Asn Tyr Gly Val Thr Ala Asn Arg Leu Leu Met Ser Arg Pro Ala
545 550 555 560