阅读说明：本技术 牛疱疹病毒抗原组合物及其应用 (Bovine herpes virus antigen compositions and uses thereof ) 是由 曹文龙 孔迪 滕小锘 张大鹤 于 2020-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种牛疱疹病毒抗原组合物及其应用,包括以下蛋白中的至少两种：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的牛疱疹病毒重组gB蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的牛疱疹病毒重组gD蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的牛疱疹病毒重组gH蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的牛疱疹病毒重组gL蛋白。本发明综合分析了牛疱疹病毒的gB蛋白、gD蛋白、gH蛋白和gL蛋白的序列信息和空间结构,并对四种蛋白分别进行了定点突变,提高了蛋白各自的免疫原性,能够更好地激发中和抗体,免疫效果更好,免疫期限更长。(The invention relates to a bovine herpes virus antigen composition and application thereof, wherein the bovine herpes virus antigen composition comprises at least two of the following proteins: a recombinant bovine herpes virus gB protein with an amino acid sequence shown as SEQ ID NO. 1, a recombinant bovine herpes virus gD protein with an amino acid sequence shown as SEQ ID NO. 2, a recombinant bovine herpes virus gH protein with an amino acid sequence shown as SEQ ID NO. 3 and a recombinant bovine herpes virus gL protein with an amino acid sequence shown as SEQ ID NO. 4. The sequence information and the spatial structure of the gB protein, the gD protein, the gH protein and the gL protein of the bovine herpes virus are comprehensively analyzed, and the four proteins are subjected to site-directed mutagenesis respectively, so that the respective immunogenicity of the proteins is improved, a neutralizing antibody can be better excited, the immune effect is better, and the immune period is longer.)

牛疱疹病毒抗原组合物及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种牛疱疹病毒抗原组合物及其应用。

背景技术

牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，IBRV）感染所引起的高度接触性传染病。该病引起的临床症状主要有呼吸困难、鼻炎、发热、食欲不振、结膜炎、***炎、流产、******炎、外阴***炎及全身系统性感染等。IBRV可在脊神经节内和三叉神经节内发生潜伏感染，感染牛可存在隐性感染，因不表现任何临床特征而被忽视，但是隐性感染的牛会不停地向外界排毒，造成其他易感牛群的感染。一般康复的病牛亦是如此，病毒在体内潜伏，当外界环境变化时会刺激机体的病毒进一步活化，所以一旦该病发生将很难从牛群中消除，其流行和危害有增无减，给养牛业造成巨大的经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将该病定义为B类疫病，我国农业部在动物疫病名录中将其列为二类动物疫病。

IBRV又称牛疱疹病毒I型（Bovine Herpesvirus 1，BHV-1），属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科。IBRV是有囊膜的线性双链DNA病毒，约135~140kb，病毒直径为120~220nm，粒子似球形，衣壳为正二十面体对称。IBRV基因组由一个长独特区（UL，106kb）和一个短独特区（Us，10kb）及Us区两侧的重复序列IRs和TRs组成。IBRV编码的结构蛋白有33种，其中13种蛋白与核衣壳有关，10种进行编码糖蛋白。在这10种糖蛋白中，6种是在长的独特序列区，分别被命名为gK（UL53）、gC（UL44）、gB（UL27）、gH（UL22）、gM（ULl0）及gL（ULl），剩下的四种位于短的独特序列区，被命名为gG（US4）、gD（US6）、gI（US7）和gE（US8）。目前已知疱疹病毒侵入细胞至少需要4种糖蛋白的参与，即gB、gD、gH和gL蛋白。gB蛋白与病毒吸附和渗透宿主细胞有关，可同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，是诱导机体产生免疫应答的主要抗原蛋白之一。gD蛋白位于病毒囊膜及感染细胞的表面，是病毒复制所必需的，与病毒穿透、进入宿主细胞有关，可同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。gH蛋白与gL蛋白形成的异质二聚体gH-gL，在疱疹病毒侵入宿主细胞、病毒与细胞或细胞与细胞之间的融合以及病毒在细胞间传播的过程中都是必不可少的。

目前，全球对于IBR的控制主要采取扑杀和疫苗接种两种方式，但扑杀耗资巨大，而一般的疫苗也存在免疫效果较差、免疫期限较短等问题。

发明内容

基于此，有必要提供一种免疫效果较好、免疫期限较长的牛疱疹病毒抗原组合物。

一种牛疱疹病毒抗原组合物，包括以下蛋白中的至少两种：氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的牛疱疹病毒重组gB蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的牛疱疹病毒重组gD蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的牛疱疹病毒重组gH蛋白和氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示的牛疱疹病毒重组gL蛋白。

在其中一个实施例中，包括所述牛疱疹病毒重组gB蛋白、所述牛疱疹病毒重组gD蛋白、所述牛疱疹病毒重组gH蛋白和所述牛疱疹病毒重组gL蛋白。

在其中一个实施例中，所述牛疱疹病毒重组gB蛋白和所述牛疱疹病毒重组gD蛋白形成异二聚体，所述牛疱疹病毒重组gH蛋白和所述牛疱疹病毒重组gL蛋白形成异二聚体。

本发明还提供了一种表达基因组合物，包括gB基因、gD基因、gH基因和gL基因中的至少两种；所述gB基因、gD基因、gH基因和gL基因分别编码所述牛疱疹病毒重组gB蛋白、所述牛疱疹病毒重组gD蛋白、所述牛疱疹病毒重组gH蛋白和所述牛疱疹病毒重组gL蛋白。

在其中一个实施例中，所述gB基因、gD基因、gH基因和gL基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

本发明还提供了一种表达载体系统，包含一种或多种载体，所述载体用于表达上述牛疱疹病毒抗原组合物。

在其中一个实施例中，所述载体含有所述gB基因和所述gD基因，且所述gB基因和所述gD基因通过IRES序列连接；或所述载体含有所述gH基因和所述gL基因，且所述gH基因和所述gL基因通过IRES序列连接。

本发明还提供了一种宿主细胞系统，包括一种或多种细胞，所述细胞用于表达上述牛疱疹病毒抗原组合物。

本发明还提供了所述牛疱疹病毒抗原组合物、所述表达基因组合物、所述表达载体系统或所述宿主细胞系统在制备用于防治牛传染性鼻气管炎的产品中的应用。

本发明还提供了一种牛传染性鼻气管炎疫苗，包括上述牛疱疹病毒抗原组合物，以及药学上可接受的佐剂。

在其中一个实施例中，所述佐剂为MONTANIDE ISA 206 VG、MONTANIDE ISA 201VG、液体石蜡、樟脑油和植物细胞凝集素中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述佐剂为MONTANIDE ISA 201 VG。

本发明综合分析了牛疱疹病毒的gB蛋白、gD蛋白、gH蛋白和gL蛋白的序列信息和空间结构，并对四种蛋白分别进行了定点突变。突变后不仅提高了蛋白各自的免疫原性，而且使突变后的gB蛋白和gD蛋白之间以及突变后的gH蛋白和gL蛋白之间都可以形成稳定的异二聚体蛋白，与天然的野生病毒侵染细胞时gB蛋白和gD蛋白、gH蛋白和gL蛋白形成的二聚体类似，接近蛋白天然的结构状态。如此，能够更好地激发中和抗体，相比于将蛋白分别使用或者将蛋白直接混合使用的免疫效果更好，免疫期限更长。本发明的牛疱疹病毒抗原组合物的抗原性、免疫原性和功能与病毒天然蛋白质相似，且表达水平较高，经实验证明免疫原性较强，免疫期限较长，对牛群没有致病性，安全性高，能够在牛体内产生较强的体液免疫，免疫后的牛能够抵御强毒攻毒。并且本发明的牛疱疹病毒抗原组合物可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本。

附图说明

图1为实施例1中gB-gD基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在2.9kbp位置出现目的条带；

图2为实施例1中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在2.9kbp位置出现目的条带；

图3为实施例1中含有目的基因的转移载体pCI-gB-gD-GS的结构示意图；

图4为实施例2中gH-gL基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在2.7kbp位置出现目的条带；

图5为实施例2中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在2.7kbp位置出现目的条带；

图6为实施例2中含有目的基因的转移载体pCI-gH-gL-GS的结构示意图；

图7为实施例4中所获细胞培养物的非还原性SDS-PAGE检测图谱；

图8为实施例4中所获细胞培养物的还原性SDS-PAGE检测图谱；

图9为实施例5中非还原性SDS-PAGE电泳后产物的Western Blot检测图谱；

图10为实施例5中还原性SDS-PAGE电泳后产物的Western Blot检测图谱。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语解释

“抗原”是指所有能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体（TCR/BCR）特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物（致敏淋巴细胞或抗体），并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。因此，抗原有两个基本特性，就是抗原性和免疫原性。抗原性指抗原与其所诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能力。免疫原性是指能引起免疫应答的性能，即抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。

“载体（vector）”是指可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）或P1来源的人工染色体（PAC）；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。

