重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用

文档序号：445355 发布日期：2021-12-28 浏览：21次 >En<

阅读说明：本技术 重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用 (Recombinant feline herpesvirus type 1 gB-gD protein and application thereof ) 是由孔迪方鹏飞滕小锘曹文龙张大鹤于 2021-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用。所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白包括：具有SEQ ID NO：2所示序列的第一蛋白；和/或,具有SEQ ID NO：6所示序列的第二蛋白。所述疫苗包含所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白以及医药学上可接受的载剂。本发明提供的重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的半衰期长,分子稳定性高,能形成二聚体特别是异二聚体,免疫原性强,同时其能通过哺乳动物细胞表达系统以生物反应器大规模无血清悬浮培养方式制备,不仅表达水平高,蛋白免疫原性好,而且由此制备的疫苗还具有质控容易、批次间稳定、生产成本低等优点。(The invention discloses a recombinant feline herpesvirus type 1 gB-gD protein and application thereof. The recombinant feline herpesvirus type 1 gB-gD protein comprises: has the sequence shown in SEQ ID NO: 2; and/or, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. The vaccine comprises the recombinant feline herpesvirus type 1 gB-gD protein and a pharmaceutically acceptable carrier. The recombinant feline herpesvirus type 1 gB-gD protein provided by the invention has long half-life, high molecular stability, strong immunogenicity, and can form dimers, particularly heterodimers, and be prepared in a bioreactor large-scale serum-free suspension culture manner through a mammalian cell expression system, so that the expression level is high, the protein immunogenicity is good, and the prepared vaccine also has the advantages of easiness in quality control, stability among batches, low production cost and the like.)

技术领域

本发明涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用，例如在制备猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗中的应用，属于动物免疫药物技术领域。

背景技术

猫疱疹病毒1型(Feline Herpesvirus type 1，FHV-1)是猫传染性鼻气管炎(Feline Infectious Rchinotracheitis，FIR)的致病原，是造成猫科动物急性上呼吸系统疾病的主要病原之一。FHV-1只感染猫科动物，其中幼猫最易感染，发病率可达到100％。FHV-1感染后主要侵害猫的上呼吸道和眼部，病猫会出现体温升高、精神沉郁、咳嗽、打喷嚏等上呼吸道症状以及眼脓性分泌物、角膜结膜炎等眼部症状，严重感染可造成小叶性肺炎，眼周皮肤溃疡。此外，患病猫康复后FHV-1仍可潜伏于三叉神经、视神经、扁桃体等部位造成终身带毒，在猫免疫力低下或发生应激反应时引起二次感染，引起慢性鼻窦炎、鼻甲骨变性、树枝状角膜炎等临床症状。目前，FHV-1在世界范围内均有流行，越来越多的野生猫科动物如猎豹、老虎等被发现感染FHV-1。由此可见FHV-1对猫科动物的生命和健康造成了严重的威胁。

FHV-1属于疱疹病毒目疱疹病毒科α疱疹病毒亚科成员，是有囊膜的线状双股DNA病毒，其基因组含78个开放阅读框(ORF)，编码74种蛋白质，其中含有23种病毒粒子相关蛋白，13种囊膜蛋白。目前已实验证实的糖蛋白有gB、gC、gD、gG、gE、gH、gI和gL，它们在病毒的识别、侵入、感染、释放中发挥重要作用(Fargeaud D，Jeannin C B，Kato F，etal.Biochemical Study of the Feline Herpesvirus 1 Identification ofGlycoproteins by Affinity[J].Arch Virol，1984，80(2-3)：69-82.)。其中gB蛋白具有高度保守性，是一种非常重要的中和抗原，可影响FHV-1感染侵入途径，与肝素样受体和病毒粒子的结合、以及细胞膜融合过程有关。gD蛋白是病毒囊膜的主要成分，具有高度的抗原性和保守性，能与细胞表面的特定分子发生特异性结合，在病毒复制和刺激机体产生中和抗体的过程中起重要作用，是宿主细胞免疫和体液免疫反应的主要靶细胞之一。

目前，疫苗免疫是防控FHV-1最主要的手段之一，主要有灭活疫苗和弱毒疫苗两种。减毒活疫苗是最常使用的疫苗，但它们有残留的毒性，如果接种不当可能会引起临床症状。现有的FHV-1疫苗能在未感染过病毒的猫身上产生合理的防病保护，但不能预防带毒病猫的感染或疾病的发展。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白，其包括：

