一种含EB病毒gHgL蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种含EB病毒gHgL蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用 (Self-assembled nano-particles containing EB virus gHgL protein and preparation method and application thereof ) 是由 曾木圣 孙聪 冯国开 康银峰 于 2021-01-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含EB病毒gHgL蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用。该自组装纳米颗粒,包含第一多肽和第二多肽；所述第一多肽包含gHgL蛋白和第一载体亚基,所述第二多肽包含第二载体亚基；所述第一载体亚基为I53-50A1,所述第二载体亚基为I53-50B.4PT1；所述gHgL蛋白与第一载体亚基通过铰链连接。该自组装纳米颗粒首次将EB病毒的gHgL蛋白展示在纳米颗粒表面,其粒径较抗原(gHgL)大,具有更好的抗原驻留体积,热稳定与抗原(gHgL)相当,同时其展示的gHgL数量更多能够更强地刺激B细胞,并且能够诱导更高的抗体滴度,可用于预防EB病毒感染及治疗EB病毒感染所引起的疾病。(The invention discloses a self-assembled nano-particle containing EB virus gHgL protein, a preparation method and application thereof. The self-assembled nanoparticle comprising a first polypeptide and a second polypeptide; the first polypeptide comprises a gHgL protein and a first carrier subunit, and the second polypeptide comprises a second carrier subunit; the first vector subunit is I53-50A1, and the second vector subunit is I53-50 B.4PT1; the gHgL protein is hingedly connected to the first vector subunit. The self-assembly nano-particle displays the gHgL protein of the EB virus on the surface of the nano-particle for the first time, the particle size of the self-assembly nano-particle is larger than that of an antigen (gHgL), the self-assembly nano-particle has better antigen retention volume, the thermal stability is equivalent to that of the antigen (gHgL), the number of the displayed gHgL is more, B cells can be stimulated more strongly, higher antibody titer can be induced, and the self-assembly nano-particle can be used for preventing the EB virus infection and treating diseases caused by the EB virus infection.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含EB病毒gHgL蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)属于γ疱疹病毒，是一种带有包膜的双链DNA病毒，主要感染皮肤、黏膜、神经等外胚层来源的组织。它在人群中感染非常普遍，患病率高达95％，且极易在体内终生潜伏。除了引起传染性单核细胞增多症，EB病毒还可引起移植后淋巴细胞增殖性疾病和一些B细胞、上皮细胞的恶性肿瘤。淋巴细胞增殖性疾病包括Burkitt淋巴瘤、弥漫大B细胞性淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤等；恶性肿瘤包括鼻咽癌、胃癌等。
在EBV的融合蛋白复合体中，既包括在疱疹病毒家族保守存在的gB和gHgL，也包括EBV特有的 gp350和gp42。研究发现，gHgL在膜融合过程中作为重要的受体结合蛋白，既能单独发挥作用介导上皮细胞感染，也能与gp42形成共同的复合物参与B细胞感染。此外gHgL中和抗体在上皮细胞感染和B细胞感染中都具有极强的EB病毒中和效果，这些都证实了gHgL是理想的EBV疫苗免疫原。
发明内容
为了克服现有技术所存在的不足，本发明的第一方面的目的，在于提供一种含gHgL蛋白的自组装纳米颗粒。
本发明的第二个方面的目的，在于提供一种第一方面的自组装纳米颗粒的制备方法。
本发明的第三个方面的目的，在于提供第一方面的自组装纳米颗粒在制备预防EB病毒感染的药品中的应用。
本发明的第四个方面的目的，在于提供上述一种包含第一方面的自组装纳米颗粒的疫苗。
本发明的第五方面的目的，在于提供第一方面的自组装纳米颗粒在制备治疗EB病毒感染所引起的疾病的药品中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种含gHgL蛋白的自组装纳米颗粒，包含第一多肽和第二多肽；所述第一多肽包含gHgL蛋白和第一载体亚基，所述第二多肽包含第二载体亚基；所述第一载体亚基为I53-50A1，所述第二载体亚基为I53-50B.4PT1；所述gHgL蛋白与第一载体亚基通过铰链连接，可以使得组装后的纳米颗粒外展示gHgL蛋白，更好地激发机体的免疫反应。
优选的，所述铰链包含柔性序列和刚性接头，铰链用于gHgL蛋白与载体蛋白(载体蛋白由第一载体亚基和第二载体亚基组成)的连接，不影响gHgL蛋白的免疫原性以及蛋白的正确折叠。
优选的，所述柔性序列为含5～9个氨基酸的多肽；进一步为SEQ ID NO：12～SEQID NO：16中任一种的多肽；更进一步为如SEQ ID NO：15所示的多肽。
优选的，所述刚性接头的氨基酸序列为EKAAKAEEAA(SEQ ID NO：31)。
优选的，所述第一载体亚基与所述第二载体亚基以非共价相互作用自组装形成纳米结构，所述第一载体亚基包覆于所述第二载体亚基的表面，所述gHgL蛋白展示在纳米结构表面。
优选的，所述gHgL蛋白包含gH蛋白(SEQ ID NO：28)和gL蛋白(SEQ ID NO：29)。
优选的，所述gHgL蛋白还包含链接序列(SEQ ID NO：30)，所述链接序列用于连接gH蛋白和gL 蛋白。
优选的，所述I53-50A1的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示。
优选的，所述I53-50B.4PT1的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示。
优选的，所述第一多肽还包含稳定蛋白。
优选的，所述稳定蛋白位于铰链与gHgL蛋白之间。
优选的，所述稳定蛋白为T4噬菌体纤维蛋白原(T4 fibritin)(SEQ ID NO：32)或GCN4肽段(SEQ ID NO：33)；进一步为T4噬菌体纤维蛋白原。
优选的，所述第一多肽为第一多肽三聚体。
优选的，所述第二多肽为第二多肽五聚体。
优选的，所述第一多肽三聚体的拷贝数为18～22，所述第二多肽五聚体的拷贝数为10～14；进一步优选的，所述第一多肽三聚体的拷贝数为20，所述第二多肽五聚体的拷贝数为12。
优选的，所述含gHgL蛋白的自组装纳米颗粒具有20面体对称性。
本发明的第二个方面，提供一种含gHgL蛋白的自组装纳米颗粒的制备方法，将第一多肽与第二多肽孵育，得到；所述第一多肽包含gHgL蛋白和第一载体亚基，所述第二多肽包含第二载体亚基；所述第一载体亚基为I53-50A1，所述第二载体亚基为I53-50B.4PT1；所述gHgL蛋白与第一载体亚基通过铰链连接，可以使得组装后的纳米颗粒外展示gHgL蛋白，更好地激发机体的免疫反应。
优选的，所述I53-50A1的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示。
优选的，所述I53-50B.4PT1的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示。
优选的，所述第一多肽和第二多肽的摩尔比为1:(3～6)；进一步为1:5。
优选的，所述孵育的条件为在组装缓冲液中孵育0.5～2h。
优选的，所述组装缓冲液的组成为250mM NaCl,50mM Tris-HCl pH8.0,5％甘油(质量分数)。
优选的，所述gHgL蛋白包含gH蛋白(SEQ ID NO：28)和gL蛋白(SEQ ID NO：29)。
优选的，所述gHgL蛋白还包含链接序列(SEQ ID NO：30)，所述链接序列用于连接gH蛋白和gL 蛋白。
优选的，所述铰链包含柔性序列和刚性接头，铰链用于gHgL蛋白与载体蛋白(载体蛋白由第一载体亚基和第二载体亚基组成)的连接，不影响gHgL蛋白的免疫原性以及蛋白的正确折叠。
优选的，所述柔性序列为含5～9个氨基酸的多肽；进一步为SEQ ID NO：12～SEQID NO：16中任一种的多肽；更进一步为如SEQ ID NO：15所示的多肽。
优选的，所述刚性接头的氨基酸序列为EKAAKAEEAA(SEQ ID NO：31)。
优选的，所述第一多肽还包含稳定蛋白。
优选的，所述稳定蛋白位于铰链与gHgL蛋白之间。
所述稳定蛋白优选为T4噬菌体纤维蛋白原(T4 fibritin)(SEQ ID NO：32)或GCN4肽段(SEQ ID NO： 33)；更优选为T4噬菌体纤维蛋白原。
优选的，所述第一多肽和第二多肽还包含纯化标签。
所述纯化标签优选为组氨酸标签(His标签)，链霉亲和素标签(Strep标签)和麦芽糖结合蛋白(MBP) 中的至少一种；更优选为组氨酸标签(His标签)；最优选为氨基酸序列如SEQ ID NO：34或SEQ ID NO： 35所示的组氨酸标签。
优选的，所述第一多肽的纯化标签位于稳定蛋白和铰链之间。
优选的，所述第一多肽还包含连接序列。
优选的，所述连接序列位于稳定蛋白和纯化标签之间。
优选的，所述连接序列如SEQ ID NO：37所示。
优选的，所述第二多肽的纯化标签位于第二载体亚基的末端。
所述第一多肽还含有信号肽，使目的蛋白在表达后能够分泌至上清。
所述信号肽选自CD5信号肽(SEQ ID NO：36)。
所述第一多肽优选通过如下方式获得：将表达第一多肽的核酸引入第一宿主细胞；孵育第一宿主细胞表达第一多肽。
所述第一宿主细胞优选为真核细胞；更优选为人类胚胎肾293细胞(HEK293F)，犬肾细胞(Madin-Daby canine kidney cells,MDCK)，非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)肾细胞(VERO)，SF9(Spodoptera frugiperda 9) 细胞，HighFive细胞、CHO(Chinese HamsterOvary，中国仓鼠卵巢)细胞和酵母细胞中的至少一种；最优选为人类胚胎肾293细胞。
所述第二多肽优选通过如下方式获得：将表达第二多肽的核酸引入第二宿主细胞；孵育第二宿主细胞表达第二多肽。
所述第二宿主细胞优选为原核细胞；更优选为大肠杆菌；最优选为Rosetta(DE3)。
本发明的第三个方面，提供第一方面的自组装纳米颗粒在制备预防EB病毒感染的药品中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种包含第一方面的自组装纳米颗粒的疫苗。
一种疫苗，包含上述含gHgL蛋白的自组装纳米颗粒。