“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

本发明一实施例的牛疱疹病毒抗原组合物，包括以下蛋白中的至少两种：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的牛疱疹病毒重组gB蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的牛疱疹病毒重组gD蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的牛疱疹病毒重组gH蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的牛疱疹病毒重组gL蛋白。

本发明综合分析了牛疱疹病毒的gB蛋白、gD蛋白、gH蛋白和gL蛋白的序列信息和空间结构，并对四种蛋白分别进行了定点突变。突变后不仅提高了蛋白各自的免疫原性，而且使突变后的gB蛋白和gD蛋白之间以及突变后的gH蛋白和gL蛋白之间都可以形成稳定的异二聚体蛋白，与天然的野生病毒侵染细胞时gB蛋白和gD蛋白、gH蛋白和gL蛋白形成的二聚体类似，接近蛋白天然的结构状态。如此，能够更好地激发中和抗体，相比于将蛋白分别使用或者将蛋白直接混合使用的免疫效果更好，免疫期限更长。本发明的牛疱疹病毒抗原组合物的抗原性、免疫原性和功能与病毒天然蛋白质相似，且表达水平较高，经实验证明免疫原性较强，免疫期限较长，对牛群没有致病性，安全性高，能够在牛体内产生较强的体液免疫，免疫后的牛能够抵御强毒攻毒。并且本发明的牛疱疹病毒抗原组合物可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本。

在一个具体示例中，牛疱疹病毒抗原组合物包括牛疱疹病毒重组gB蛋白和牛疱疹病毒重组gD蛋白。在一个具体示例中，牛疱疹病毒抗原组合物包括牛疱疹病毒重组gH蛋白和牛疱疹病毒重组gL蛋白。

在一个具体示例中，牛疱疹病毒抗原组合物包括牛疱疹病毒重组gB蛋白、牛疱疹病毒重组gD蛋白、牛疱疹病毒重组gH蛋白和牛疱疹病毒重组gL蛋白。将四种蛋白联合使用，能够获得更好的免疫效果。

在一个具体示例中，牛疱疹病毒抗原组合物中的牛疱疹病毒重组gB蛋白和牛疱疹病毒重组gD蛋白形成异二聚体，牛疱疹病毒重组gH蛋白和牛疱疹病毒重组gL蛋白形成异二聚体。如此，形成的异二聚体蛋白与天然的野生病毒侵染细胞时形成的二聚体类似，接近蛋白天然的结构状态，能够更好地激发中和抗体。

本发明一实施例的表达基因组合物，包括gB基因、gD基因、gH基因和gL基因中的至少两种。gB基因、gD基因、gH基因和gL基因分别编码上述牛疱疹病毒重组gB蛋白、牛疱疹病毒重组gD蛋白、牛疱疹病毒重组gH蛋白和牛疱疹病毒重组gL蛋白。

在一个具体示例中，gB基因、gD基因、gH基因和gL基因的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。可以理解，由于密码子的简并性，能够表达同一蛋白的核酸序列具有多种形式，以上为经过密码子优化的核酸序列，但不限于此。

本发明一实施例的表达载体系统，包含一种或多种载体，载体用于表达上述牛疱疹病毒抗原组合物。可以理解，一个载体上可以含有gB基因、gD基因、gH基因和gL基因中的一种或多种，四种蛋白可根据需要分别表达或共同表达。

在一个具体示例中，载体含有gB基因和gD基因，且gB基因和gD基因通过IRES序列连接；或者，载体含有gH基因和gL基因，且gH基因和gL基因通过IRES序列连接。如此，可以用一个表达框共表达重组gB蛋白和重组gD蛋白，或者重组gH蛋白和重组gL蛋白，表达后直接形成异二聚体蛋白。

可以理解，载体中还可包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子等其他表达控制元件（例如转录终止信号、或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等）。在一个具体示例中，初始载体可以选择pSV2-GS、pCI-GS、pcDNA4-GS等，优选为pCI-GS。

本发明一实施例的宿主细胞系统，包括一种或多种细胞，该细胞用于表达上述牛疱疹病毒抗原组合物。可以理解，一个细胞中可以含有上述基因或上述载体中的一种或多种。

在一个具体示例中，宿主细胞为CHO细胞。具体地，CHO细胞系可以是为DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株等，优选为CHO-S。使用CHO细胞表达改造后的牛疱疹病毒重组蛋白，真核表达蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，降低了生产成本。

本发明一实施例的牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：在适宜的条件下培养上述宿主细胞，收集培养液和/或宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化得到牛疱疹病毒重组蛋白。

在一个具体示例中，分离纯化的方法包括镍柱亲和层析、分子筛层析等，不限于此，可根据需要选择。

本发明一实施例的牛传染性鼻气管炎疫苗，其包括上述牛疱疹病毒抗原组合物，以及药学上可接受的佐剂。

在一个具体示例中，佐剂可以是MONTANIDE ISA 206 VG、MONTANIDE ISA 201 VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素等一种或者两种以上的组合，优选使用MONTANIDE ISA201 VG。

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1 重组真核表达载体pCI-gB-gD-GS的构建

1.gB-gD基因表达框扩增与纯化

在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的gB-gD基因表达框（SEQ IDNO:9）并克隆到pUC-57载体上，得到pUC-gB-gD质粒载体。以pUC-gB-gD作为模板，以gB-gD-F、gB-gD-R作为引物进行PCR扩增，扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

gB-gD-F：5’-ATAGGTACCgccgccaccatggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctg-3’

gB-gD-R：5’-ATACTCGAGttaatgatgatgatgatgatggccttccgggccGCAcgggccgccgttg-3’

表1 gB-gD基因表达框扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图1所示，在2.9kbp附近的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2.酶切

将pCI-GS质粒和纯化后的gB-gD基因表达框PCR产物分别使用Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ 37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表2 gB-gD基因表达框酶切反应体系

表3 pCI-GS质粒酶切反应体系

3.连接

将酶切过的pCI-GS质粒和gB-gD基因表达框酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。

表4 gB-gD基因表达框与pCI-GS质粒连接体系

4.转化

取10μL连接产物加入100μL的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μL不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μL涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5.菌落PCR和测序鉴定

挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，gB-gD-F和gB-gD-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现2.9kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。得到真核表达载体pCI-gB-gD-GS。构建好的载体图谱如图3所示。

实施例2 重组真核表达载体pCI-gH-gL-GS的构建

1.gH-gL基因表达框扩增与纯化

在上海桑尼生物科技有限公司合成了密码子优化后的gH-gL基因表达框（SEQ ID NO:10）并克隆到pUC-57载体上，得到pUC-gH-gL质粒载体。以pUC-gH-gL作为模板，gH-gL-F、gH-gL-R作为引物进行PCR扩增，扩增体系见表5。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

gH-gL-F：5’-ATAGGTACCGCCGCCACCatggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctg-3’

gH-gL-R：5’-ATACTCGAGttaatgatgatgatgatgatggcgataaatgccatcgc-3’

表5 gH-gL基因表达框扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图4所示，在2.7kbp附近的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2.酶切

将pCI-GS质粒和纯化后的gH-gL基因表达框PCR产物分别使用Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ 37℃酶切3小时，反应体系见表6、表7。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表6 gH-gL基因表达框酶切反应体系

表7 pCI-GS质粒酶切反应体系

3.连接

将酶切过的pCI-GS质粒和gH-gL基因表达框酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表8。

表8 gH-gL基因表达框与pCI-GS质粒连接体系

4.转化

取10μL连接产物加入100μL的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μL不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0mL菌液离心浓缩成100μL涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5.菌落PCR和测序鉴定

挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，gH-gL-F和gH-gL-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图5所示，出现2.7kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。得到真核表达载体pCI-gH-gL-GS。构建好的载体图谱如图6所示。

实施例3 重组CHO细胞的构建与筛选

1.细胞转染

1.1准备细胞 取对数生长期的CHO细胞，取样计数，以1×10⁶ cells/mL的细胞密度继续传代，维持种子，剩余细胞离心，1000rpm离心4分钟后，弃上清，用20mL左右的新鲜CHO-WM培养基重悬，再次离心，1000rpm离心4分钟，弃上清后用少量培养基重悬计数，最终将细胞密度调整为1.43×10⁷ cells/mL。

1.2质粒与细胞混合 取实施例1中pCI-gB-gD-GS质粒载体5μg，加入至EP管中，添加0.7mL细胞，混合均匀后，静置15分钟。

1.3电转280V 20ms电击2个脉冲，电击完成后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培养，48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6×10⁶ cells/mL时，添加50μM MSX（L-methionine sulphoximine）加压筛选。

2.单克隆筛选

2.1用苏州沃美生物技术有限公司的CHO细胞无血清无蛋白培养基CHO-WM细胞培养基+50μM MSX重新悬浮细胞，计数。

2.2铺板 稀释细胞至5个/mL，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5% CO₂细胞培养箱中孵育4~6h。记录单个细胞的孔。