第一蛋白，其具有SEQ ID NO：2所示序列或其增加或截短的序列，特别是与SEQ IDNO：2的全长序列95％以上相同的序列；

和/或，第二蛋白，其具有SEQ ID NO：6所示序列或其增加或截短的序列，特别是与SEQ ID NO：2的全长序列95％以上相同的序列。

本发明实施例还提供了用于编码所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的基因。

在一些实施方式中，所述基因包括：

第一基因，其具有SEQ ID NO：1所示序列或其增加或截短的序列，特别是与SEQ IDNO：1的全长序列95％以上相同的序列；

和/或，第二基因，其具有SEQ ID NO：5所示序列或其增加或截短的序列，特别是与SEQ ID NO：5的全长序列95％以上相同的序列。

本发明实施例还提供了一种异二聚体蛋白，其由第一蛋白和第二蛋白组成；所述第一蛋白具有SEQ ID NO：2所示序列或其增加或截短的序列；所述第二蛋白具有SEQ IDNO：6所示序列或其增加或截短的序列。

如前所述，gB蛋白是FHV-1中的一种非常重要的中和抗原，其可影响FHV-1感染侵入途径。gD蛋白在FHV-1病毒复制和刺激机体产生中和抗体的过程中起重要作用。本发明实施例通过选取了gB蛋白C端区域而非全长蛋白，并在选取的gB蛋白片段和gD蛋白上均添加Fc片段的方式对gB蛋白片段和gD蛋白进行改造，能够延长蛋白的半衰期，提高分子的稳定性，形成稳定的二聚体，增加蛋白的免疫原性。

优选的，本发明实施例还将改造后gB蛋白片段的氨基酸序列233位D突变成C，以及将改造后gD蛋白的氨基酸序列250位D突变成C，还可以克服位阻效应的影响，使之可以形成异二聚体，从而进一步提升了蛋白结构的稳定性，大幅增强了其免疫原性，这是非常令人惊喜的。

本发明实施例还提供了包含所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的编码基因的重组载体。

在一些实施方式中，所述重组载体包括但不限于pSV2-GS、pCI-GS或pcDNA4-GS等，并优选采用pCI-GS。

本发明实施例还提供了包含所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的编码基因的宿主细胞。

在一些实施方式中，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞，包括但不限于DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株等，优选为CHO-S细胞。

本发明实施例还提供了一种免疫组合物，其特征在于包括：所述的重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白或所述的异二聚体蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。

在一些实施方式中，所述医药学上可接受的载剂包括但不限于MONTANIDE ISA206、MONTANIDE ISA 201、MONTANIDE GEL 01 ST、氢氧化铝胶佐剂、明矾、弗氏佐剂、脂多糖、胆固醇、植物油、细胞因子之中的任意一种或者两种以上的组合之中的一种或者两种以上的组合，并优选使用氢氧化铝胶佐剂。

本发明实施例还提供了所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的一种制备方法，其包括：在合适条件下培养所述的宿主细胞，之后从培养液和/或所述宿主细胞中分离获得所述的重组蛋白。

在一些实施方式中，所述的制备方法具体包括：

将所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的编码基因克隆到真核表达载体中，之后转化哺乳动物细胞(如CHO细胞)，再筛选出能悬浮稳定高效共表达所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的细胞株并进行发酵培养，然后分离、纯化获得所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白。

其中，用于分离、纯化所述重组蛋白的方法包括但不限于层析、透析或本领域已知的其它方法。

在一些实施方式中，所述真核表达载体包括但不限于pSV2-GS、pCI-GS、pcDNA4-GS，等，优选采用pCI-GS。

在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞可以选自CHO细胞系，例如DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株等且不限于此，优选为CHO-S。

本发明实施例还提供了一种猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗的制备方法，其包括：采用前述的任一种方法制备重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白，并将所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白与医药学上可接受的载剂混合。

本发明实施例将设计好的优化后gB蛋白编码基因和优化后gD蛋白编码基因克隆到同一个真核表达载体上，并采用哺乳动物细胞表达系统进行表达，可以提供糖基化修饰，且可将重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白分泌至培养基，进行前述重组蛋白的表达，其不仅表达水平较高，而且所表达的蛋白免疫原性好。