所述疫苗还包括佐剂。
所述佐剂优选为铝佐剂，油乳佐剂如水包油、油包水、双向型乳液，微生物来源类佐剂如肽聚糖(PG)、革兰氏阴性菌外膜脂多糖(Lipopolysccharide,LPS)、分枝杆菌及其组份、GpG寡核苷酸(GpG ODN)、霍乱毒素(Cholera toxin,CT))，微粒抗原递送体系如脂质体、聚合微球体、惰性纳米微球、纳米铝佐剂、免疫刺激复合物(Immunostimulating comples,IS-COM)、细胞因子，多糖类如菊粉(MPI)，天然来源类如蜂胶(propolis)、皂苷(Sapoin)中的至少一种；更优选为MF59佐剂。
本发明的第五方面，提供第一方面的自组装纳米颗粒在制备治疗EB病毒感染所引起的疾病的药品中的应用。
所述疾病优选为传染性疾病、恶性肿瘤、慢性疾病和自身性免疫疾病中的至少一种；更优选为单核细胞增多症、鼻咽癌、胃癌、上皮细胞性肿瘤、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性疲劳综合征、多发性硬化和强直性脊髓炎中的至少一种。
所述药品还包括药学上可接受的载体。
本发明的有益效果是：
本发明提供的自组装纳米颗粒首次将EB病毒的gHgL蛋白展示在纳米颗粒表面，其粒径较抗原(gHgL) 大，具有更好的抗原驻留体积，热稳定与抗原(gHgL)相当，具有更好的抗原驻留体积，同时其展示的 gHgL数量更多能够更强地刺激B细胞，并且能够诱导更高的抗体滴度，可用于预防EB病毒感染及治疗 EB病毒感染所引起的疾病。
本发明提供的自组装纳米颗粒，虽然引入了异源基因，但其由于是来源于细菌的蛋白，避免了引起自身免疫疾病，具有安全性高的优势，且不影响免疫效果。
附图说明
图1是gHgL-I53-50A1、gHgL-I53-50 NP的结构示意图：其中，A为Remodel设计后的输出结构图： gH与I53-50A1的N端-C端间距为31.6A；B为gHgL-I53-50A1三聚体结构拟合图：可观察其并未发现蛋白链的显著冲突；C为gHgL-I53-50 NP纳米颗粒的结构示意图：其是通过输出结构与I53-50A NP(PDB id: 6P6F)进行蛋白结构拟合后的结果。
图2是自组装纳米颗粒的SDS-PAGE电泳的考马斯亮蓝染色图。
图3是gHgL、gHgL-I53-50A1亚单位和gHgL-I53-50 NP自组装纳米颗粒的分子筛色谱图。
图4是gHgL、gHgL-I53-50A1亚单位和gHgL-I53-50 NP自组装纳米颗粒的动态光散射结果图。
图5是gHgL-I53-50 NP自组装纳米颗粒的负染电镜图：其中，A为gHgL-I53-50 NP自组装纳米颗粒在200nm分辨率下的负染电镜图；B为gHgL-I53-50 NP自组装纳米颗粒在100nm分辨率下的负染电镜图。
图6是gHgL、gHgL-I53-50A1亚单位和gHgL-I53-50 NP自组装纳米颗粒的内在荧光扫描结果图。
图7是gHgL、gHgL-I53-50A1亚单位和gHgL-I53-50 NP自组装纳米颗粒与中和抗体AMMO1的生物膜干涉检测图：其中，A为gHgL与中和抗体AMMO1的生物膜干涉检测图；B为gHgL-I53-50A1亚单位与中和抗体AMMO1的生物膜干涉检测图；C为gHgL-I53-50 NP自组装纳米颗粒与中和抗体AMMO1的生物膜干涉检测图。
图8是小鼠免疫后血清gHgL的总抗滴度图：A为免疫后第二周血清gHgL的总抗滴度图，B为免疫后第五周血清gHgL的总抗滴度图；图中，**表示P<0.005。
具体实施方式
以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
本申请的纳米颗粒疫苗制备方法包括以下：
A.通过Rosetta等计算机辅助设计，确定gHgL与三聚体稳定蛋白融合相容性，并根据结果设计表达序列。
B.通过第一宿主细胞，利用瞬时转染技术将真核表达载体转入第一细胞中表达，获得gHgL-I53-50A1 的纳米颗粒亚单位蛋白(第一多肽)，同时利用第二宿主细胞，转化另一个I53-50B.4PT1的表达质粒，在 IPTG诱导后表达获得I53-50B.4PT1这另一纳米颗粒亚单位蛋白(第二多肽)，两种蛋白通过亲和层级以及分子排阻色谱进行进一步纯化后经过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定确定纯度。
C.在组装缓冲液中按一定比例加入gHgL-I53-50A1及I53-50B.4PT1亚单位，在室温下孵育，利用分子排阻色谱分离组装成功的纳米颗粒，并利用负染电镜、动态光散射和差示扫描荧光确定蛋白的粒径分布和稳定性。
D.利用生物膜干涉技术(BLI)确定纳米颗粒的抗原性。
E.将纳米颗粒与佐剂进行混匀，通过Balb/C小鼠进行免疫，验证小鼠产生针对gHgL的抗体水平。
以下进一步具体阐述本申请的纳米颗粒疫苗的。
实施例1铰链(linker)设计
通过Rosetta等计算机软件辅助设计，利用rosetta remodel软件进行结构域插入设计(domain insertion design)，将三聚体稳定化蛋白与gHgL抗原(SEQ ID NO：1)进行结构对接，从而判断其是否需要插入铰链(linker)，最后利用PyMol进行结构可视化进行目测判断，最终选择如下铰链：铰链由柔性序列和刚性接头组成，不同铰链的区别仅在于柔性序列的不同，不同铰链的柔性序列的氨基酸序列和核苷酸序列如表 1所示，刚性接头的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。
设计采用的软件：
https://www.rosettacommons.org/docs/latest/application_documentation/design/rosettaremodel；
Pymol open-source:https://github.com/schrodinger/pymol-open-source。
实施例2重组载体的构建和蛋白表达
1.实验材料
(1)表达载体：真核表达载体：pcDNA3.1(+)(ThermoFisher)，原核表达载体：pET28a(+)(ThermoFisher)，大肠杆菌感受态细胞DH5α(Tiangen)。
(2)表达系统：真核表达系统细胞HEK293F(ATCC)，改造大肠杆菌细胞Rosetta(DE3)(Tiangen)。
(3)试剂与耗材：PCR酶(GeneStar)，重组酶(Vazyme)，限制性核酸内切酶(NEB)，胶回收试剂 (GeneStar)，质粒中提试剂盒(MN)细胞转染试剂PEI(Polyscience),293F培养基(Union)，TB培养基 (翔博生物)，组氨酸标签蛋白纯化琼脂糖珠(Roche)，等其他常规试剂以及耗材均为商品化购买所得。
(4)基因：EB病毒(M81毒株)的gH基因、gL基因以及基于细菌蛋白优化的I53-50A1/I53-50B颗粒亚单位基因均通过南京金斯瑞生物有限公司OptimumGeneTM密码子平台优化和合成。
2.铰链的筛选
我们尝试了不同铰链(linker)，铰链由柔性序列和刚性接头组成，不同铰链的区别仅在于柔性序列的不同，同样构建了表达载体转染表达后，通过最后纯化浓缩测定蛋白浓度，具体步骤如下：(1)通过PCR 扩增、酶切重组方法将EB病毒gH基因(SEQ ID NO：2)、链接序列(SEQ ID NO：3)、gL基因(SEQ ID NO：4)、T4 fibritin(SEQ ID NO：5)、I53-50A1(SEQID NO：6)及铰链(不同铰链的柔性序列的氨基酸序列和核苷酸序列如表1所示，刚性接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示)插入到载体pcDNA3.1(+) 中，而其前端带有CD5信号肽(SEQ ID NO：18)用于使表达的多肽分泌到细胞外，T4 fibritin与铰链之间有8个组氨酸的组氨酸标签(SEQ ID NO：19)方便纯化，组氨酸标签前端接有连接序列(SEQ ID NO： 20)，最终分别得到的表达载体表达的目的基因gHgL-I53-50A1；(2)将重组载体于pcDNA3.1的基因转化至DH5α感受态细菌中，利用氨苄抗性筛选阳性克隆，随后将阳性克隆挑入含0.1％氨苄(0.1mg/mL) 的TB培养基中扩大，随后利用中提试剂盒进行抽提，具体方法见产品说明书；(3)将293F细胞置于293F 培养基(Union)中悬浮培养扩增，待扩大到一定数量后准备进行瞬时转染，稀释细胞至1L密度为1*106/mL，随后用新鲜培养基配置1mg pcDNA3.1-目标蛋白载体5mgPEI的转染体系，静置30min后加入到稀释后的 293F细胞中，在37℃、30％湿度、5％CO2浓度以及120rpm震荡培养7天，随后通过离心去除细胞沉淀，上清用0.22μm滤膜过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度目的蛋白gHgL-I53-50A1亚单位。结果如表1所示：铰链的柔性序列为GGSGGSGS(SEQ ID NO：15)时，gHgL-I53-50A1亚单位产量最高。
表1不同柔性序列的铰链(linker)的载体的蛋白产量
3.自组装纳米颗粒的制备步骤
(1)通过PCR扩增、酶切重组方法将EB病毒gH基因(SEQ ID NO：2)、链接序列(SEQID NO： 3)、gL基因(SEQ ID NO：4)、T4 fibritin(SEQ ID NO：5)、I53-50A1(SEQ ID NO：6)及铰链(铰链的柔性序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，刚性接头的核苷酸序列如SEQID NO：17所示)插入到载体pcDNA3.1(+)中，而其前端带有CD5信号肽(SEQ ID NO：18)用于使表达的多肽分泌到细胞外， T4 fibritin与铰链之间有8个组氨酸的组氨酸标签(SEQ IDNO：19)方便纯化，组氨酸标签前端接有连接序列(SEQ ID NO：20)，最终得到的表达载体表达的目的基因gHgL-I53-50A1(SEQ ID NO：21)。而I53-50B.4PT1(SEQ ID NO:22)则在合成中直接插入到pET28a(+)载体中，并且其尾端带有6个组氨酸的组氨酸标签(SEQ ID NO:23)便于纯化，通过测序比对后选择成功构建的载体进行下一步的实验。
(2)将重组载体于pcDNA3.1的基因转化至DH5α感受态细菌中，利用氨苄抗性筛选阳性克隆，随后将阳性克隆挑入含0.1％氨苄(0.1mg/mL)的TB培养基中扩大，随后利用中提试剂盒进行抽提，具体方法见产品说明书。
(3)将重组载体于pET28a(+)的基因转化至Rosetta(DE3)感受态细菌中，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，随后将阳性克隆挑入含0.1％卡那霉素(0.03g/mL)的TB培养基中扩大，随后利用锥形瓶进一步扩大到1L培养，并加入卡那霉素和氯霉素用于筛选阳性细胞，在18℃加入0.2mM化学诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达，经过20h诱导，收集菌体，高压破碎，离心取上清和0.22μm过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度的带组氨酸标签的目的蛋白I53-50B.4PT1亚单位(SEQ ID NO： 24)。
(4)将293F细胞置于293F培养基(Union)中悬浮培养扩增，待扩大到一定数量后准备进行瞬时转染，稀释细胞至1L密度为1*106/mL，随后用新鲜培养基配置1mg pcDNA3.1-目标蛋白载体5mgPEI的转染体系，静置30min后加入到稀释后的293F细胞中，在37℃、80％湿度、5％CO2浓度以及120rpm震荡培养7天，随后通过离心去除细胞沉淀，上清用0.22μm滤膜过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度的带组氨酸标签的目的蛋白gHgL-I53-50A1亚单位(SEQ ID NO：25)，gHgL-I53-50A1的结构示意图如图1所示。
(5)将两带组氨酸标签的亚单位(gHgL-I53-50A1和I53-50B.4PT1)按1：5的摩尔比例加入到组装缓冲液(250mM NaCl,50mM Tris-HCl pH8.0,5％甘油(质量分数)中，常温孵育1小时后利用分子筛分离组装好的纳米颗粒(gHgL-I53-50 NP)，gHgL-I53-50 NP的结构示意图如图1所示。