2.3待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，100μL 0.25%trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL CHO-WM培养基（含10% FBS+50μM MSX）终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，Elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养，冻存。

3.细胞摇瓶发酵

3.1传代培养基的配置：使用CHO-WM培养基添加50μM MSX作为传代培养基，置于37℃水浴锅预热至37℃。

3.2从CO₂恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

3.3稀释细胞至(2.5~3.5)×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5% CO₂恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

3.4每隔24h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

以同样的操作方法构建并筛选共表达gH-gL蛋白的重组CHO细胞。

另外按照上面的实施例方法构建表达如表9和表10所示蛋白的细胞株。

表9

表10

实施例4 SDS-PAGE检测

将实施例3中收获的gB-gD组、gb-gd组、gH-gL组、gh-gl组的细胞培养物上清进行非还原性SDS-PAGE检测，同时设置将gB-gD组和gH-gL组的细胞培养物上清进行还原性SDS-PAGE检测，并使用空的CHO细胞作为阴性对照（还原性与非还原性的区别在于样品处理时是否添加还原剂β-巯基乙醇）。具体操作如下：取40μL收获的细胞培养物，加入10μL的5×上样缓冲液取1mol/L Tris-HCI(pH6.8) 1.25mL，溴酚蓝25mg，甘油2.5mL，SDS 0.5g溶于ddH₂O中，定容至5mL，0.5mL/管分装，室温保存，还原性检测使用前每管需加入25μL β-巯基乙醇混匀，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶（12%浓度凝胶）电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。

检测结果如图7、8所示，在非还原性SDS-PAGE检测中，gB-gD组和gb-gd组在分子量约105kDa、60kDa和40kDa附近出现目的条带，gH-gL组和gh-gl组在分子量约90kDa、60kDa和22kDa附近出现目的条带，两个蛋白之间形成的二聚体的条带明显，且gB-gD组明显比gb-gd组形成的二聚体更多，gH-gL组明显比gh-gl组形成的二聚体更多，阴性对照在对应位置都没有条带。在还原性SDS-PAGE检测中，gB-gD组只在分子量约60kDa和40kDa附近出现目的条带，gH-gL组只在分子量约60kDa和22kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

实施例5 Western Blot检测

将实施例4中SDS-PAGE电泳后的产物分别转印到NC（硝酸纤维素）膜上，用5%脱脂牛奶封闭2小时，牛源抗IBRV阳性血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗牛多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。结果如图9、10所示，图中重组CHO上清样品有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。

实施例6 蛋白含量与琼扩检测

将实施例3中收获的CHO细胞培养上清液中gB-gD和gH-gL蛋白含量使用Elisa方法检测。操作方式如下：用包被缓冲液稀释牛抗IBRV多抗血清至合适浓度，每孔100µL，4℃过夜，PBST洗涤三次，1%BSA封闭1h。加入不同浓度的抗原标准品（通过离子交换层析、疏水层析、分子筛纯化得到的蛋白）和梯度稀释待检样品，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔分别加入检测gB-gD和gH-gL蛋白单克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入二抗即HRP标记的羊抗牛IgG，37℃孵育1小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2M H₂SO₄终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中gB-gD和gH-gL蛋白的量。

按照实施例3大规模制备的gB-gD和gH-gL蛋白，Elisa检测结果如下，疫苗原液中gB-gD蛋白和gH-gL蛋白的平均含量分别达到2.4g/L和2.3g/L。

使用琼扩方法检测表达的gB-gD和gH-gL蛋白效价，在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入IBRV琼扩检测标准血清，周围分别加入稀释了2的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次方的表达抗原。倒置孵育72h后观察沉淀线，出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价。琼扩效价检测结果如下：gB-gD蛋白和gH-gL蛋白琼扩效价分别为1:512和1:256。

实施例7 疫苗制备

将实施例3中所制备的细胞株按表11分组所示制备成疫苗，具体操作如下：将每组适量CHO细胞表达的蛋白等比例混合加入到MONTANIDE ISA 201 VG佐剂中（体积比为46:54），使得最终乳化好的疫苗中蛋白浓度为100µg/mL，乳化、质检合格后置于4℃保存。

表11

实施例8 疫苗成品检验

试验一：安全检验

替代动物试验 试验选用1.5~2.0kg的健康家兔6只，其中免疫组4只，空白组2只，免疫组家兔各腿部肌肉注射免疫组疫苗1.0mL，空白组家兔各腿部肌肉注射佐剂1.0mL，连续观察7天并每天下午定点测量体温，未出现死亡及不良反应，无临床异常表现，体温正常。选用350~400g健康雌性豚鼠6只，其中免疫组4只，对照组2只，免疫组豚鼠各颈部皮下注射免疫组疫苗0.5mL，空白组豚鼠各颈部皮下注射佐剂0.5mL，连续观察7天，未出现死亡及不良反应，无临床异常表现。

试验二：效力试验

（1）Elisa抗体检测：筛选4~5月龄小牛55头(IBRV抗原抗体阴性)，随机分为11组，每组5头，分别按照表11肌肉注射疫苗2mL，初免三周后加强免疫一次，免疫前、二免前和二免后21天采集血清，检测抗体效价。实验结果如表12所示，使用IDEXX公司牛病毒性腹泻病毒抗体检测试剂盒检测结果显示：改造后的牛疱疹病毒重组蛋白能够获得更好的免疫效果，且二免21天后仍然效果显著。

表12

结果判定：判断抗体阳性的标准：P/N≥2.1，OD450≥0.1

（2）牛体免疫攻毒：试验选用2~3月龄IBRV抗原、抗体双阴性（抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4或ELISA检测抗体阴性）的健康易感牛30头，免疫组、对照组2和空白组各10头，三组牛各按照表11对应组分别颈部肌肉注射2.0mL，21天后同样方式加强免疫，二免后21天进行IBRV强毒攻毒，每头牛上午、下午左右鼻孔各滴鼻攻毒2.5mL IBRV强毒株，攻毒后连续观察14天，每天上午定点测量体温，观察临床症状并采集鼻拭子进行病原检测与病毒分离。免疫组有9头牛保护，对照组2有5头牛保护，空白组9头牛发病。

表13 IBRV效力检测（牛体免疫攻毒）结果

注：符合体温升高、流鼻液、鼻拭子带毒中的两项即判为发病。

相关序列信息如下：

重组gB蛋白（SEQ ID NO:1）：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGHTTGPIPSPFADGREQPVEVRYATSAAACDMLALIADPQVGRTLWEAVRRHARAYNATVIWYKIESGCARPLYYMEYTECEPRKHFGYCRYRTPPFWDSFLAGFAYPTDDELGLIMAAPARLVEGQYRRALYIDGTVAYTDFMVSLPAGDCWFSKLGAARGYTFGACFPARDYEQKKVLRLTYLTQYYPQEAHKAIVDYWFMRHGGVVPSYFEESKGYEPPPAADGGSCAPPGDDEAREDEGETEDGAAGREGNGGPCGPEG

重组gD蛋白（SEQ ID NO:2）：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGHTTGPIPSPFADGREQPVEVRYATSAAACDMLALIADPQVGRTLWEAVRRHARAYNATVIWYKIESGCARPLYYMEYTECEPRKHFGYCRYRTPPFWDSFLAGFAYPTDDELGLIMAAPARLVEGQYRRALYIDGTVAYTDFMVSLPAGDCWFSKLGAARGYTFGACFPARDYEQKKVLRLTYLTQYYPQEAHKAIVDYWFMRHGGVVPSYFEESKGYEPPPAADGGSCAPPGDDEAREDEGETEDGAAGREGNGGPCGPEG

重组gH蛋白（SEQ ID NO:3）：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGFSQARAESNAARPPPAPRVTPTPAGRVAAFDINDVLASGPEHFFVPVRADRKRRERHVADFAAVWPVSYIPAGRAVLSCERAAARLAVGLGFLSVSVTSRDLLPLEFMVAPADANVRMITAFNGGGAFPPPGPAAGPQRRAYVIGYGNSRLDSHMYLTMREVASYANEPADFRAHLTAAHREAFLMLREAAAARRGPSAGPAPNAAYHAYRVAARLGLALSALTEGALADGYVLAEELVDLDYHLKLLSRVLLGAGLGCAANGRVRARTIAQLAVPRELRPDAFIPEPAGAALESVVARGRKLRAVYAFSGPDAPLAARLLAHGVVSDLYDAFLRGELTWGPPMRHALFFAVAASAFPADAQALELARDVTRKCTAMCTAGHATAAALDLEEVYAHVGGGAGGDAGFELLDAFSPCMASFRLDLLEEAHVLDVLSAVPARAALDAWLECQPAAAAPNLSAAALGMLGRGGLFGPAHAAALAPELFAAPCGGWGAGAAVAIVPVAPNASYVITRAHPRRGLTY