本发明实施例还提供了所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白、所述异二聚体蛋白或所述免疫组合物在制备猫疱疹病毒1型检测试剂，在生产用于在受试动物中诱导针对猫疱疹病毒1型抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受猫疱疹病毒1型感染的药剂中的用途。

本发明实施例还提供了所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白、所述异二聚体蛋白或所述免疫组合物在制备猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗中的用途。

本发明实施例还提供了一种猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备用于编码所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的核酸分子，即优化后的gB蛋白编码基因(前述的第一基因)和优化后的gD蛋白编码基因(前述的第二基因)；

(2)将步骤(1)中优化后gB蛋白编码基因和优化后gD蛋白编码基因克隆到真核表达载体中，得到含有目的基因的重组载体；

(3)将步骤(2)获得的重组载体转化CHO细胞，通过加压筛选、单克隆筛选得到悬浮稳定高效共表达重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的CHO细胞株；

(4)发酵培养步骤(3)筛选出的CHO细胞株，纯化后得到重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白；

(5)将所获重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白与佐剂与佐剂充分混匀，得到所述疫苗。

本发明实施例中通过使用CHO细胞株等表达重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白，产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对动物(例如猫科动物)没有致病性，并且疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本。

本发明实施例提供了一种猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗，其包含前述的任一种免疫组合物。进一步的，所述疫苗还可包含医药学上可接受的载剂。

本发明实施例提供的猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗无任何毒性，安全性高，免疫原性好，能够在动物体内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，且还具有可以大规模批量生产、质控容易、批次间稳定、生产成本低等一系列优点。

本发明实施例提供的猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗在应用时，只需将有效量接种于动物。如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。

本发明实施例还提供了包含所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于检测动物受猫疱疹病毒1型感染的试剂的用途。

本发明实施例还提供了包含所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于在受试动物中诱导针对猫疱疹病毒1型抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明实施例还提供了包含所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于预防动物受猫疱疹病毒1型感染的药剂的用途。

本发明实施例还提供了一种诱导针对猫疱疹病毒1型抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用所述猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗。

本发明实施例还提供了一种保护受试动物免受猫疱疹病毒1型感染的方法，所述方法包括向受试动物施用所述猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗。

本发明实施例还提供了一种适用于在受试动物中产生针对猫疱疹病毒1型感染的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本发明的重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白以及佐剂。如本说明书所述的“佐剂”意指被添加到本说明书所述的疫苗中来增强由所述基因所编码的抗原的免疫原性的任何分子。优选的，所述佐剂可以采用苏州世诺生物技术有限公司生产的相关佐剂，以提高疫苗效果。

本发明实施例还提供了一种试剂盒，其包括所述的重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白、所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的编码基因、所述的重组载体、所述的宿主细胞或所述的免疫组合物。进一步的，所述试剂盒还可以包括用于包装或向动物施用所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白、所述重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白的基因、所述重组载体、所述宿主细胞或所述免疫组合物的容器或器械，如注射器等。

较之现有技术，本发明实施例提供的技术方案至少有如下优点：

(1)通过选取FHV-1的gB蛋白的C端区域和gD蛋白，并通过添加Fc片段方式对其进行改造，以及进一步将改造后gB蛋白片段和改造后gD蛋白的选定位点进行突变，可以使之形成稳定二聚体，特别是异二聚体，从而大幅延长了蛋白半衰期，显著了提高蛋白分子的稳定性和免疫原性。

(2)通过采用哺乳动物细胞表达系统，可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白产品，且所获产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，只需要很少量就能提供很好的免疫效果，对动物没有致病性，适于作为猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗广泛应用，且疫苗生产成本得以大幅降低。

附图说明

图1是实施例1中密码子优化的FHV-1 gB基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带。

图2是实施例1中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带。

图3是实施例2中密码子优化的FHV-1 gD基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带。

图4是实施例2中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带。

图5是实施例2中真核表达载体pCI-gB-gD-GS的示意图。

图6是实施例3所获gB-gD组和各对照组细胞培养物上清的SDS-PAGE检测图谱。

图7是实施例5所获gB-gD组和阴性对照组细胞培养物的SDS-PAGE电泳后产物的化学发光成像图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。又及，下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。