4.结果
如图2、3所示，图2为纳米颗粒的SDS-PAGE电泳的考马斯亮蓝染色的结果：从左到右显示了gHgL 抗原蛋白(SEQ ID NO：38，制备方法同第3点中gHgL-I53-50A1亚单位制备过程，区别仅在于：步骤(1) 中载体pcDNA3.1(+)中不包含T4 fibritin(SEQ ID NO：5)、I53-50A1(SEQ ID NO：6)、连接序列(SEQ ID NO：20)及铰链(铰链的柔性序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，刚性接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示))、I53-50B.4PT1亚单位、gHgL-I53-50A1亚单位(制备方法同第3点中I53-50B.4PT1亚单位、gHgL-I53-50A1亚单位制备过程)以及第3点得到的gHgL-I53-50 NP自组装纳米颗粒；图3为纳米颗粒的分子筛色谱图：可以看出，重组载体构建成功，并且能获得高纯度的纳米颗粒蛋白(gHgL-I53-50 NP)；gHgL-I53-50A1比gHgL分子质量要大。
实施例3检测纳米颗粒的结构特征和化学稳定性
1.实验材料
(1)Unchained Uncle高通量蛋白质稳定性分析仪(Unchained Labs)。
(2)120KV透射电镜(FEI)。
2.实验步骤
(1)检测纳米颗粒的粒径分布
首先将实施例2中gHgL自组装纳米颗粒(gHgL-I53-50 NP)、亚单位gHgL-I53-50A1、抗原蛋白(gHgL) 稀释至0.5mg/mL，加入200uL样品至Uncle专用的加样槽中，静置5min后，使用Unchained公司的Uncle 仪器进行纳米颗粒粒径的检测。
(2)检测纳米颗粒的结构特征
稀释实施例2中gHgL自组装纳米颗粒(gHgL-I53-50 NP)浓度为0.1mg/mL，将蛋白孵育在碳涂层铜网格上，然后与2％乙酸铀孵育染色2min，风干。随后利用120KV透射电镜观察颗粒的大小和形态。
(3)检测纳米颗粒的热稳定性
首先将实施例2中gHgL自组装纳米颗粒(gHgL-I53-50 NP)、亚单位gHgL-I53-50A1、抗原(gHgL) 稀释至0.5mg/mL，随后我们使用Unchained公司的Uncle仪器从25℃到90℃进行升温扫描，记录其全波长广谱偏移(BCM)的变化。
3.实验结果
如图4所示，gHgL自组装纳米颗粒(gHgL-I53-50 NP)具有较均一的粒径分布特征，且其粒径显著大于亚单位gHgL-I53-50A1以及抗原(gHgL)，说明了已经组装成为纳米颗粒。
如图5所示，负染电镜下可以看到gHgL-I53-50 NP具有较好的均一性，且gHgL-I53-50 NP的颗粒表面有明显的外部的突起，说明gHgL成功展示在了纳米颗粒载体表面。
如图6所示，图6展示了gHgL、gHgL-I53-50A1、gHgL-I53-50 NP的差示荧光扫描结果，三者随着温度从25℃上升至95℃，其BCM偏移相近，证实了该改造对gHgL本身蛋白的稳定性无显著影响，同时由于gHgL-I53-50 NP具有纳米颗粒的特征，其发生荧光改变的斜率也较gHgL小。
实施例4纳米颗粒的抗原性
1.实验材料
(1)ProteinA传感器(Fortebio)，PBS，Tween 20(Sigma-Aldrich)。
(2)Fortebio Octet 96仪器。
(3)预湿板、96孔板等均来自商品化常规耗材。
2.实验步骤 (1)利用BLI检测纳米颗粒与中和抗体的亲和力
配置0.5％PBST用于动力学检测，使用proteinA传感器前先在预湿板上加入150uLPBST，放入proteinA 传感器孵育10min，随后稀释抗体AMMO1(制备方法参考文献Snijderet al.,2018,Immunity 48,799–811) 用于偶联，平衡后开始进行偶联，随后将纳米颗粒蛋白等抗原(实施例2中的gHgL、gHgL-I53-50A1、gHgL- I53-50 NP)进行梯度稀释(3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM)，与传感器进行结合，记录其结合信号和解离信号，最后利用甘氨酸溶液进行传感器再生。结合信号利用1：1的结合模型进行拟合，以计算其动力学参数。
3.实验结果
如图7和表2所示，gHgL纳米颗粒(gHgL-I53-50 NP)与AMMO1抗体的结合能力与gHgL相比要更强，证明其抗原性强于gHgL，这一特性有助于在BCR(B细胞抗原受体)上长期驻留，刺激抗体的产生。
表2 gHgL、gHgL-I53-50A1和gHgL-I53-50 NP的抗体亲和力动力学参数
KD(M)
gHgL
4.32E-10
gHgL-I53-50A1
2.42E-10
gHgL-I53-50NP
3.39E-11
实施例5纳米颗粒蛋白的动物免疫原性
1.实验材料
(1)小鼠：雌性6～8周的BalB/C小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。
(2)佐剂：MF59佐剂{0.5％(v/v)Tween 80，0.5％(v/v)Span 85，4.3％(v/v)角鲨烯，10nM柠檬酸钠缓冲液}。
(3)其他试剂耗材均为商品化常规试剂耗材。
2.实验步骤
(1)将2ug空载的纳米载体(empty-NP，制备方法同实施例2中第3点，区别仅在于：不含gH基因 (SEQ ID NO：2)、链接序列(SEQ ID NO：3)、gL基因(SEQ ID NO：4)、T4fibritin(SEQ ID NO：5)、)、铰链、连接序列(SEQ ID NO：20))2ug EB病毒gHgL蛋白(实施例2中制备得到的gHgL)、以及含等摩尔质量gHgL的gHgL纳米颗粒(实施例2中的gHgL-I53-50NP)，分别与上述MF59佐剂混合，即将佐剂与抗原按质量比1：1的混合，在4℃摇晃孵育过夜，经皮下免疫的方式免疫小鼠。
(2)在免疫之后的第三周再进行一次免疫，在免疫后第二周以及第六周采集小鼠眼眶血分离收集血清，通过间接酶联免疫吸附试验检测小鼠血清gHgL的总抗滴度。
3.实验结果
如图8所示，在第2周和第6周的血清抗体滴度检测中，gHgL自组装纳米颗粒(gHgL-I53-50 NP) 诱导的血清总抗体滴度相对于单体gHgL来说均要更高，证实了gHgL纳米颗粒能够诱导更强的抗体产生。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究
所)
<120> 一种含EB病毒gHgL蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用
<130>
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 789
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Trp Ala Tyr Pro Cys Cys His Val Thr Gln Leu Arg Ala Gln His Leu
1 5 10 15
Leu Ala Leu Glu Asn Ile Ser Asp Ile Tyr Leu Val Ser Asn Gln Thr
20 25 30
Cys Asp Gly Phe Ser Leu Ala Ser Leu Asn Ser Pro Lys Asn Gly Ser
35 40 45
Asn Gln Leu Val Ile Ser Arg Cys Ala Asn Gly Leu Asn Val Val Ser
50 55 60
Phe Phe Ile Ser Ile Leu Lys Arg Ser Ser Ser Ala Leu Thr Ser His
65 70 75 80
Leu Arg Glu Leu Leu Thr Thr Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Ser Phe Ser
85 90 95
Val Glu Asp Leu Phe Gly Ala Asn Leu Asn Arg Tyr Ala Trp His Arg
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Ser Leu Ser Glu Val Lys Leu His Leu Asp Ile Glu Gly His Ala
130 135 140
Ser His Tyr Thr Ile Pro Trp Thr Glu Leu Met Ala Lys Val Pro Gly
145 150 155 160
Leu Ser Pro Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Asn Val Thr Glu Asp Leu
165 170 175
Ala Ser Met Leu Asn Arg Tyr Lys Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Gly Thr
180 185 190
Leu Gly Ile Ala Leu Ala Glu Pro Val Asp Ile Pro Ala Val Ser Glu
195 200 205
Gly Ser Met Gln Val Asp Ala Ser Lys Val His Pro Gly Val Ile Ser
210 215 220
Gly Leu Asn Ser Pro Ala Cys Met Leu Ser Ala Pro Leu Glu Lys Gln
225 230 235 240
Leu Phe Tyr Tyr Ile Gly Thr Met Leu Pro Asn Thr Arg Pro His Ser
245 250 255
Tyr Val Phe Tyr Gln Leu Arg Cys His Leu Ser Tyr Val Ala Leu Ser
260 265 270
Ile Asn Gly Asp Lys Phe Gln Tyr Thr Gly Ala Met Thr Ser Lys Phe
275 280 285
Leu Met Gly Thr Tyr Lys Arg Val Thr Glu Lys Gly Asp Glu His Val
290 295 300
Leu Ser Leu Ile Phe Gly Lys Thr Lys Asp Leu Pro Asp Leu Arg Gly
305 310 315 320
Pro Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Thr Ser Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser
325 330 335
Leu Val Ile Val Thr Thr Phe Val His Tyr Ala Asn Phe His Asn Tyr
340 345 350
Phe Val Pro Asn Leu Lys Asp Met Phe Ser Arg Ala Val Thr Met Thr
355 360 365
Ala Ala Ser Tyr Ala Arg Tyr Val Leu Gln Lys Leu Val Leu Leu Glu
370 375 380
Met Lys Gly Gly Cys Arg Glu Pro Glu Leu Asp Thr Glu Thr Leu Thr
385 390 395 400
Thr Met Phe Glu Val Ser Val Ala Phe Phe Lys Val Gly His Ala Val
405 410 415
Gly Glu Thr Gly Asn Gly Cys Val Asp Leu Arg Trp Leu Ala Lys Ser
420 425 430
Phe Phe Glu Leu Thr Val Leu Lys Asp Ile Ile Gly Ile Cys Tyr Gly
435 440 445
Ala Thr Val Lys Gly Met Gln Ser Tyr Gly Leu Glu Arg Leu Ala Ala
450 455 460
