具体实施方式

本发明提供了EB病毒BALF3蛋白的抗原表位，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中所述“抗原表位”(epitope)又称抗原决定簇或抗原决定基，是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。本发明的抗原表位是一段包含191个氨基酸残基的多肽片段，因此，在本发明中，所述抗原表位、表位、多肽交替使用。

本发明中，所述“核酸分子”是指有多个核苷酸聚合形成的生物大分子化合物，所述核苷酸可为核糖核酸或脱氧核糖核酸以及它们的修饰物，包括双链或单链的DNA、cDNA、RNA、mRNA等，其可为环状也可为线性，也可为环状载体中的一部分或基因组中的一个片段。

本发明中，所述“核酸载体”是指重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列。对原核细胞中的表达必需的核酸序列包括启动子，任选包括操纵基因序列，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知原核细胞利用启动子，增强子以及终止和多腺苷酸化信号。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。

本发明中，“宿主细胞”一般为含有核酸载体和/或感兴趣基因的原核或真核宿主。用使用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这样的转化宿主细胞有能力复制编码蛋白质的载体或表达期望蛋白质。

本发明中，所述治疗性抗体是指能够通过中和作用、示踪或导向作用、竞争性抑制作用/拮抗作用、抗体依赖性细胞街道的细胞毒效应及补体依赖性细胞溶解作用、通过内影像作用模拟抗原等机制发挥治疗作用的抗体。

本发明中，所述免疫学检测是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对定性、定量或定位研究细胞内抗原(多肽和蛋白质)，或抗体的技术，这样的技术包括但不限于酶联免疫分析法、免疫荧光、放射免疫分析法、免疫印迹、免疫组化、免疫共沉淀、染色质共沉淀等。

本发明中，所述固相支持物是指本文所述的抗原表位、特异性抗体和/或抗原蛋白能够附着至其上的任何支持物，包括但不限于硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、iPDMS芯片、微孔板、微粒、微载体、凝胶等。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

一、本发明通过对31例EBV感染的肿瘤组织进行全基因组测序，检测其中EBV病毒片段。从NCBI库中120余株病毒中选取一株作为参考核酸序列，通过序列比对，确定病毒保守序列(核酸序列如SEQ ID NO：4所示，蛋白序列如SEQ ID NO：3所示)，

2、比较不同EB病毒株之间BALF3基因碱基序列及氨基酸序列的保守性(图1)，结果表明，在Human gamma herpesvirus 4中，分析基因的特异性不同病毒株BALF3序列与上述参考序列间相似性高达99％，考虑到病毒基因组具有较高的可变性，本申请基于相对保守的全外显子序列，筛选BALF3抗原区段。以该区段序列为基础设计制备的抗体具有较可靠的检测效力，可避免因感染病毒株亚型不同引起的假阴性结果。

3、比较临床样本中EB病毒株序列与上述参考序列间的保守性(图2)：NK/T细胞淋巴瘤发病与EB病毒感染密切相关。通过对31例EB病毒阳性的NK/T细胞淋巴瘤患者的WGS数据进行分析检测其中EB病毒序列，提取BALF3的序列信息，标识单个核苷酸变异位点及氨基酸变异位点，与B95-8参考序列进行比对，标识变化氨基酸。

二、蛋白可表达性分析

(1)跨膜结构分析：无跨膜结构

(2)翻译后修饰：暂无

(3)保守结构域(图2)

(4)二级结构预测(图3)

三、蛋白抗原性分析

(1)抗原表位预测(图4)

(2)抗原区域选择

-510-700aa(SEQ ID NO：1)：该区段不含突变氨基酸位点，免疫原性较好二级结构稳定易于表达，构到pGEX4T-AB1载体，采用大肠杆菌原核系统表达蛋白制备抗原。