重组gL蛋白（SEQ ID NO:4）：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGTRRADSAESILAERCRGNLLLADRPQHEEAAPGLAGIFIRGRCSPPEAALWYEDTGETYWANPYAVARGLAEDIRRVLADTPVYRDLAIQVLNSAFGLPHEVRAPLPPPPRGCVLPPCYHTTGPCGPGDGIYR

重组gB蛋白基因（SEQ ID NO:5）：

atggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccgggcagcaccggcggcatgggcgaaattaccgatctggcgaacaaaaaatggcgctgcctgagcaaagcggaatatctgcgcagcggccgcaaagtggtggcgtttgatcgcgatgatgatccgtgggaagcgccgctgaaaccggcgcgcctgagcgcgccgggcgtgcgcggctggcataccaccgatgatgtgtataccgcgctgggcagcgcgggcctgtatcgcaccggcaccagcgtgaactgcattgtggaagaagtggaagcgcgcagcgtgtatccgtatgatagctttgcgtttagcaccggcgatattatttatatgagcccgttttatggcctgcgcgaaggcgcgcatcgcgaacataccagctatagcccggaacgctttcagcagattgaaggctattataaacgcgatatggcgaccggccgccgcctgaaagaaccggtgagccgcaactttctgcgcacccagcatgtgaccgtggcgtgggattgggtgccgaaacgcaaaaacgtgtgcagcctggcgaaatggcgcgaagcggatgaaatgctgcgcgatgaaagccgcggcaactttcgctttaccgcgcgcagcctgagcgcgacctttgtgagcgatagccatacctttgcgctgcagaacgtgccgctgagcgattgcgtgattgaagaagcggaagcggcggtggaacgcgtgtatcgcgaacgctataacggcacccatgtgctgagcggcagcctggaaacctatctggcgcgcggcggctttgtggtggcgtttcgcccgatgctgagcaacgaactggcgaaactgtatctgcaggaactggcgcgcagcaacggcaccctggaaggcctgtttgcggcggcggcgccgaaaccgggcccgcgccgcgcgcgccgcgcggcgccgagcgcgccgggcggcccgggcgcggcgaacggcccggcgggcgatggcgatgcgggcggccgcgtgaccaccgtgagcagcgcggaatttgcggcgctgcagtttacctatgatcatattcaggatcatgtgaacaccatgtttagccgcctggcgaccagctggtgcctgctgcagaacaaagaacgcgcgctgtgggcggaagcggcgaaactgaacccgagcgcggcggcgagcgcggcgctggatcgccgcgcggcggcgcgcatgctgggcTGCgcgatggcggtgacctattgccatgaactgggcgaaggccgcgtgtttattgaaaacagcatgcgcgcgccgggcggcgtgtgctatagccgcccgccggtgagctttgcgtttggcaacgaaagcgaaTGCgtggaaggccagctgggcgaagataacgaactgctgccgggccgcgaactggtggaaccgtgcaccgcgaac

重组gD蛋白基因（SEQ ID NO:6）：

atggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccgggcagcaccggccataccaccggcccgattccgagcccgtttgcggatggccgcgaacagccggtggaagtgcgctatgcgaccagcgcggcggcgtgcgatatgctggcgctgattgcggatccgcaggtgggccgcaccctgtgggaagcggtgcgccgccatgcgcgcgcgtataacgcgaccgtgatttggtataaaattgaaagcggctgcgcgcgcccgctgtattatatggaatataccgaatgcgaaccgcgcaaacattttggctattgccgctatcgcaccccgccgttttgggatagctttctggcgggctttgcgtatccgaccgatgatgaactgggcctgattatggcggcgccggcgcgcctggtggaaggccagtatcgccgcgcgctgtatattgatggcaccgtggcgtataccgattttatggtgagcctgccggcgggcgattgctggtttagcaaactgggcgcggcgcgcggctatacctttggcgcgtgctttccggcgcgcgattatgaacagaaaaaagtgctgcgcctgacctatctgacccagtattatccgcaggaagcgcataaagcgattgtggattattggtttatgcgccatggcggcgtggtgccgagctattttgaagaaagcaaaggctatgaaccgccgccggcggcggatggcggcagcTGCgcgccgccgggcgatgatgaagcgcgcgaagatgaaggcgaaaccgaagatggcgcggcgggccgcgaaggcaacggcggcccgT GCggcccggaaggc

重组gH蛋白基因（SEQ ID NO:7）：

atggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccgggcagcaccggctttagccaggcgcgcgcggaaagcaacgcggcgcgcccgccgccggcgccgcgcgtgaccccgaccccggcgggccgcgtggcggcgtttgatattaacgatgtgctggcgagcggcccggaacatttttttgtgccggtgcgcgcggatcgcaaacgccgcgaacgccatgtggcggattttgcggcggtgtggccggtgagctatattccggcgggccgcgcggtgctgagctgcgaacgcgcggcggcgcgcctggcggtgggcctgggctttctgagcgtgagcgtgaccagccgcgatctgctgccgctggaatttatggtggcgccggcggatgcgaacgtgcgcatgattaccgcgtttaacggcggcggcgcgtttccgccgccgggcccggcggcgggcccgcagcgccgcgcgtatgtgattggctatggcaacagccgcctggatagccatatgtatctgaccatgcgcgaagtggcgagctatgcgaacgaaccggcggattttcgcgcgcatctgaccgcggcgcatcgcgaagcgtttctgatgctgcgcgaagcggcggcggcgcgccgcggcccgagcgcgggcccggcgccgaacgcggcgtatcatgcgtatcgcgtggcggcgcgcctgggcctggcgctgagcgcgctgaccgaaggcgcgctggcggatggctatgtgctggcggaagaactggtggatctggattatcatctgaaactgctgagccgcgtgctgctgggcgcgggcctgggctgcgcggcgaacggccgcgtgcgcgcgcgcaccattgcgcagctggcggtgccgcgcgaactgcgcccggatgcgtttattccggaaccggcgggcgcggcgctggaaagcgtggtggcgcgcggccgcaaactgcgcgcggtgtatgcgtttagcggcccggatgcgccgctggcggcgcgcctgctggcgcatggcgtggtgagcgatctgtatgatgcgtttctgcgcggcgaactgacctggggcccgccgatgcgccatgcgctgttttttgcggtggcggcgagcgcgtttccggcggatgcgcaggcgctggaactggcgcgcgatgtgacccgcaaatgcaccgcgatgtgcaccgcgggccatgcgaccgcggcggcgctggatctggaagaagtgtatgcgcatgtgggcggcggcgcgggcggcgatgcgggctttgaactgctggatgcgtttagcccgtgcatggcgagctttcgcctggatctgctggaagaagcgcatgtgctggatgtgctgagcgcggtgccggcgcgcgcggcgctggatgcgtggctggaaTGTcagccggcggcggcggcgccgaacctgagcgcggcggcgctgggcatgctgggccgcggcggcctgtttggcccggcgcatgcggcggcgctggcgccggaactgtttgcggcgccgtgcggcggctggggcgcgggcgcggcggtggcgattgtgccggtggcgccgaacgcgagctatgtgattacccgcgcgcatccgcgccgcggcctgacctat

重组gL蛋白基因（SEQ ID NO:8）：

atggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccgggcagcaccggcacccgccgcgcggatagcgcggaaagcattctggcggaacgctgccgcggcaacctgctgctggcggatcgcccgcagcatgaagaagcggcgccgggcctggcgggcatttttattcgcggccgctgcagcccgccggaagcggcgctgtggtatgaagataccggcgaaacctattgggcgaacccgtatgcggtggcgcgcggcctggcggaagatattcgccgcgtgctggcggataccccggtgtatcgcgatctggcgattcaggtgctgaacagcgcgtttggcctgccgcatgaagtgcgcgcgccgctgccgccgccgccgcgcggctgcgtgctgccgccgTGTtatcataccaccggcccgtgcggcccgggcgatggcatttatcgc