Met Leu Met Ala Thr Val Lys Met Glu Glu Leu Gly His Leu Thr Thr
465 470 475 480
Glu Lys Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Ala Thr Val Gly Tyr Pro Lys
485 490 495
Ala Gly Val Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu
500 505 510
Ser Ala Tyr Asn Arg His Pro Leu Phe Gln Pro Leu His Thr Val Met
515 520 525
Arg Glu Thr Leu Phe Ile Gly Ser His Val Val Leu Arg Glu Leu Arg
530 535 540
Leu Asn Val Thr Thr Gln Gly Pro Asn Leu Ala Leu Tyr Gln Leu Leu
545 550 555 560
Ser Thr Ala Leu Cys Ser Ala Leu Glu Ile Gly Glu Val Leu Arg Gly
565 570 575
Leu Ala Leu Gly Thr Glu Ser Gly Leu Phe Ser Pro Cys Tyr Leu Ser
580 585 590
Leu Arg Phe Asp Leu Thr Arg Asp Lys Leu Leu Ser Met Ala Pro Gln
595 600 605
Glu Ala Met Leu Asp Gln Ala Ala Val Ser Asn Ala Val Asp Gly Phe
610 615 620
Leu Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Glu Asp Arg Asp Ala Trp His Leu
625 630 635 640
Pro Ala Tyr Lys Cys Val Asp Arg Leu Asp Lys Val Leu Met Ile Ile
645 650 655
Pro Leu Ile Asn Val Thr Phe Ile Ile Ser Ser Asp Arg Glu Val Arg
660 665 670
Gly Ser Ala Leu Tyr Glu Ala Ser Thr Thr Tyr Leu Ser Ser Ser Leu
675 680 685
Phe Leu Ser Pro Val Ile Met Asn Lys Cys Ser Gln Gly Ala Val Ala
690 695 700
Gly Glu Pro Arg Gln Ile Pro Lys Ile Gln Asn Phe Thr Arg Thr Gln
705 710 715 720
Lys Ser Cys Ile Phe Cys Gly Phe Ala Leu Leu Ser Tyr Asp Glu Lys
725 730 735
Glu Gly Leu Glu Thr Thr Thr Tyr Ile Thr Ser Gln Glu Val Gln Asn
740 745 750
Ser Ile Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Asp Phe Asp Asn Leu His Val His
755 760 765
Tyr Leu Leu Leu Thr Thr Asn Gly Thr Val Met Glu Ile Ala Gly Leu
770 775 780
Tyr Glu Glu Arg Ala
785
<210> 2
<211> 342
<212> DNA
<213> Epstein-Barr Virus
<400> 2
tgggcatatc catgctgtca cgtgacccag ctgagggcac agcacctgct ggccctggag 60
aatatctctg acatctacct ggtgagcaac cagacatgcg atggcttctc tctggccagc 120
ctgaacagcc ccaagaacgg ctccaatcag ctggtcatct ctcgctgtgc caacggcctg 180
aatgtggtgt ctttctttat cagcatcctg aagcggagct cctctgccct gacctcccac 240
ctgagagagc tgctgaccac actggagtct ctgtacggca gcttttccgt ggaggacctg 300
ttcggcgcca acctgaatcg gtatgcctgg cacagaggag ga 342
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggaggaggag gatctggagg aggaggcagc ggcggcggcg gcagc 45
<210> 4
<211> 1980
<212> DNA
<213> Epstein-Barr Virus
<400> 4
tccctgagcg aggtgaagct gcacctggac atcgagggcc acgcctccca ctacacaatc 60
ccctggaccg agctgatggc caaggtgcca ggactgtccc cagaggccct gtggcgggag 120
gccaatgtga ccgaggatct ggcctctatg ctgaacagat acaagctgat ctataagaca 180
agcggcaccc tgggaatcgc cctggcagag cctgtggaca tcccagccgt gtctgagggc 240
agcatgcagg tggatgcctc caaggtgcac cctggcgtga tctccggcct gaactctcct 300
gcctgcatgc tgtctgcccc actggagaag cagctgtttt actatatcgg cacaatgctg 360
cccaatacca ggcctcacag ctacgtgttc tatcagctgc gctgtcacct gtcctacgtg 420
gccctgtcta tcaacggcga caagtttcag tatacaggcg ccatgaccag caagttcctg 480
atgggcacat acaagcgggt gaccgagaag ggcgatgagc acgtgctgtc cctgatcttt 540
ggcaagacaa aggacctgcc cgatctgaga ggcccattct cctacccctc tctgaccagc 600
gcccagtccg gcgactattc cctggtcatc gtgaccacat ttgtgcacta cgccaacttt 660
cacaattatt tcgtgcccaa tctgaaggat atgttcagca gggccgtgac aatgaccgca 720
gcatcctacg caagatatgt gctgcagaag ctggtgctgc tggagatgaa gggcggctgt 780
cgggagcctg agctggatac agagaccctg accacaatgt ttgaggtgag cgtggccttc 840
tttaaagtgg gacacgcagt gggagagaca ggaaacggct gcgtggacct gagatggctg 900
gccaagtctt tctttgagct gacagtgctg aaggatatca tcggcatctg ttacggcgcc 960
accgtgaagg gcatgcagag ctatggcctg gagaggctgg ccgccatgct gatggccacc 1020
gtgaagatgg aggagctggg ccacctgacc acagagaagc aggagtacgc actgaggctg 1080
gcaacagtgg gataccctaa ggcaggcgtg tattccggac tgatcggagg agccaccagc 1140
gtgctgctgt ccgcctataa tcggcaccct ctgtttcagc cactgcacac agtgatgaga 1200
gagaccctgt tcatcggaag ccacgtggtg ctgagggagc tgcgcctgaa tgtgaccaca 1260
cagggcccaa acctggccct gtaccagctg ctgagcaccg ccctgtgctc cgccctggag 1320
atcggagagg tgctgagggg actggccctg ggcacagagt ctggcctgtt tagcccatgt 1380
tatctgtccc tgaggttcga cctgactcgc gataagctgc tgtctatggc accacaggag 1440
gcaatgctgg accaggcagc cgtgagcaat gccgtggatg gcttcctggg caggctgtcc 1500
ctggagaggg aggacagaga tgcctggcac ctgcccgcct acaagtgcgt ggaccgcctg 1560
gataaggtgc tgatgatcat ccctctgatc aacgtgacct ttatcatctc tagcgacagg 1620
gaggtgcgcg gaagcgccct gtacgaggcc tccaccacat atctgtcctc tagcctgttc 1680
ctgtcccccg tgatcatgaa taagtgttct cagggagcag tggcaggaga gccaaggcag 1740
atccctaaga tccagaactt tacaagaacc cagaagtctt gcatcttttg tggcttcgcc 1800
ctgctgagct acgatgagaa ggagggcctg gagaccacaa cctatatcac atctcaggag 1860
gtgcagaaca gcatcctgtc ctctaattac ttcgactttg ataacctgca cgtgcactat 1920
ctgctgctga caaccaacgg caccgtgatg gagatcgccg gcctgtacga ggagagggca 1980
<210> 5
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggatacatcc cagaggcacc aagggacgga caggcctatg tgcgcaagga tggcgagtgg 60
gtgctgctgt ctaccttcct g 81
<210> 6
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgaagatgg aggagctgtt taagaagcac aagatcgtgg ccgtgctgag ggccaactcc 60
gtggaggagg ccatcgagaa ggcagtggcc gtgttcgcag gaggagtgca cctgatcgag 120
atcaccttta cagtgcctga cgccgataca gtgatcaagg ccctgagcgt gctgaaggag 180
aagggagcaa tcatcggagc aggaaccgtg acatccgtgg agcagtgcag gaaggcagtg 240
gagtccggag ccgagttcat cgtgtctccc cacctggacg aggagatctc tcagttctgt 300
aaggagaagg gcgtgtttta catgcctggc gtgatgaccc caacagagct ggtgaaggcc 360
atgaagctgg gccacgatat cctgaagctg ttcccaggag aggtggtggg acctcagttt 420
gtgaaggcca tgaagggccc cttccctaat gtgaagtttg tgccaaccgg cggcgtgaac 480