实施例1重组真核表达载体pCI-gB-GS的构建

1.FHV-1 gB基因扩增与纯化

在上海桑尼生物科技有限公司合成了密码子优化后的FHV-1 gB基因(SEQ ID NO：1)并克隆到pUC-57载体上，得到pUC-gB质粒载体。以pUC-gB作为模板，gB-F、gB-R作为引物进行PCR扩增(gB-F、gB-R的基因序列如SEQ ID NO：3、4所示)，扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

表1 FHV-1 gB基因扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图1所示，在1.6kbp附近的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2.酶切

将pCI-GS质粒和纯化后的FHV-1gB基因PCR产物分别使用Xho I、EcoR I37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表2 FHV-1 gB基因酶切反应体系

表3 pCI-GS质粒酶切反应体系

3.连接

将酶切过的pCI-GS质粒和FHV-1gB基因酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。

表4 FHV-1 gB基因与pCI-GS质粒连接体系

4.转化

取10μl步骤(3)所获连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5.菌落PCR和测序鉴定

挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，gB-F和gB-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现1.6kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存，得到真核表达载体pCI-gB-GS。

实施例2重组真核表达载体pCI-gB-gD-GS的构建

1.FHV-1 gD基因表达框扩增与纯化

在上海桑尼生物科技有限公司合成了FHV-1 gD基因表达框并克隆到pUC-57载体上，得到pUC-gD质粒载体。该表达框包括CMV启动子，密码子优化后的gD基因(SEQ ID NO：5)以及SV40 polyA转录终止信号。以pUC-gD作为模板，gD-F、gD-R作为引物进行PCR扩增(gD-F、gD-R的基因序列如SEQ ID NO：7、8所示)，扩增体系见表5。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

表5 FHV-1 gD基因表达框扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图3所示，在1.6kbp附近的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2.酶切

将pCI-gB-GS质粒和纯化后的FHV-1 gD基因表达框PCR产物分别使用Xho I、EcoRI37℃酶切3小时，反应体系见表6、表7。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表6 FHV-1 gD基因表达框酶切反应体系

表7 pCI-gB-GS质粒酶切反应体系

3.连接

将酶切过的pCI-gB-GS质粒和FHV-1 gD基因表达框酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表8。

表8 FHV-1 gD基因表达框与pCI-gB-GS质粒连接体系

4.转化

5.菌落PCR和测序鉴定

挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，gD-F和gD-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图4所示，出现1.6kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。得到真核表达载体pCI-gB-gD-GS。构建好的载体图谱如图5所示。

实施例3重组CHO细胞的构建与筛选

1.细胞转染

1.1准备细胞

取对数生长期的CHO细胞，取样计数，以1×10⁶cells/ml的细胞密度继续传代，维持种子，剩余细胞离心，1000rpm离心4分钟后，弃上清，用20ml左右的新鲜CHO-WM培养基重悬，再次离心，1000rpm离心4分钟，弃上清后用少量培养基重悬计数，最终将细胞密度调整为1.43×10⁷cells/ml。

1.2质粒与细胞混合

取实施例2中pCI-gB-gD-GS质粒载体5μg，加入至EP管中，添加0.7ml步骤1.1所获CHO细胞悬液，混合均匀后，静置15分钟。

1.3电转

280V 20ms电击2个脉冲，电击完成后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培养，48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6×10⁶cells/ml时，添加50μM MSX(L-methionine sulphoximine)加压筛选。

2.单克隆筛选

2.1用苏州沃关生物技术有限公司的CHO细胞无血清无蛋白培养基CHO-WM细胞培养基+50μM MSX重新悬浮细胞，计数。

2.2铺板

稀释细胞至5个/mL，取200μl混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育4-6h。记录单个细胞的孔。

2.3待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，100μl 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL CHO-WM培养基(含10％FBS+50μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，Elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养，冻存。