IRES序列：

cgcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataa

gB-gD基因表达框（SEQ ID NO:9）：

gccgccaccatggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccgggcagcaccggcggcatgggcgaaattaccgatctggcgaacaaaaaatggcgctgcctgagcaaagcggaatatctgcgcagcggccgcaaagtggtggcgtttgatcgcgatgatgatccgtgggaagcgccgctgaaaccggcgcgcctgagcgcgccgggcgtgcgcggctggcataccaccgatgatgtgtataccgcgctgggcagcgcgggcctgtatcgcaccggcaccagcgtgaactgcattgtggaagaagtggaagcgcgcagcgtgtatccgtatgatagctttgcgtttagcaccggcgatattatttatatgagcccgttttatggcctgcgcgaaggcgcgcatcgcgaacataccagctatagcccggaacgctttcagcagattgaaggctattataaacgcgatatggcgaccggccgccgcctgaaagaaccggtgagccgcaactttctgcgcacccagcatgtgaccgtggcgtgggattgggtgccgaaacgcaaaaacgtgtgcagcctggcgaaatggcgcgaagcggatgaaatgctgcgcgatgaaagccgcggcaactttcgctttaccgcgcgcagcctgagcgcgacctttgtgagcgatagccatacctttgcgctgcagaacgtgccgctgagcgattgcgtgattgaagaagcggaagcggcggtggaacgcgtgtatcgcgaacgctataacggcacccatgtgctgagcggcagcctggaaacctatctggcgcgcggcggctttgtggtggcgtttcgcccgatgctgagcaacgaactggcgaaactgtatctgcaggaactggcgcgcagcaacggcaccctggaaggcctgtttgcggcggcggcgccgaaaccgggcccgcgccgcgcgcgccgcgcggcgccgagcgcgccgggcggcccgggcgcggcgaacggcccggcgggcgatggcgatgcgggcggccgcgtgaccaccgtgagcagcgcggaatttgcggcgctgcagtttacctatgatcatattcaggatcatgtgaacaccatgtttagccgcctggcgaccagctggtgcctgctgcagaacaaagaacgcgcgctgtgggcggaagcggcgaaactgaacccgagcgcggcggcgagcgcggcgctggatcgccgcgcggcggcgcgcatgctgggcTGCgcgatggcggtgacctattgccatgaactgggcgaaggccgcgtgtttattgaaaacagcatgcgcgcgccgggcggcgtgtgctatagccgcccgccggtgagctttgcgtttggcaacgaaagcgaaTGCgtggaaggccagctgggcgaagataacgaactgctgccgggccgcgaactggtggaaccgtgcaccgcgaaccatcatcatcatcatcattaacgcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaa aacacgatgataagccgccaccatggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccgggcagcaccggccataccaccggcccgattccgagcccgtttgcggatggccgcgaacagccggtggaagtgcgctatgcgaccagcgcggcggcgtgcgatatgctggcgctgattgcggatccgcaggtgggccgcaccctgtgggaagcggtgcgccgccatgcgcgcgcgtataacgcgaccgtgatttggtataaaattgaaagcggctgcgcgcgcccgctgtattatatggaatataccgaatgcgaaccgcgcaaacattttggctattgccgctatcgcaccccgccgttttgggatagctttctggcgggctttgcgtatccgaccgatgatgaactgggcctgattatggcggcgccggcgcgcctggtggaaggccagtatcgccgcgcgctgtatattgatggcaccgtggcgtataccgattttatggtgagcctgccggcgggcgattgctggtttagcaaactgggcgcggcgcgcggctatacctttggcgcgtgctttccggcgcgcgattatgaacagaaaaaagtgctgcgcctgacctatctgacccagtattatccgcaggaagcgcataaagcgattgtggattattggtttatgcgccatggcggcgtggtgccgagctattttgaagaaagcaaaggctatgaaccgccgccggcggcggatggcggcagcTGCgcgccgccgggcgatgatgaagcgcgcgaagatgaaggcgaaaccgaagatggcgcggcgggccgcgaaggcaacggcggcccgTGCggcccggaaggccatcatcatcatcatcattaa

gH-gL基因表达框（SEQ ID NO:10）：

gccgccaccatggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccgggcagcaccggctttagccaggcgcgcgcggaaagcaacgcggcgcgcccgccgccggcgccgcgcgtgaccccgaccccggcgggccgcgtggcggcgtttgatattaacgatgtgctggcgagcggcccggaacatttttttgtgccggtgcgcgcggatcgcaaacgccgcgaacgccatgtggcggattttgcggcggtgtggccggtgagctatattccggcgggccgcgcggtgctgagctgcgaacgcgcggcggcgcgcctggcggtgggcctgggctttctgagcgtgagcgtgaccagccgcgatctgctgccgctggaatttatggtggcgccggcggatgcgaacgtgcgcatgattaccgcgtttaacggcggcggcgcgtttccgccgccgggcccggcggcgggcccgcagcgccgcgcgtatgtgattggctatggcaacagccgcctggatagccatatgtatctgaccatgcgcgaagtggcgagctatgcgaacgaaccggcggattttcgcgcgcatctgaccgcggcgcatcgcgaagcgtttctgatgctgcgcgaagcggcggcggcgcgccgcggcccgagcgcgggcccggcgccgaacgcggcgtatcatgcgtatcgcgtggcggcgcgcctgggcctggcgctgagcgcgctgaccgaaggcgcgctggcggatggctatgtgctggcggaagaactggtggatctggattatcatctgaaactgctgagccgcgtgctgctgggcgcgggcctgggctgcgcggcgaacggccgcgtgcgcgcgcgcaccattgcgcagctggcggtgccgcgcgaactgcgcccggatgcgtttattccggaaccggcgggcgcggcgctggaaagcgtggtggcgcgcggccgcaaactgcgcgcggtgtatgcgtttagcggcccggatgcgccgctggcggcgcgcctgctggcgcatggcgtggtgagcgatctgtatgatgcgtttctgcgcggcgaactgacctggggcccgccgatgcgccatgcgctgttttttgcggtggcggcgagcgcgtttccggcggatgcgcaggcgctggaactggcgcgcgatgtgacccgcaaatgcaccgcgatgtgcaccgcgggccatgcgaccgcggcggcgctggatctggaagaagtgtatgcgcatgtgggcggcggcgcgggcggcgatgcgggctttgaactgctggatgcgtttagcccgtgcatggcgagctttcgcctggatctgctggaagaagcgcatgtgctggatgtgctgagcgcggtgccggcgcgcgcggcgctggatgcgtggctggaaTGTcagccggcggcggcggcgccgaacctgagcgcggcggcgctgggcatgctgggccgcggcggcctgtttggcccggcgcatgcggcggcgctggcgccggaactgtttgcggcgccgtgcggcggctggggcgcgggcgcggcggtggcgattgtgccggtggcgccgaacgcgagctatgtgattacccgcgcgcatccgcgccgcggcctgacctatcatcatcatcatcatcattgacgcccctctccc tcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataagccgccaccatggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccgggcagcaccggcacccgccgcgcggatagcgcggaaagcattctggcggaacgctgccgcggcaacctgctgctggcggatcgcccgcagcatgaagaagcggcgccgggcctggcgggcatttttattcgcggccgctgcagcccgccggaagcggcgctgtggtatgaagataccggcgaaacctattgggcgaacccgtatgcggtggcgcgcggcctggcggaagatattcgccgcgtgctggcggataccccggtgtatcgcgatctggcgattcaggtgctgaacagcgcgtttggcctgccgcatgaagtgcgcgcgccgctgccgccgccgccgcgcggctgcgtgctgccgccgTGTtatcataccaccggcccgtgcggcccgggcgatggcatttatcgccatcatcatcatcatcattaa

未突变的gB蛋白基因：

atggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccgggcagcaccggcggcatgggcgaaattaccgatctggcgaacaaaaaatggcgctgcctgagcaaagcggaatatctgcgcagcggccgcaaagtggtggcgtttgatcgcgatgatgatccgtgggaagcgccgctgaaaccggcgcgcctgagcgcgccgggcgtgcgcggctggcataccaccgatgatgtgtataccgcgctgggcagcgcgggcctgtatcgcaccggcaccagcgtgaactgcattgtggaagaagtggaagcgcgcagcgtgtatccgtatgatagctttgcgtttagcaccggcgatattatttatatgagcccgttttatggcctgcgcgaaggcgcgcatcgcgaacataccagctatagcccggaacgctttcagcagattgaaggctattataaacgcgatatggcgaccggccgccgcctgaaagaaccggtgagccgcaactttctgcgcacccagcatgtgaccgtggcgtgggattgggtgccgaaacgcaaaaacgtgtgcagcctggcgaaatggcgcgaagcggatgaaatgctgcgcgatgaaagccgcggcaactttcgctttaccgcgcgcagcctgagcgcgacctttgtgagcgatagccatacctttgcgctgcagaacgtgccgctgagcgattgcgtgattgaagaagcggaagcggcggtggaacgcgtgtatcgcgaacgctataacggcacccatgtgctgagcggcagcctggaaacctatctggcgcgcggcggctttgtggtggcgtttcgcccgatgctgagcaacgaactggcgaaactgtatctgcaggaactggcgcgcagcaacggcaccctggaaggcctgtttgcggcggcggcgccgaaaccgggcccgcgccgcgcgcgccgcgcggcgccgagcgcgccgggcggcccgggcgcggcgaacggcccggcgggcgatggcgatgcgggcggccgcgtgaccaccgtgagcagcgcggaatttgcggcgctgcagtttacctatgatcatattcaggatcatgtgaacaccatgtttagccgcctggcgaccagctggtgcctgctgcagaacaaagaacgcgcgctgtgggcggaagcggcgaaactgaacccgagcgcggcggcgagcgcggcgctggatcgccgcgcggcggcgcgcatgctgggcGATgcgatggcggtgacctattgccatgaactgggcgaaggccgcgtgtttattgaaaacagcatgcgcgcgccgggcggcgtgtgctatagccgcccgccggtgagctttgcgtttggcaacgaaagcgaaCCGgtggaaggccagctgggcgaagataacgaactgctgccgggccgcgaactggtggaaccgtgcaccgcgaac