ctggacaacg tgtgcgagtg gttcaaggca ggcgtgctgg cagtgggagt gggcgatgcc 540
ctggtgaagg gcgaccccga tgaggtgagg gagaaggcca agaagtttgt ggagaagatc 600
cgcggctgta cagagggctc cctggag 627
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggaggaagcg gaagc 15
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggaggaagcg gaggctct 18
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggaggaagcg gaggctctgg a 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggaggaagcg gaggctctgg aagc 24
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggaggaagcg gaggctctgg aggctct 27
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Gly Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 17
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggaggaagcg gaggctctgg aagcgagaag gcagcaaagg cagaggaggc agcc 54
<210> 18
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
atgccaatgg gctctctgca gcccctggcc acactgtacc tgctgggaat gctggtggca 60
agctgcctgg ga 72
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
catcatcacc accaccacca ccac 24
<210> 20
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggaagcggat cc 12
<210> 21
<211> 3237
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
atgccaatgg gctctctgca gcccctggcc acactgtacc tgctgggaat gctggtggca 60
agctgcctgg gatgggcata tccatgctgt cacgtgaccc agctgagggc acagcacctg 120
ctggccctgg agaatatctc tgacatctac ctggtgagca accagacatg cgatggcttc 180
tctctggcca gcctgaacag ccccaagaac ggctccaatc agctggtcat ctctcgctgt 240
gccaacggcc tgaatgtggt gtctttcttt atcagcatcc tgaagcggag ctcctctgcc 300
ctgacctccc acctgagaga gctgctgacc acactggagt ctctgtacgg cagcttttcc 360
gtggaggacc tgttcggcgc caacctgaat cggtatgcct ggcacagagg aggaggagga 420
ggaggatctg gaggaggagg cagcggcggc ggcggcagct ccctgagcga ggtgaagctg 480
cacctggaca tcgagggcca cgcctcccac tacacaatcc cctggaccga gctgatggcc 540
aaggtgccag gactgtcccc agaggccctg tggcgggagg ccaatgtgac cgaggatctg 600
gcctctatgc tgaacagata caagctgatc tataagacaa gcggcaccct gggaatcgcc 660
ctggcagagc ctgtggacat cccagccgtg tctgagggca gcatgcaggt ggatgcctcc 720
aaggtgcacc ctggcgtgat ctccggcctg aactctcctg cctgcatgct gtctgcccca 780
ctggagaagc agctgtttta ctatatcggc acaatgctgc ccaataccag gcctcacagc 840
tacgtgttct atcagctgcg ctgtcacctg tcctacgtgg ccctgtctat caacggcgac 900
aagtttcagt atacaggcgc catgaccagc aagttcctga tgggcacata caagcgggtg 960
accgagaagg gcgatgagca cgtgctgtcc ctgatctttg gcaagacaaa ggacctgccc 1020
gatctgagag gcccattctc ctacccctct ctgaccagcg cccagtccgg cgactattcc 1080
ctggtcatcg tgaccacatt tgtgcactac gccaactttc acaattattt cgtgcccaat 1140
ctgaaggata tgttcagcag ggccgtgaca atgaccgcag catcctacgc aagatatgtg 1200
ctgcagaagc tggtgctgct ggagatgaag ggcggctgtc gggagcctga gctggataca 1260
gagaccctga ccacaatgtt tgaggtgagc gtggccttct ttaaagtggg acacgcagtg 1320
ggagagacag gaaacggctg cgtggacctg agatggctgg ccaagtcttt ctttgagctg 1380
acagtgctga aggatatcat cggcatctgt tacggcgcca ccgtgaaggg catgcagagc 1440
tatggcctgg agaggctggc cgccatgctg atggccaccg tgaagatgga ggagctgggc 1500
cacctgacca cagagaagca ggagtacgca ctgaggctgg caacagtggg ataccctaag 1560
gcaggcgtgt attccggact gatcggagga gccaccagcg tgctgctgtc cgcctataat 1620
cggcaccctc tgtttcagcc actgcacaca gtgatgagag agaccctgtt catcggaagc 1680
cacgtggtgc tgagggagct gcgcctgaat gtgaccacac agggcccaaa cctggccctg 1740
taccagctgc tgagcaccgc cctgtgctcc gccctggaga tcggagaggt gctgagggga 1800
ctggccctgg gcacagagtc tggcctgttt agcccatgtt atctgtccct gaggttcgac 1860
ctgactcgcg ataagctgct gtctatggca ccacaggagg caatgctgga ccaggcagcc 1920
gtgagcaatg ccgtggatgg cttcctgggc aggctgtccc tggagaggga ggacagagat 1980
gcctggcacc tgcccgccta caagtgcgtg gaccgcctgg ataaggtgct gatgatcatc 2040
cctctgatca acgtgacctt tatcatctct agcgacaggg aggtgcgcgg aagcgccctg 2100
tacgaggcct ccaccacata tctgtcctct agcctgttcc tgtcccccgt gatcatgaat 2160
aagtgttctc agggagcagt ggcaggagag ccaaggcaga tccctaagat ccagaacttt 2220
acaagaaccc agaagtcttg catcttttgt ggcttcgccc tgctgagcta cgatgagaag 2280
gagggcctgg agaccacaac ctatatcaca tctcaggagg tgcagaacag catcctgtcc 2340
tctaattact tcgactttga taacctgcac gtgcactatc tgctgctgac aaccaacggc 2400
accgtgatgg agatcgccgg cctgtacgag gagagggcag gatacatccc agaggcacca 2460
agggacggac aggcctatgt gcgcaaggat ggcgagtggg tgctgctgtc taccttcctg 2520
ggaagcggat cccatcatca ccaccaccac caccacggag gaagcggagg ctctggaagc 2580
gagaaggcag caaaggcaga ggaggcagcc atgaagatgg aggagctgtt taagaagcac 2640
aagatcgtgg ccgtgctgag ggccaactcc gtggaggagg ccatcgagaa ggcagtggcc 2700
gtgttcgcag gaggagtgca cctgatcgag atcaccttta cagtgcctga cgccgataca 2760
gtgatcaagg ccctgagcgt gctgaaggag aagggagcaa tcatcggagc aggaaccgtg 2820
acatccgtgg agcagtgcag gaaggcagtg gagtccggag ccgagttcat cgtgtctccc 2880
cacctggacg aggagatctc tcagttctgt aaggagaagg gcgtgtttta catgcctggc 2940
gtgatgaccc caacagagct ggtgaaggcc atgaagctgg gccacgatat cctgaagctg 3000
ttcccaggag aggtggtggg acctcagttt gtgaaggcca tgaagggccc cttccctaat 3060
gtgaagtttg tgccaaccgg cggcgtgaac ctggacaacg tgtgcgagtg gttcaaggca 3120
ggcgtgctgg cagtgggagt gggcgatgcc ctggtgaagg gcgaccccga tgaggtgagg 3180
gagaaggcca agaagtttgt ggagaagatc cgcggctgta cagagggctc cctggag 3237
<210> 22
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
atgaaccagc acagccacaa ggaccacgag accgtgcgta ttgcggtggt tcgtgcgcgt 60
tggcatgcgg agattgtgga tgcgtgcgtt agcgcgttcg aagcggcgat gcgtgacatc 120
ggtggcgatc gtttcgcggt ggacgttttt gatgtgccgg gtgcgtacga gattccgctg 180
catgcgcgta ccctggcgga aaccggtcgt tatggcgcgg ttctgggcac cgcgttcgtg 240
gttaacggtg gcatctaccg tcacgaattt gtggcgagcg cggttattaa cggtatgatg 300