3.细胞摇瓶发酵

3.1传代培养基的配置：使用CHO-WM培养基添加50μM MSX作为传代培养基，置于37℃水浴锅预热至37℃。

3.2从CO₂恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

3.3稀释细胞至2.5-3.5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

3.4每隔24h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

该实施例所收获的细胞培养物上清被定义为gB-gD组。

另外按照前述实施例的方法构建表达如表9所示各对照组蛋白的细胞株。

表9对照组设置分组

注：对照3组是将未进行突变的gB和gD基因克隆到同一个载体上进行表达。

实施例4SDS-PAGE检测

将实施例3中收获的gB-gD组和各对照组细胞培养物上清进行非还原性SDS-PAGE检测，同时设置gB-gD组的细胞培养物上清进行还原性SDS-PAGE检测，使用空的CHO细胞作为阴性对照(还原性与非还原性的区别在于样品处理时是否添加还原剂β-巯基乙醇)。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×上样缓冲液，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。

检测结果如图6所示，在非还原性SDS-PAGE检测中，gB-gD组在分子量约123kDa附近出现目的条带，对照1组在分子量约61kDa附近出现目的条带，对照2组在分子量约62kDa附近出现目的条带，对照3组在分子量约62kDa和61kDa附近出现目的条带；在还原性SDS-PAGE检测中，gB-gD组在分子量约62kDa和61kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

实施例5Western Blot检测

将实施例4中电泳后的产物分别转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂奶粉封闭2小时，以猫源抗FHV-1阳性血清作为一抗孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗猫IgG二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。结果如图7所示，图中重组CHO细胞上清样品有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。

实施例6蛋白含量与琼扩检测

将实施例3中收获的CHO细胞培养上清液使用BCA总蛋白定量法进行蛋白含量测定，再结合灰度扫描确定目的蛋白纯度。gB-gD蛋白浓度为1.5g/L，纯度为98.5％。

使用琼扩方法检测表达的gB-gD蛋白效价，在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入FHV-1琼扩检测标准血清，周围分别加入稀释了2的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次方的表达抗原。倒置孵育72h后观察沉淀线。出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价。琼扩效价检测结果如下：gB-gD蛋白琼扩效价为1∶256。

实施例7疫苗制备

将实施例3中所制备的细胞株按表10分组制备成疫苗，具体操作如下：将适量CHO细胞表达的蛋白稀释后加入到氢氧化铝胶佐剂中，使得最终蛋白浓度为100μg/ml，乳化，质检合格后置于4℃保存。

表10疫苗制备分组

实施例8免疫实验

1.抗体测定

选取20只2-3月龄健康易感幼猫(猫血清抗FHV-1抗体效价均小于1∶2)，分为4组，5只/组，前三组每只猫按表10分别颈部肌肉注射各组疫苗1ml，阴性对照组以同种方式注射生理盐水1ml。所有猫只分别于免疫前以及免疫后7日、14日、28日颈静脉采血，分离血清，测定中和抗体效价。具体结果见表11。

表11各组动物平均中和抗体效价

2.攻毒试验

取上述各组免疫28日后的幼猫，各滴鼻接种1ml病毒滴度为10^8.5TCID₅₀/ml的标准毒株FHV-1 C-27株。每组动物隔离饲养，自由采食、饮水，连续观察14日，监测猫的临床症状、体温变化(腋下体温)与死亡情况等，并采集口、鼻、眼拭子进行FHV-1检测。根据猫出现的临床症状按照表12进行打分，并统计各组猫的存活率，具体结果见表13。