四、抗体合成和功效验证

(1)抗原表达质粒制备

BALF3(510-700aa)PCR产物电泳鉴定大小正确(图5)，成功克隆到pGEX-4T-AB1载体上，并测序鉴定正确。

(2)抗原蛋白表达

重组质粒转化入表达菌株E.coli Rosetta，表达诱导条件：培养到OD600nm 0.5-0.6加入0.8mM IPTG 37℃诱导4小时

结果鉴定(图6)：

1.pGEX-4T-AB1-BALF3(510-700aa)表达在包涵体中。

2.包涵体纯化后蛋白浓度为0.6mg/mL，纯度达到免疫要求。

(3)兔免疫

流程如表1：

表1免疫流程

(4)抗血清ELISA检查，设置不添加抗体或血清的空白对照组，以及添加抗体但不添加血清的阴性对照，以及添加血清以及不同浓度抗体的实验组。实验采用上述构建获得的两株抗体，分别记为BALF3-E11787、BALF3-E11788，检测结果如图7。结果表明，两株抗体皆表现出良好效价。

(5)抗血清纯化

-亲和纯化用pGEX-4T-AB1-BALF3蛋白经检测，浓度为0.5mg/ml，与破菌纯化后浓度和纯度差异不大，可进行抗原亲和纯化。

-抗血清用pGEX-4T-AB1-BALF3蛋白作抗原亲和纯化后，得到浓缩后的抗体：E11797浓度为2.65mg/ml、E11798浓度为2.78mg/ml

(6)抗原western blot检测

利用纯化后的抗体对抗原进行检测，结果如图8，结果表明：

①、E11797、E11798抗体检测抗原条带大小在49KD左右；

②、E11797、E11798抗体1∶1000稀释可检测到500pg抗原；

③、E11797、E11798抗体浓度正常。

如上结果表明，本发明设计获得的抗原表位能够特异性的检测BALF3蛋白，且抗体具有良好的效价。

(7)特异性验证

以上述抗体对于人类细胞株裂解蛋白样本进行检测，检测结果为阴性(图9)，如图所示，BALF3理论大小为74,764Da，红色方框中所示应为目的蛋白的印记。B95-8为可分泌EBV的细胞株，可检测到内源性表达BALF3(阳性对照)，SNK6无EBV成分细胞株未检测到BALF3(阴性对照)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院

<120> EB病毒BALF3蛋白的抗原表位

<130> MP1914455

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 191

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Pro Glu Val Pro Arg Pro Ala Gly Ala Arg Glu Pro Gly Pro Ser Gly

1 5 10 15

Ala Leu Ser Asp Ala Leu Lys Arg Lys Glu Gln Tyr Leu Arg Gln Val

20 25 30

Ala Thr Glu Gly Leu Ala Lys Leu Gln Ser Cys Leu Ala Gln Gln Ser

35 40 45

Glu Thr Leu Thr Glu Thr Leu Cys Leu Arg Val Trp Gly Asp Val Val

50 55 60

Tyr Trp Glu Leu Ala Arg Met Arg Asn His Phe Leu Tyr Arg Arg Ala

65 70 75 80

Phe Val Ser Gly Pro Trp Glu Asp Arg Arg Ala Gly Glu Gly Ala Ala

85 90 95

Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Ile Lys Thr His Leu Phe Thr Gln Thr Leu

100 105 110

Ser Ser Glu His Leu His Ala Leu Thr His Ser Leu Tyr Thr Phe Ile

115 120 125

Thr Gly Pro Leu Ala Glu Glu Ser Gly Leu Phe Pro Pro Pro Ser Asn

130 135 140

Val Ala Leu Ala Arg Cys Cys Asp Ala Ala Gly Thr Leu Pro His Gln

145 150 155 160

Lys Ala Phe Leu Thr Ser Leu Ile Trp Pro Gly Ile Glu Pro Ser Asp

165 170 175

Trp Ile Glu Thr Ser Phe Asn Ser Phe Tyr Ser Val Pro Gly Gly

180 185 190

<210> 2

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccggaggtgc cccggccggc tggggcacga gagcccggcc cgtccggcgc cctctcggac 60