aacgtgcaac tgaacaccgg cgtgccggtt ctgagcgcgg ttctgacccc gcacaactat 360
gacaagagca aagcgcacac cctgctgttc ctggcgctgt ttgcggtgaa gggtatggaa 420
gcggcgcgtg cgtgcgttga gatcctggcg gcgcgtgaaa aaattgcggc gggcagcctg 480
gaa 483
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
catcatcacc accaccac 18
<210> 24
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val
1 5 10 15
Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala
20 25 30
Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp
35 40 45
Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr
50 55 60
Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val
65 70 75 80
Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile
85 90 95
Asn Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asn Thr Gly Val Pro Val Leu Ser
100 105 110
Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu
115 120 125
Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala Gly Ser Leu
145 150 155 160
Glu His His His His His His
165
<210> 25
<211> 1055
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Trp Ala Tyr Pro Cys Cys His Val Thr Gln Leu Arg Ala Gln His Leu
1 5 10 15
Leu Ala Leu Glu Asn Ile Ser Asp Ile Tyr Leu Val Ser Asn Gln Thr
20 25 30
Cys Asp Gly Phe Ser Leu Ala Ser Leu Asn Ser Pro Lys Asn Gly Ser
35 40 45
Asn Gln Leu Val Ile Ser Arg Cys Ala Asn Gly Leu Asn Val Val Ser
50 55 60
Phe Phe Ile Ser Ile Leu Lys Arg Ser Ser Ser Ala Leu Thr Ser His
65 70 75 80
Leu Arg Glu Leu Leu Thr Thr Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Ser Phe Ser
85 90 95
Val Glu Asp Leu Phe Gly Ala Asn Leu Asn Arg Tyr Ala Trp His Arg
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Ser Leu Ser Glu Val Lys Leu His Leu Asp Ile Glu Gly His Ala
130 135 140
Ser His Tyr Thr Ile Pro Trp Thr Glu Leu Met Ala Lys Val Pro Gly
145 150 155 160
Leu Ser Pro Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Asn Val Thr Glu Asp Leu
165 170 175
Ala Ser Met Leu Asn Arg Tyr Lys Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Gly Thr
180 185 190
Leu Gly Ile Ala Leu Ala Glu Pro Val Asp Ile Pro Ala Val Ser Glu
195 200 205
Gly Ser Met Gln Val Asp Ala Ser Lys Val His Pro Gly Val Ile Ser
210 215 220
Gly Leu Asn Ser Pro Ala Cys Met Leu Ser Ala Pro Leu Glu Lys Gln
225 230 235 240
Leu Phe Tyr Tyr Ile Gly Thr Met Leu Pro Asn Thr Arg Pro His Ser
245 250 255
Tyr Val Phe Tyr Gln Leu Arg Cys His Leu Ser Tyr Val Ala Leu Ser
260 265 270
Ile Asn Gly Asp Lys Phe Gln Tyr Thr Gly Ala Met Thr Ser Lys Phe
275 280 285
Leu Met Gly Thr Tyr Lys Arg Val Thr Glu Lys Gly Asp Glu His Val
290 295 300
Leu Ser Leu Ile Phe Gly Lys Thr Lys Asp Leu Pro Asp Leu Arg Gly
305 310 315 320
Pro Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Thr Ser Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser
325 330 335
Leu Val Ile Val Thr Thr Phe Val His Tyr Ala Asn Phe His Asn Tyr
340 345 350
Phe Val Pro Asn Leu Lys Asp Met Phe Ser Arg Ala Val Thr Met Thr
355 360 365
Ala Ala Ser Tyr Ala Arg Tyr Val Leu Gln Lys Leu Val Leu Leu Glu
370 375 380
Met Lys Gly Gly Cys Arg Glu Pro Glu Leu Asp Thr Glu Thr Leu Thr
385 390 395 400
Thr Met Phe Glu Val Ser Val Ala Phe Phe Lys Val Gly His Ala Val
405 410 415
Gly Glu Thr Gly Asn Gly Cys Val Asp Leu Arg Trp Leu Ala Lys Ser
420 425 430
Phe Phe Glu Leu Thr Val Leu Lys Asp Ile Ile Gly Ile Cys Tyr Gly
435 440 445
Ala Thr Val Lys Gly Met Gln Ser Tyr Gly Leu Glu Arg Leu Ala Ala
450 455 460
Met Leu Met Ala Thr Val Lys Met Glu Glu Leu Gly His Leu Thr Thr
465 470 475 480
Glu Lys Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Ala Thr Val Gly Tyr Pro Lys
485 490 495
Ala Gly Val Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu
500 505 510
Ser Ala Tyr Asn Arg His Pro Leu Phe Gln Pro Leu His Thr Val Met
515 520 525
Arg Glu Thr Leu Phe Ile Gly Ser His Val Val Leu Arg Glu Leu Arg
530 535 540
Leu Asn Val Thr Thr Gln Gly Pro Asn Leu Ala Leu Tyr Gln Leu Leu
545 550 555 560
Ser Thr Ala Leu Cys Ser Ala Leu Glu Ile Gly Glu Val Leu Arg Gly
565 570 575
Leu Ala Leu Gly Thr Glu Ser Gly Leu Phe Ser Pro Cys Tyr Leu Ser
580 585 590
Leu Arg Phe Asp Leu Thr Arg Asp Lys Leu Leu Ser Met Ala Pro Gln
595 600 605
Glu Ala Met Leu Asp Gln Ala Ala Val Ser Asn Ala Val Asp Gly Phe
610 615 620
Leu Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Glu Asp Arg Asp Ala Trp His Leu
625 630 635 640
Pro Ala Tyr Lys Cys Val Asp Arg Leu Asp Lys Val Leu Met Ile Ile
645 650 655
Pro Leu Ile Asn Val Thr Phe Ile Ile Ser Ser Asp Arg Glu Val Arg
660 665 670
Gly Ser Ala Leu Tyr Glu Ala Ser Thr Thr Tyr Leu Ser Ser Ser Leu
675 680 685
Phe Leu Ser Pro Val Ile Met Asn Lys Cys Ser Gln Gly Ala Val Ala
690 695 700
Gly Glu Pro Arg Gln Ile Pro Lys Ile Gln Asn Phe Thr Arg Thr Gln
705 710 715 720
Lys Ser Cys Ile Phe Cys Gly Phe Ala Leu Leu Ser Tyr Asp Glu Lys
725 730 735
Glu Gly Leu Glu Thr Thr Thr Tyr Ile Thr Ser Gln Glu Val Gln Asn
740 745 750
Ser Ile Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Asp Phe Asp Asn Leu His Val His
755 760 765
Tyr Leu Leu Leu Thr Thr Asn Gly Thr Val Met Glu Ile Ala Gly Leu
770 775 780
Tyr Glu Glu Arg Ala Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln
785 790 795 800
Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
805 810 815
Gly Ser Gly Ser His His His His His His His His Gly Gly Ser Gly
820 825 830
Gly Ser Gly Ser Glu Lys Ala Ala Lys Ala Glu Glu Ala Ala Met Lys
835 840 845
Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala
850 855 860
Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly
865 870 875 880
Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr
885 890 895
Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly
900 905 910
Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val Glu Ser
915 920 925
Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln
930 935 940
Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro
945 950 955 960
Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu Lys Leu
965 970 975
Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly
980 985 990
Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp
995 1000 1005
Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Val
1010 1015 1020
Gly Asp Ala Leu Val Lys Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys
1025 1030 1035
Ala Lys Lys Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu Gly Ser
1040 1045 1050
Leu Glu
1055
<210> 26
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu
1 5 10 15
Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe
20 25 30
Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala
35 40 45
Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile
50 55 60
Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val
65 70 75 80
Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile
85 90 95
Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met
100 105 110
Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu
115 120 125
Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met
130 135 140
Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn
145 150 155 160
Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly
165 170 175
Val Gly Asp Ala Leu Val Lys Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys
180 185 190
Ala Lys Lys Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu Gly Ser Leu
195 200 205
Glu
<210> 27
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val
1 5 10 15
Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala
20 25 30
Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp
35 40 45
Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr
50 55 60
Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val
65 70 75 80
Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala Gly Ser Leu
145 150 155 160
Glu
<210> 28
<211> 114
<212> PRT
<213> Epstein-Barr Virus
<400> 28
Trp Ala Tyr Pro Cys Cys His Val Thr Gln Leu Arg Ala Gln His Leu
1 5 10 15
Leu Ala Leu Glu Asn Ile Ser Asp Ile Tyr Leu Val Ser Asn Gln Thr
20 25 30
Cys Asp Gly Phe Ser Leu Ala Ser Leu Asn Ser Pro Lys Asn Gly Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Arg Glu Leu Leu Thr Thr Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Ser Phe Ser
85 90 95
Val Glu Asp Leu Phe Gly Ala Asn Leu Asn Arg Tyr Ala Trp His Arg
100 105 110
Gly Gly
<210> 29
<211> 660
<212> PRT
<213> Epstein-Barr Virus
<400> 29
Ser Leu Ser Glu Val Lys Leu His Leu Asp Ile Glu Gly His Ala Ser
1 5 10 15
His Tyr Thr Ile Pro Trp Thr Glu Leu Met Ala Lys Val Pro Gly Leu
20 25 30
Ser Pro Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Asn Val Thr Glu Asp Leu Ala
35 40 45
Ser Met Leu Asn Arg Tyr Lys Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Gly Thr Leu
50 55 60
Gly Ile Ala Leu Ala Glu Pro Val Asp Ile Pro Ala Val Ser Glu Gly
65 70 75 80
Ser Met Gln Val Asp Ala Ser Lys Val His Pro Gly Val Ile Ser Gly
85 90 95
Leu Asn Ser Pro Ala Cys Met Leu Ser Ala Pro Leu Glu Lys Gln Leu
100 105 110
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115 120 125
Val Phe Tyr Gln Leu Arg Cys His Leu Ser Tyr Val Ala Leu Ser Ile
130 135 140
Asn Gly Asp Lys Phe Gln Tyr Thr Gly Ala Met Thr Ser Lys Phe Leu
145 150 155 160
Met Gly Thr Tyr Lys Arg Val Thr Glu Lys Gly Asp Glu His Val Leu
165 170 175
Ser Leu Ile Phe Gly Lys Thr Lys Asp Leu Pro Asp Leu Arg Gly Pro
180 185 190
Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Thr Ser Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser Leu
195 200 205
Val Ile Val Thr Thr Phe Val His Tyr Ala Asn Phe His Asn Tyr Phe
210 215 220
Val Pro Asn Leu Lys Asp Met Phe Ser Arg Ala Val Thr Met Thr Ala
225 230 235 240
Ala Ser Tyr Ala Arg Tyr Val Leu Gln Lys Leu Val Leu Leu Glu Met
245 250 255
Lys Gly Gly Cys Arg Glu Pro Glu Leu Asp Thr Glu Thr Leu Thr Thr
260 265 270
Met Phe Glu Val Ser Val Ala Phe Phe Lys Val Gly His Ala Val Gly
275 280 285
Glu Thr Gly Asn Gly Cys Val Asp Leu Arg Trp Leu Ala Lys Ser Phe
290 295 300
Phe Glu Leu Thr Val Leu Lys Asp Ile Ile Gly Ile Cys Tyr Gly Ala
305 310 315 320
Thr Val Lys Gly Met Gln Ser Tyr Gly Leu Glu Arg Leu Ala Ala Met
325 330 335
Leu Met Ala Thr Val Lys Met Glu Glu Leu Gly His Leu Thr Thr Glu
340 345 350
Lys Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Ala Thr Val Gly Tyr Pro Lys Ala
355 360 365
Gly Val Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu Ser
370 375 380
Ala Tyr Asn Arg His Pro Leu Phe Gln Pro Leu His Thr Val Met Arg
385 390 395 400
Glu Thr Leu Phe Ile Gly Ser His Val Val Leu Arg Glu Leu Arg Leu
405 410 415
Asn Val Thr Thr Gln Gly Pro Asn Leu Ala Leu Tyr Gln Leu Leu Ser
420 425 430
Thr Ala Leu Cys Ser Ala Leu Glu Ile Gly Glu Val Leu Arg Gly Leu
435 440 445
Ala Leu Gly Thr Glu Ser Gly Leu Phe Ser Pro Cys Tyr Leu Ser Leu
450 455 460
Arg Phe Asp Leu Thr Arg Asp Lys Leu Leu Ser Met Ala Pro Gln Glu
465 470 475 480
Ala Met Leu Asp Gln Ala Ala Val Ser Asn Ala Val Asp Gly Phe Leu
485 490 495
Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Glu Asp Arg Asp Ala Trp His Leu Pro