未突变的gD蛋白基因：

atggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccgggcagcaccggccataccaccggcccgattccgagcccgtttgcggatggccgcgaacagccggtggaagtgcgctatgcgaccagcgcggcggcgtgcgatatgctggcgctgattgcggatccgcaggtgggccgcaccctgtgggaagcggtgcgccgccatgcgcgcgcgtataacgcgaccgtgatttggtataaaattgaaagcggctgcgcgcgcccgctgtattatatggaatataccgaatgcgaaccgcgcaaacattttggctattgccgctatcgcaccccgccgttttgggatagctttctggcgggctttgcgtatccgaccgatgatgaactgggcctgattatggcggcgccggcgcgcctggtggaaggccagtatcgccgcgcgctgtatattgatggcaccgtggcgtataccgattttatggtgagcctgccggcgggcgattgctggtttagcaaactgggcgcggcgcgcggctatacctttggcgcgtgctttccggcgcgcgattatgaacagaaaaaagtgctgcgcctgacctatctgacccagtattatccgcaggaagcgcataaagcgattgtggattattggtttatgcgccatggcggcgtggtgccgagctattttgaagaaagcaaaggctatgaaccgccgccggcggcggatggcggcagcCCGgcgccgccgggcgatgatgaagcgcgcgaagatgaaggcgaaaccgaagatggcgcggcgggccgcgaaggcaacggcggcccgC CGggcccggaaggc

未突变的gH蛋白基因：

atggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccgggcagcaccggctttagccaggcgcgcgcggaaagcaacgcggcgcgcccgccgccggcgccgcgcgtgaccccgaccccggcgggccgcgtggcggcgtttgatattaacgatgtgctggcgagcggcccggaacatttttttgtgccggtgcgcgcggatcgcaaacgccgcgaacgccatgtggcggattttgcggcggtgtggccggtgagctatattccggcgggccgcgcggtgctgagctgcgaacgcgcggcggcgcgcctggcggtgggcctgggctttctgagcgtgagcgtgaccagccgcgatctgctgccgctggaatttatggtggcgccggcggatgcgaacgtgcgcatgattaccgcgtttaacggcggcggcgcgtttccgccgccgggcccggcggcgggcccgcagcgccgcgcgtatgtgattggctatggcaacagccgcctggatagccatatgtatctgaccatgcgcgaagtggcgagctatgcgaacgaaccggcggattttcgcgcgcatctgaccgcggcgcatcgcgaagcgtttctgatgctgcgcgaagcggcggcggcgcgccgcggcccgagcgcgggcccggcgccgaacgcggcgtatcatgcgtatcgcgtggcggcgcgcctgggcctggcgctgagcgcgctgaccgaaggcgcgctggcggatggctatgtgctggcggaagaactggtggatctggattatcatctgaaactgctgagccgcgtgctgctgggcgcgggcctgggctgcgcggcgaacggccgcgtgcgcgcgcgcaccattgcgcagctggcggtgccgcgcgaactgcgcccggatgcgtttattccggaaccggcgggcgcggcgctggaaagcgtggtggcgcgcggccgcaaactgcgcgcggtgtatgcgtttagcggcccggatgcgccgctggcggcgcgcctgctggcgcatggcgtggtgagcgatctgtatgatgcgtttctgcgcggcgaactgacctggggcccgccgatgcgccatgcgctgttttttgcggtggcggcgagcgcgtttccggcggatgcgcaggcgctggaactggcgcgcgatgtgacccgcaaatgcaccgcgatgtgcaccgcgggccatgcgaccgcggcggcgctggatctggaagaagtgtatgcgcatgtgggcggcggcgcgggcggcgatgcgggctttgaactgctggatgcgtttagcccgtgcatggcgagctttcgcctggatctgctggaagaagcgcatgtgctggatgtgctgagcgcggtgccggcgcgcgcggcgctggatgcgtggctggaaGCGcagccggcggcggcggcgccgaacctgagcgcggcggcgctgggcatgctgggccgcggcggcctgtttggcccggcgcatgcggcggcgctggcgccggaactgtttgcggcgccgtgcggcggctggggcgcgggcgcggcggtggcgattgtgccggtggcgccgaacgcgagctatgtgattacccgcgcgcatccgcgccgcggcctgacctat

未突变的gL蛋白基因：

atggaaaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccgggcagcaccggcacccgccgcgcggatagcgcggaaagcattctggcggaacgctgccgcggcaacctgctgctggcggatcgcccgcagcatgaagaagcggcgccgggcctggcgggcatttttattcgcggccgctgcagcccgccggaagcggcgctgtggtatgaagataccggcgaaacctattgggcgaacccgtatgcggtggcgcgcggcctggcggaagatattcgccgcgtgctggcggataccccggtgtatcgcgatctggcgattcaggtgctgaacagcgcgtttggcctgccgcatgaagtgcgcgcgccgctgccgccgccgccgcgcggctgcgtgctgccgccgCGCtatcataccaccggcccgtgcggcccgggcgatggcatttatcgc

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 牛疱疹病毒抗原组合物及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 282

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly His Thr Thr Gly Pro Ile Pro Ser Pro Phe Ala Asp

20 25 30

Gly Arg Glu Gln Pro Val Glu Val Arg Tyr Ala Thr Ser Ala Ala Ala

35 40 45

Cys Asp Met Leu Ala Leu Ile Ala Asp Pro Gln Val Gly Arg Thr Leu

50 55 60

Trp Glu Ala Val Arg Arg His Ala Arg Ala Tyr Asn Ala Thr Val Ile

65 70 75 80

Trp Tyr Lys Ile Glu Ser Gly Cys Ala Arg Pro Leu Tyr Tyr Met Glu

85 90 95

Tyr Thr Glu Cys Glu Pro Arg Lys His Phe Gly Tyr Cys Arg Tyr Arg

100 105 110

Thr Pro Pro Phe Trp Asp Ser Phe Leu Ala Gly Phe Ala Tyr Pro Thr

115 120 125

Asp Asp Glu Leu Gly Leu Ile Met Ala Ala Pro Ala Arg Leu Val Glu

130 135 140

Gly Gln Tyr Arg Arg Ala Leu Tyr Ile Asp Gly Thr Val Ala Tyr Thr

145 150 155 160

Asp Phe Met Val Ser Leu Pro Ala Gly Asp Cys Trp Phe Ser Lys Leu

165 170 175

Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Cys Phe Pro Ala Arg Asp

180 185 190

Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu Arg Leu Thr Tyr Leu Thr Gln Tyr Tyr

195 200 205

Pro Gln Glu Ala His Lys Ala Ile Val Asp Tyr Trp Phe Met Arg His

210 215 220

Gly Gly Val Val Pro Ser Tyr Phe Glu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Pro

225 230 235 240

Pro Pro Ala Ala Asp Gly Gly Ser Cys Ala Pro Pro Gly Asp Asp Glu

245 250 255

Ala Arg Glu Asp Glu Gly Glu Thr Glu Asp Gly Ala Ala Gly Arg Glu

260 265 270

Gly Asn Gly Gly Pro Cys Gly Pro Glu Gly

275 280

<210> 2

<211> 282

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly His Thr Thr Gly Pro Ile Pro Ser Pro Phe Ala Asp

20 25 30

Gly Arg Glu Gln Pro Val Glu Val Arg Tyr Ala Thr Ser Ala Ala Ala

35 40 45

Cys Asp Met Leu Ala Leu Ile Ala Asp Pro Gln Val Gly Arg Thr Leu

50 55 60

Trp Glu Ala Val Arg Arg His Ala Arg Ala Tyr Asn Ala Thr Val Ile

65 70 75 80

Trp Tyr Lys Ile Glu Ser Gly Cys Ala Arg Pro Leu Tyr Tyr Met Glu

85 90 95

Tyr Thr Glu Cys Glu Pro Arg Lys His Phe Gly Tyr Cys Arg Tyr Arg

100 105 110

Thr Pro Pro Phe Trp Asp Ser Phe Leu Ala Gly Phe Ala Tyr Pro Thr

115 120 125

Asp Asp Glu Leu Gly Leu Ile Met Ala Ala Pro Ala Arg Leu Val Glu

130 135 140

Gly Gln Tyr Arg Arg Ala Leu Tyr Ile Asp Gly Thr Val Ala Tyr Thr

145 150 155 160

Asp Phe Met Val Ser Leu Pro Ala Gly Asp Cys Trp Phe Ser Lys Leu

165 170 175

Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Cys Phe Pro Ala Arg Asp

180 185 190

Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu Arg Leu Thr Tyr Leu Thr Gln Tyr Tyr

195 200 205

Pro Gln Glu Ala His Lys Ala Ile Val Asp Tyr Trp Phe Met Arg His

210 215 220

Gly Gly Val Val Pro Ser Tyr Phe Glu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Pro