表12 FHV-1的评分方法

表13攻毒试验结果

注：“+”表示病毒检测阳性，“-”表示病毒检测阴性。

应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 苏州米迪生物技术有限公司

<120> 重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1629

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

atggtgaaca acgcgagcct gctgaaaacc accagcagcg tggaatttgc gatgctgcag 60

tttgcgtatg attatattca ggcgcatgtg aacgaaatgc tgagccgcat tgcgaccgcg 120

tggtgcaccc tgcagaaccg cgaacatgtg ctgtggaccg aaaccctgaa actgaacccg 180

ggcggcgtgg tgagcatggc gctggaacgc cgcgtgagcg cgcgcctgct gggcgatgcg 240

gtggcggtga cccagtgcgt gaacattagc agcggccatg tgtatattca gaacagcatg 300

cgcgtgaccg gcagcagcac cacctgctat agccgcccgc tggtgagctt tcgcgcgctg 360

aacgatagcg aatatattga aggccagctg ggcgaaaaca acgaactgct ggtggaacgc 420

aaactgattg aaccgtgcac cgtgaacaac aaacgctatt ttaaatttgg cgcggattat 480

gtgtattttg aagattatgc gtatgtgcgc aaagtgccgc tgagcgaaat tgaactgatt 540

agcgcgtatg tggatctgaa cctgaccctg ctggaagatc gcgaatttct gccgctggaa 600

gtgtataccc gcgcggaact ggaagatacc ggcctgctgg attatagcga aattcagcgc 660

cgcaaccagc tgcatgcgct gaaattttat gatatttgca gcattgtgcg cgtggataac 720

aacctggtga ttatgcgcgg catggcgaac ttttttcagg gcctgggcga tgtgggcgcg 780

ggctttggca aagtggtgct gggcgcggcg agcgcggtga ttagcaccgt gagcggcgtg 840

agcagctttc tgaacaaccc gtttacctgc aacgtggcgc atcgcccgag cagcaccaaa 900

gtggataaaa ccgtgccgaa aaccgcgagc accattgaaa gcaaaaccgg cgaaggcccg 960

aaatgcccgg tgccggaaat tccgggcgcg ccgagcgtgt ttatttttcc gccgaaaccg 1020

aaagataccc tgagcattag ccgcaccccg gaagtgacct gcctggtggt ggatctgggc 1080

ccggatgata gcaacgtgca gattacctgg tttgtggata acaccgaaat gcataccgcg 1140

aaaacccgcc cgcgcgaaga acagtttaac agcacctatc gcgtggtgag cgtgctgccg 1200

attctgcatc aggattggct gaaaggcaaa gaatttaaat gcaaagtgaa cagcaaaagc 1260

ctgccgagcg cgatggaacg caccattagc aaagcgaaag gccagccgca tgaaccgcag 1320

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ctgattaaag gctttcatcc gccggatatt gcggtggaat gggaaattac cggccagccg 1440

gaaccggaaa acaactatca gaccaccccg ccgcagctgg atagcgatgg cacctatttt 1500

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ggcaaataa 1629

<210> 2

<211> 542

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

Met Val Asn Asn Ala Ser Leu Leu Lys Thr Thr Ser Ser Val Glu Phe

1 5 10 15

Ala Met Leu Gln Phe Ala Tyr Asp Tyr Ile Gln Ala His Val Asn Glu

20 25 30

Met Leu Ser Arg Ile Ala Thr Ala Trp Cys Thr Leu Gln Asn Arg Glu

35 40 45

His Val Leu Trp Thr Glu Thr Leu Lys Leu Asn Pro Gly Gly Val Val

50 55 60

Ser Met Ala Leu Glu Arg Arg Val Ser Ala Arg Leu Leu Gly Asp Ala

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Val Ala Val Thr Gln Cys Val Asn Ile Ser Ser Gly His Val Tyr Ile

85 90 95

Gln Asn Ser Met Arg Val Thr Gly Ser Ser Thr Thr Cys Tyr Ser Arg

100 105 110

Pro Leu Val Ser Phe Arg Ala Leu Asn Asp Ser Glu Tyr Ile Glu Gly

115 120 125

Gln Leu Gly Glu Asn Asn Glu Leu Leu Val Glu Arg Lys Leu Ile Glu

130 135 140

Pro Cys Thr Val Asn Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Phe Gly Ala Asp Tyr

145 150 155 160

Val Tyr Phe Glu Asp Tyr Ala Tyr Val Arg Lys Val Pro Leu Ser Glu

165 170 175

Ile Glu Leu Ile Ser Ala Tyr Val Asp Leu Asn Leu Thr Leu Leu Glu

180 185 190

Asp Arg Glu Phe Leu Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg Ala Glu Leu Glu

195 200 205

Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln Arg Arg Asn Gln Leu

210 215 220

His Ala Leu Lys Phe Tyr Asp Ile Cys Ser Ile Val Arg Val Asp Asn

225 230 235 240

Asn Leu Val Ile Met Arg Gly Met Ala Asn Phe Phe Gln Gly Leu Gly

245 250 255

Asp Val Gly Ala Gly Phe Gly Lys Val Val Leu Gly Ala Ala Ser Ala

260 265 270

Val Ile Ser Thr Val Ser Gly Val Ser Ser Phe Leu Asn Asn Pro Phe

275 280 285

Thr Cys Asn Val Ala His Arg Pro Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Thr