500 505 510
Ala Tyr Lys Cys Val Asp Arg Leu Asp Lys Val Leu Met Ile Ile Pro
515 520 525
Leu Ile Asn Val Thr Phe Ile Ile Ser Ser Asp Arg Glu Val Arg Gly
530 535 540
Ser Ala Leu Tyr Glu Ala Ser Thr Thr Tyr Leu Ser Ser Ser Leu Phe
545 550 555 560
Leu Ser Pro Val Ile Met Asn Lys Cys Ser Gln Gly Ala Val Ala Gly
565 570 575
Glu Pro Arg Gln Ile Pro Lys Ile Gln Asn Phe Thr Arg Thr Gln Lys
580 585 590
Ser Cys Ile Phe Cys Gly Phe Ala Leu Leu Ser Tyr Asp Glu Lys Glu
595 600 605
Gly Leu Glu Thr Thr Thr Tyr Ile Thr Ser Gln Glu Val Gln Asn Ser
610 615 620
Ile Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Asp Phe Asp Asn Leu His Val His Tyr
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Leu Leu Leu Thr Thr Asn Gly Thr Val Met Glu Ile Ala Gly Leu Tyr
645 650 655
Glu Glu Arg Ala
660
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 31
Glu Lys Ala Ala Lys Ala Glu Glu Ala Ala
1 5 10
<210> 32
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 32
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
1 5 10 15
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
20 25
<210> 33
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 33
Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr
1 5 10 15
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20 25 30
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 34
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1 5
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 35
His His His His His His
1 5
<210> 36
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 36
Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly
1 5 10 15
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20
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 37
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 38
<211> 797
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 38
Trp Ala Tyr Pro Cys Cys His Val Thr Gln Leu Arg Ala Gln His Leu
1 5 10 15
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65 70 75 80
Leu Arg Glu Leu Leu Thr Thr Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Ser Phe Ser
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Ser Leu Ser Glu Val Lys Leu His Leu Asp Ile Glu Gly His Ala
130 135 140
Ser His Tyr Thr Ile Pro Trp Thr Glu Leu Met Ala Lys Val Pro Gly
145 150 155 160
Leu Ser Pro Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Asn Val Thr Glu Asp Leu
165 170 175
Ala Ser Met Leu Asn Arg Tyr Lys Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Gly Thr
180 185 190
Leu Gly Ile Ala Leu Ala Glu Pro Val Asp Ile Pro Ala Val Ser Glu
195 200 205
Gly Ser Met Gln Val Asp Ala Ser Lys Val His Pro Gly Val Ile Ser
210 215 220
Gly Leu Asn Ser Pro Ala Cys Met Leu Ser Ala Pro Leu Glu Lys Gln
225 230 235 240
Leu Phe Tyr Tyr Ile Gly Thr Met Leu Pro Asn Thr Arg Pro His Ser
245 250 255
Tyr Val Phe Tyr Gln Leu Arg Cys His Leu Ser Tyr Val Ala Leu Ser
260 265 270
Ile Asn Gly Asp Lys Phe Gln Tyr Thr Gly Ala Met Thr Ser Lys Phe
275 280 285
Leu Met Gly Thr Tyr Lys Arg Val Thr Glu Lys Gly Asp Glu His Val
290 295 300
Leu Ser Leu Ile Phe Gly Lys Thr Lys Asp Leu Pro Asp Leu Arg Gly
305 310 315 320
Pro Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Thr Ser Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser
325 330 335
Leu Val Ile Val Thr Thr Phe Val His Tyr Ala Asn Phe His Asn Tyr
340 345 350
Phe Val Pro Asn Leu Lys Asp Met Phe Ser Arg Ala Val Thr Met Thr
355 360 365
Ala Ala Ser Tyr Ala Arg Tyr Val Leu Gln Lys Leu Val Leu Leu Glu
370 375 380
Met Lys Gly Gly Cys Arg Glu Pro Glu Leu Asp Thr Glu Thr Leu Thr
385 390 395 400
Thr Met Phe Glu Val Ser Val Ala Phe Phe Lys Val Gly His Ala Val
405 410 415
Gly Glu Thr Gly Asn Gly Cys Val Asp Leu Arg Trp Leu Ala Lys Ser
420 425 430
Phe Phe Glu Leu Thr Val Leu Lys Asp Ile Ile Gly Ile Cys Tyr Gly
435 440 445
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485 490 495
Ala Gly Val Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu
500 505 510
Ser Ala Tyr Asn Arg His Pro Leu Phe Gln Pro Leu His Thr Val Met
515 520 525
Arg Glu Thr Leu Phe Ile Gly Ser His Val Val Leu Arg Glu Leu Arg
530 535 540
Leu Asn Val Thr Thr Gln Gly Pro Asn Leu Ala Leu Tyr Gln Leu Leu
545 550 555 560
Ser Thr Ala Leu Cys Ser Ala Leu Glu Ile Gly Glu Val Leu Arg Gly
565 570 575
Leu Ala Leu Gly Thr Glu Ser Gly Leu Phe Ser Pro Cys Tyr Leu Ser
580 585 590
Leu Arg Phe Asp Leu Thr Arg Asp Lys Leu Leu Ser Met Ala Pro Gln
595 600 605
Glu Ala Met Leu Asp Gln Ala Ala Val Ser Asn Ala Val Asp Gly Phe
610 615 620
Leu Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Glu Asp Arg Asp Ala Trp His Leu
625 630 635 640
Pro Ala Tyr Lys Cys Val Asp Arg Leu Asp Lys Val Leu Met Ile Ile
645 650 655
Pro Leu Ile Asn Val Thr Phe Ile Ile Ser Ser Asp Arg Glu Val Arg
660 665 670
Gly Ser Ala Leu Tyr Glu Ala Ser Thr Thr Tyr Leu Ser Ser Ser Leu
675 680 685
Phe Leu Ser Pro Val Ile Met Asn Lys Cys Ser Gln Gly Ala Val Ala
690 695 700
Gly Glu Pro Arg Gln Ile Pro Lys Ile Gln Asn Phe Thr Arg Thr Gln
705 710 715 720
Lys Ser Cys Ile Phe Cys Gly Phe Ala Leu Leu Ser Tyr Asp Glu Lys
725 730 735
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740 745 750
Ser Ile Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Asp Phe Asp Asn Leu His Val His
755 760 765
Tyr Leu Leu Leu Thr Thr Asn Gly Thr Val Met Glu Ile Ala Gly Leu
770 775 780
Tyr Glu Glu Arg Ala His His His His His His His His
785 790 795
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