225 230 235 240

Pro Pro Ala Ala Asp Gly Gly Ser Cys Ala Pro Pro Gly Asp Asp Glu

245 250 255

Ala Arg Glu Asp Glu Gly Glu Thr Glu Asp Gly Ala Ala Gly Arg Glu

260 265 270

Gly Asn Gly Gly Pro Cys Gly Pro Glu Gly

275 280

<210> 3

<211> 542

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Phe Ser Gln Ala Arg Ala Glu Ser Asn Ala Ala Arg

20 25 30

Pro Pro Pro Ala Pro Arg Val Thr Pro Thr Pro Ala Gly Arg Val Ala

35 40 45

Ala Phe Asp Ile Asn Asp Val Leu Ala Ser Gly Pro Glu His Phe Phe

50 55 60

Val Pro Val Arg Ala Asp Arg Lys Arg Arg Glu Arg His Val Ala Asp

65 70 75 80

Phe Ala Ala Val Trp Pro Val Ser Tyr Ile Pro Ala Gly Arg Ala Val

85 90 95

Leu Ser Cys Glu Arg Ala Ala Ala Arg Leu Ala Val Gly Leu Gly Phe

100 105 110

Leu Ser Val Ser Val Thr Ser Arg Asp Leu Leu Pro Leu Glu Phe Met

115 120 125

Val Ala Pro Ala Asp Ala Asn Val Arg Met Ile Thr Ala Phe Asn Gly

130 135 140

Gly Gly Ala Phe Pro Pro Pro Gly Pro Ala Ala Gly Pro Gln Arg Arg

145 150 155 160

Ala Tyr Val Ile Gly Tyr Gly Asn Ser Arg Leu Asp Ser His Met Tyr

165 170 175

Leu Thr Met Arg Glu Val Ala Ser Tyr Ala Asn Glu Pro Ala Asp Phe

180 185 190

Arg Ala His Leu Thr Ala Ala His Arg Glu Ala Phe Leu Met Leu Arg

195 200 205

Glu Ala Ala Ala Ala Arg Arg Gly Pro Ser Ala Gly Pro Ala Pro Asn

210 215 220

Ala Ala Tyr His Ala Tyr Arg Val Ala Ala Arg Leu Gly Leu Ala Leu

225 230 235 240

Ser Ala Leu Thr Glu Gly Ala Leu Ala Asp Gly Tyr Val Leu Ala Glu

245 250 255

Glu Leu Val Asp Leu Asp Tyr His Leu Lys Leu Leu Ser Arg Val Leu

260 265 270

Leu Gly Ala Gly Leu Gly Cys Ala Ala Asn Gly Arg Val Arg Ala Arg

275 280 285

Thr Ile Ala Gln Leu Ala Val Pro Arg Glu Leu Arg Pro Asp Ala Phe

290 295 300

Ile Pro Glu Pro Ala Gly Ala Ala Leu Glu Ser Val Val Ala Arg Gly

305 310 315 320

Arg Lys Leu Arg Ala Val Tyr Ala Phe Ser Gly Pro Asp Ala Pro Leu

325 330 335

Ala Ala Arg Leu Leu Ala His Gly Val Val Ser Asp Leu Tyr Asp Ala

340 345 350

Phe Leu Arg Gly Glu Leu Thr Trp Gly Pro Pro Met Arg His Ala Leu

355 360 365

Phe Phe Ala Val Ala Ala Ser Ala Phe Pro Ala Asp Ala Gln Ala Leu

370 375 380

Glu Leu Ala Arg Asp Val Thr Arg Lys Cys Thr Ala Met Cys Thr Ala

385 390 395 400

Gly His Ala Thr Ala Ala Ala Leu Asp Leu Glu Glu Val Tyr Ala His

405 410 415

Val Gly Gly Gly Ala Gly Gly Asp Ala Gly Phe Glu Leu Leu Asp Ala

420 425 430

Phe Ser Pro Cys Met Ala Ser Phe Arg Leu Asp Leu Leu Glu Glu Ala

435 440 445

His Val Leu Asp Val Leu Ser Ala Val Pro Ala Arg Ala Ala Leu Asp

450 455 460

Ala Trp Leu Glu Cys Gln Pro Ala Ala Ala Ala Pro Asn Leu Ser Ala

465 470 475 480

Ala Ala Leu Gly Met Leu Gly Arg Gly Gly Leu Phe Gly Pro Ala His

485 490 495

Ala Ala Ala Leu Ala Pro Glu Leu Phe Ala Ala Pro Cys Gly Gly Trp

500 505 510

Gly Ala Gly Ala Ala Val Ala Ile Val Pro Val Ala Pro Asn Ala Ser

515 520 525

Tyr Val Ile Thr Arg Ala His Pro Arg Arg Gly Leu Thr Tyr

530 535 540

<210> 4

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Thr Arg Arg Ala Asp Ser Ala Glu Ser Ile Leu Ala

20 25 30

Glu Arg Cys Arg Gly Asn Leu Leu Leu Ala Asp Arg Pro Gln His Glu

35 40 45

Glu Ala Ala Pro Gly Leu Ala Gly Ile Phe Ile Arg Gly Arg Cys Ser

50 55 60

Pro Pro Glu Ala Ala Leu Trp Tyr Glu Asp Thr Gly Glu Thr Tyr Trp

65 70 75 80

Ala Asn Pro Tyr Ala Val Ala Arg Gly Leu Ala Glu Asp Ile Arg Arg

85 90 95

Val Leu Ala Asp Thr Pro Val Tyr Arg Asp Leu Ala Ile Gln Val Leu

100 105 110

Asn Ser Ala Phe Gly Leu Pro His Glu Val Arg Ala Pro Leu Pro Pro

115 120 125

Pro Pro Arg Gly Cys Val Leu Pro Pro Cys Tyr His Thr Thr Gly Pro

130 135 140

Cys Gly Pro Gly Asp Gly Ile Tyr Arg

145 150

<210> 5

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggaaaccg ataccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccggg cagcaccggc 60

ggcatgggcg aaattaccga tctggcgaac aaaaaatggc gctgcctgag caaagcggaa 120

tatctgcgca gcggccgcaa agtggtggcg tttgatcgcg atgatgatcc gtgggaagcg 180

ccgctgaaac cggcgcgcct gagcgcgccg ggcgtgcgcg gctggcatac caccgatgat 240

gtgtataccg cgctgggcag cgcgggcctg tatcgcaccg gcaccagcgt gaactgcatt 300

gtggaagaag tggaagcgcg cagcgtgtat ccgtatgata gctttgcgtt tagcaccggc 360

gatattattt atatgagccc gttttatggc ctgcgcgaag gcgcgcatcg cgaacatacc 420

agctatagcc cggaacgctt tcagcagatt gaaggctatt ataaacgcga tatggcgacc 480

ggccgccgcc tgaaagaacc ggtgagccgc aactttctgc gcacccagca tgtgaccgtg 540

gcgtgggatt gggtgccgaa acgcaaaaac gtgtgcagcc tggcgaaatg gcgcgaagcg 600

gatgaaatgc tgcgcgatga aagccgcggc aactttcgct ttaccgcgcg cagcctgagc 660

gcgacctttg tgagcgatag ccataccttt gcgctgcaga acgtgccgct gagcgattgc 720

gtgattgaag aagcggaagc ggcggtggaa cgcgtgtatc gcgaacgcta taacggcacc 780

catgtgctga gcggcagcct ggaaacctat ctggcgcgcg gcggctttgt ggtggcgttt 840

cgcccgatgc tgagcaacga actggcgaaa ctgtatctgc aggaactggc gcgcagcaac 900

ggcaccctgg aaggcctgtt tgcggcggcg gcgccgaaac cgggcccgcg ccgcgcgcgc 960

cgcgcggcgc cgagcgcgcc gggcggcccg ggcgcggcga acggcccggc gggcgatggc 1020

gatgcgggcg gccgcgtgac caccgtgagc agcgcggaat ttgcggcgct gcagtttacc 1080

tatgatcata ttcaggatca tgtgaacacc atgtttagcc gcctggcgac cagctggtgc 1140

ctgctgcaga acaaagaacg cgcgctgtgg gcggaagcgg cgaaactgaa cccgagcgcg 1200

gcggcgagcg cggcgctgga tcgccgcgcg gcggcgcgca tgctgggctg cgcgatggcg 1260

gtgacctatt gccatgaact gggcgaaggc cgcgtgttta ttgaaaacag catgcgcgcg 1320

ccgggcggcg tgtgctatag ccgcccgccg gtgagctttg cgtttggcaa cgaaagcgaa 1380

tgcgtggaag gccagctggg cgaagataac gaactgctgc cgggccgcga actggtggaa 1440

ccgtgcaccg cgaac 1455

<210> 6

<211> 846

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggaaaccg ataccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccggg cagcaccggc 60