290 295 300

Val Pro Lys Thr Ala Ser Thr Ile Glu Ser Lys Thr Gly Glu Gly Pro

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Lys Cys Pro Val Pro Glu Ile Pro Gly Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

340 345 350

Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asn Val Gln Ile

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Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Glu Met His Thr Ala Lys Thr Arg Pro

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Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val

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Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Ala Met Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala

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Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Thr Gln

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Glu Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys Gly

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465 470 475 480

Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Gln Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp

485 490 495

Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser His Trp

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Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu His

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<210> 3

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<400> 3

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<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

atagaattct tatttgcccg ggctctgggt caggct 36

<210> 5

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

atgaaaggct ttaacattcc gccgctgcgc tataactata cccaggcgcg cattgtgccg 60

aaaattccgc aggcgatgga tccgaaaatt accgcggaag tgcgctatgt gaccagcatg 120

gatagctgcg gcatggtggc gctgattagc gaaccggata ttgatgcgac cattcgcacc 180

attcagctga gccagaaaaa aacctataac gcgaccatta gctggtttaa agtgacccag 240

ggctgcgaat atccgatgtt tctgatggat atgcgcctgt gcgatccgaa acgcgaattt 300

ggcatttgcg cgctgcgcag cccgagctat tggctggaac cgctgaccaa atatatgttt 360

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attgatattg aaaactatac cccgaaaaac aacgtgccga ttattattag cgatgatgat 840

gtgccgaccg cgccgccgaa aggcatgaac aaccagagct ttacctgcaa cgtggcgcat 900

cgcccgagca gcaccaaagt ggataaaacc gtgccgaaaa ccgcgagcac cattgaaagc 960

aaaaccggcg aaggcccgaa atgcccggtg ccggaaattc cgggcgcgcc gagcgtgttt 1020

atttttccgc cgaaaccgaa agataccctg agcattagcc gcaccccgga agtgacctgc 1080

ctggtggtgg atctgggccc ggatgatagc aacgtgcaga ttacctggtt tgtggataac 1140

accgaaatgc ataccgcgaa aacccgcccg cgcgaagaac agtttaacag cacctatcgc 1200

gtggtgagcg tgctgccgat tctgcatcag gattggctga aaggcaaaga atttaaatgc 1260

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<210> 6

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<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

Met Lys Gly Phe Asn Ile Pro Pro Leu Arg Tyr Asn Tyr Thr Gln Ala

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Arg Ile Val Pro Lys Ile Pro Gln Ala Met Asp Pro Lys Ile Thr Ala

20 25 30

Glu Val Arg Tyr Val Thr Ser Met Asp Ser Cys Gly Met Val Ala Leu

35 40 45

Ile Ser Glu Pro Asp Ile Asp Ala Thr Ile Arg Thr Ile Gln Leu Ser

50 55 60

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65 70 75 80

Gly Cys Glu Tyr Pro Met Phe Leu Met Asp Met Arg Leu Cys Asp Pro

85 90 95

Lys Arg Glu Phe Gly Ile Cys Ala Leu Arg Ser Pro Ser Tyr Trp Leu

100 105 110

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Ile Met Met Ala Pro Ala Gln Phe Asn Gln Gly Gln Tyr Arg Arg Val

130 135 140

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Ser Pro Thr Pro Cys Trp Phe Ala Lys Pro Asp Arg Tyr Glu Glu Ile

165 170 175

Leu His Glu Trp Cys Arg Asn Val Lys Thr Ile Gly Leu Asp Gly Ala

180 185 190

Arg Asp Tyr His Tyr Tyr Trp Val Pro Tyr Asn Pro Gln Pro His His

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Val Arg Phe Gln Glu Ala Ile Arg Tyr Asp Arg Pro Ala Ile Pro Ser

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Gly Ser Glu Asp Ser Lys Arg Ser Asn Cys Ser Arg Gly Glu Ser Ser

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Gly Pro Asn Trp Ile Asp Ile Glu Asn Tyr Thr Pro Lys Asn Asn Val

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Pro Ile Ile Ile Ser Asp Asp Asp Val Pro Thr Ala Pro Pro Lys Gly

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<211> 36

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<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

atagaattct tatttgcccg ggctctgggt caggct 36

<210> 9

<211> 1629

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 9