cataccaccg gcccgattcc gagcccgttt gcggatggcc gcgaacagcc ggtggaagtg 120

cgctatgcga ccagcgcggc ggcgtgcgat atgctggcgc tgattgcgga tccgcaggtg 180

ggccgcaccc tgtgggaagc ggtgcgccgc catgcgcgcg cgtataacgc gaccgtgatt 240

tggtataaaa ttgaaagcgg ctgcgcgcgc ccgctgtatt atatggaata taccgaatgc 300

gaaccgcgca aacattttgg ctattgccgc tatcgcaccc cgccgttttg ggatagcttt 360

ctggcgggct ttgcgtatcc gaccgatgat gaactgggcc tgattatggc ggcgccggcg 420

cgcctggtgg aaggccagta tcgccgcgcg ctgtatattg atggcaccgt ggcgtatacc 480

gattttatgg tgagcctgcc ggcgggcgat tgctggttta gcaaactggg cgcggcgcgc 540

ggctatacct ttggcgcgtg ctttccggcg cgcgattatg aacagaaaaa agtgctgcgc 600

ctgacctatc tgacccagta ttatccgcag gaagcgcata aagcgattgt ggattattgg 660

tttatgcgcc atggcggcgt ggtgccgagc tattttgaag aaagcaaagg ctatgaaccg 720

ccgccggcgg cggatggcgg cagctgcgcg ccgccgggcg atgatgaagc gcgcgaagat 780

gaaggcgaaa ccgaagatgg cgcggcgggc cgcgaaggca acggcggccc gtgcggcccg 840

gaaggc 846

<210> 7

<211> 1626

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggaaaccg ataccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccggg cagcaccggc 60

tttagccagg cgcgcgcgga aagcaacgcg gcgcgcccgc cgccggcgcc gcgcgtgacc 120

ccgaccccgg cgggccgcgt ggcggcgttt gatattaacg atgtgctggc gagcggcccg 180

gaacattttt ttgtgccggt gcgcgcggat cgcaaacgcc gcgaacgcca tgtggcggat 240

tttgcggcgg tgtggccggt gagctatatt ccggcgggcc gcgcggtgct gagctgcgaa 300

cgcgcggcgg cgcgcctggc ggtgggcctg ggctttctga gcgtgagcgt gaccagccgc 360

gatctgctgc cgctggaatt tatggtggcg ccggcggatg cgaacgtgcg catgattacc 420

gcgtttaacg gcggcggcgc gtttccgccg ccgggcccgg cggcgggccc gcagcgccgc 480

gcgtatgtga ttggctatgg caacagccgc ctggatagcc atatgtatct gaccatgcgc 540

gaagtggcga gctatgcgaa cgaaccggcg gattttcgcg cgcatctgac cgcggcgcat 600

cgcgaagcgt ttctgatgct gcgcgaagcg gcggcggcgc gccgcggccc gagcgcgggc 660

ccggcgccga acgcggcgta tcatgcgtat cgcgtggcgg cgcgcctggg cctggcgctg 720

agcgcgctga ccgaaggcgc gctggcggat ggctatgtgc tggcggaaga actggtggat 780

ctggattatc atctgaaact gctgagccgc gtgctgctgg gcgcgggcct gggctgcgcg 840

gcgaacggcc gcgtgcgcgc gcgcaccatt gcgcagctgg cggtgccgcg cgaactgcgc 900

ccggatgcgt ttattccgga accggcgggc gcggcgctgg aaagcgtggt ggcgcgcggc 960

cgcaaactgc gcgcggtgta tgcgtttagc ggcccggatg cgccgctggc ggcgcgcctg 1020

ctggcgcatg gcgtggtgag cgatctgtat gatgcgtttc tgcgcggcga actgacctgg 1080

ggcccgccga tgcgccatgc gctgtttttt gcggtggcgg cgagcgcgtt tccggcggat 1140

gcgcaggcgc tggaactggc gcgcgatgtg acccgcaaat gcaccgcgat gtgcaccgcg 1200

ggccatgcga ccgcggcggc gctggatctg gaagaagtgt atgcgcatgt gggcggcggc 1260

gcgggcggcg atgcgggctt tgaactgctg gatgcgttta gcccgtgcat ggcgagcttt 1320

cgcctggatc tgctggaaga agcgcatgtg ctggatgtgc tgagcgcggt gccggcgcgc 1380

gcggcgctgg atgcgtggct ggaatgtcag ccggcggcgg cggcgccgaa cctgagcgcg 1440

gcggcgctgg gcatgctggg ccgcggcggc ctgtttggcc cggcgcatgc ggcggcgctg 1500

gcgccggaac tgtttgcggc gccgtgcggc ggctggggcg cgggcgcggc ggtggcgatt 1560

gtgccggtgg cgccgaacgc gagctatgtg attacccgcg cgcatccgcg ccgcggcctg 1620

acctat 1626

<210> 8

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggaaaccg ataccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccggg cagcaccggc 60

acccgccgcg cggatagcgc ggaaagcatt ctggcggaac gctgccgcgg caacctgctg 120

ctggcggatc gcccgcagca tgaagaagcg gcgccgggcc tggcgggcat ttttattcgc 180

ggccgctgca gcccgccgga agcggcgctg tggtatgaag ataccggcga aacctattgg 240

gcgaacccgt atgcggtggc gcgcggcctg gcggaagata ttcgccgcgt gctggcggat 300

accccggtgt atcgcgatct ggcgattcag gtgctgaaca gcgcgtttgg cctgccgcat 360

gaagtgcgcg cgccgctgcc gccgccgccg cgcggctgcg tgctgccgcc gtgttatcat 420

accaccggcc cgtgcggccc gggcgatggc atttatcgc 459

<210> 9

<211> 2937

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccgccacca tggaaaccga taccctgctg ctgtgggtgc tgctgctgtg ggtgccgggc 60

agcaccggcg gcatgggcga aattaccgat ctggcgaaca aaaaatggcg ctgcctgagc 120

aaagcggaat atctgcgcag cggccgcaaa gtggtggcgt ttgatcgcga tgatgatccg 180

tgggaagcgc cgctgaaacc ggcgcgcctg agcgcgccgg gcgtgcgcgg ctggcatacc 240

accgatgatg tgtataccgc gctgggcagc gcgggcctgt atcgcaccgg caccagcgtg 300

aactgcattg tggaagaagt ggaagcgcgc agcgtgtatc cgtatgatag ctttgcgttt 360

agcaccggcg atattattta tatgagcccg ttttatggcc tgcgcgaagg cgcgcatcgc 420

gaacatacca gctatagccc ggaacgcttt cagcagattg aaggctatta taaacgcgat 480

atggcgaccg gccgccgcct gaaagaaccg gtgagccgca actttctgcg cacccagcat 540

gtgaccgtgg cgtgggattg ggtgccgaaa cgcaaaaacg tgtgcagcct ggcgaaatgg 600

cgcgaagcgg atgaaatgct gcgcgatgaa agccgcggca actttcgctt taccgcgcgc 660

agcctgagcg cgacctttgt gagcgatagc catacctttg cgctgcagaa cgtgccgctg 720

agcgattgcg tgattgaaga agcggaagcg gcggtggaac gcgtgtatcg cgaacgctat 780

aacggcaccc atgtgctgag cggcagcctg gaaacctatc tggcgcgcgg cggctttgtg 840

gtggcgtttc gcccgatgct gagcaacgaa ctggcgaaac tgtatctgca ggaactggcg 900

cgcagcaacg gcaccctgga aggcctgttt gcggcggcgg cgccgaaacc gggcccgcgc 960

cgcgcgcgcc gcgcggcgcc gagcgcgccg ggcggcccgg gcgcggcgaa cggcccggcg 1020

ggcgatggcg atgcgggcgg ccgcgtgacc accgtgagca gcgcggaatt tgcggcgctg 1080

cagtttacct atgatcatat tcaggatcat gtgaacacca tgtttagccg cctggcgacc 1140

agctggtgcc tgctgcagaa caaagaacgc gcgctgtggg cggaagcggc gaaactgaac 1200

ccgagcgcgg cggcgagcgc ggcgctggat cgccgcgcgg cggcgcgcat gctgggctgc 1260

gcgatggcgg tgacctattg ccatgaactg ggcgaaggcc gcgtgtttat tgaaaacagc 1320

atgcgcgcgc cgggcggcgt gtgctatagc cgcccgccgg tgagctttgc gtttggcaac 1380

gaaagcgaat gcgtggaagg ccagctgggc gaagataacg aactgctgcc gggccgcgaa 1440

ctggtggaac cgtgcaccgc gaaccatcat catcatcatc attaacgccc ctctccctcc 1500

ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat 1560

atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct 1620

gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg 1680

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atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat 1920

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cgcgaaggca acggcggccc gtgcggcccg gaaggccatc atcatcatca tcattaa 2937

<210> 10

<211> 2721

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gccgccacca tggaaaccga taccctgctg ctgtgggtgc tgctgctgtg ggtgccgggc 60

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