gcgctcaagc gcaaggagca gtacctgcgc caggtggcca ccgagggtct ggccaagctg 120

cagtcctgcc tggcgcaaca gagcgagacc ctgaccgaga ccctgtgcct gcgcgtctgg 180

ggggacgtgg tctactggga gctggcccgc atgcgcaacc acttcctcta cagacgggcc 240

ttcgtctcgg gtccctggga ggacaggcgc gccggcgagg gtgccgcctt tgagaattcc 300

aagtacatca aaacacacct gtttacccag accctgagct cggagcacct gcacgcgctg 360

acgcacagcc tgtacacctt catcacgggg cccctggcgg aggagagcgg gctctttccc 420

ccacccagca acgtggccct ggctcgctgc tgtgacgccg caggtacgct gccccaccag 480

aaggcattcc tgacttccct gatatggcca ggcatcgagc cgagcgactg gatagagacc 540

tccttcaaca gcttctacag cgtacccggg ggc 573

<210> 3

<211> 789

<212> PRT

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<400> 3

Gly Arg Arg Gly Val Leu Ile Gly Pro Leu Leu Arg Pro Gly Gly Gln

1 5 10 15

Arg Pro Arg Asn Pro Gly Asp His Cys Leu Gln Arg Asp Arg Val Asp

20 25 30

Gly Gly Gly Arg Ser Gly Leu Ser Gly Gly Ser Val Gly Trp Ala Arg

35 40 45

Gly Ser Pro Gly Gln Leu Tyr Gln Arg Gly Arg Ala Gly Gln His Arg

50 55 60

Val Ala Gly Leu Gly Arg Ala Ala Ala Gly Trp Arg Arg Ala Gly Leu

65 70 75 80

Arg Gly Gln Thr Gln Ala Pro Ser Gly His Arg Ser Pro Arg Thr Arg

85 90 95

Gly Leu Glu Thr Pro Gly Ala Ala Met Ser Gly Leu Leu Ala Ala Ala

100 105 110

Tyr Ser Gln Val Tyr Ala Leu Ala Val Glu Leu Ser Val Cys Thr Arg

115 120 125

Leu Asp Pro Arg Ser Leu Asp Val Ala Ala Val Val Arg Asn Ala Gly

130 135 140

Leu Leu Ala Glu Leu Glu Ala Ile Leu Leu Pro Arg Leu Arg Arg Gln

145 150 155 160

Asn Asp Arg Ala Cys Ser Ala Leu Ser Leu Glu Leu Val His Leu Leu

165 170 175

Glu Asn Ser Arg Glu Ala Ser Ala Ala Leu Leu Ala Pro Gly Arg Lys

180 185 190

Gly Thr Arg Val Pro Pro Leu Arg Thr Pro Ser Val Ala Tyr Ser Val

195 200 205

Glu Phe Tyr Gly Gly His Lys Val Asp Val Ser Leu Cys Leu Ile Asn

210 215 220

Asp Ile Glu Ile Leu Met Lys Arg Ile Asn Ser Val Phe Tyr Cys Met

225 230 235 240

Ser His Thr Met Gly Leu Glu Ser Leu Glu Arg Ala Leu Asp Leu Leu

245 250 255

Gly Arg Phe Arg Gly Val Ser Pro Ile Pro Asp Pro Arg Leu Tyr Ile

260 265 270

Thr Ser Val Pro Cys Trp Arg Cys Val Gly Glu Leu Met Val Leu Pro

275 280 285

Asn His Gly Asn Pro Ser Thr Ala Glu Gly Thr His Val Ser Cys Asn

290 295 300

His Leu Ala Val Pro Val Asn Pro Glu Pro Val Ser Gly Leu Phe Glu

305 310 315 320

Asn Glu Val Arg Gln Ala Gly Leu Gly His Leu Leu Glu Ala Glu Glu

325 330 335

Lys Ala Arg Pro Gly Gly Pro Glu Glu Gly Ala Val Pro Gly Pro Gly

340 345 350

Arg Pro Glu Ala Glu Gly Ala Thr Arg Ala Leu Asp Thr Tyr Asn Val

355 360 365

Phe Ser Thr Val Pro Pro Glu Val Ala Glu Leu Ser Glu Leu Leu Tyr

370 375 380

Trp Asn Ser Gly Gly His Ala Ile Gly Ala Thr Gly Gln Gly Glu Gly

385 390 395 400

Gly Gly His Ser Arg Leu Ser Ala Leu Phe Ala Arg Glu Arg Arg Leu

405 410 415

Ala Leu Val Arg Gly Ala Cys Glu Glu Ala Leu Ala Gly Ala Arg Leu

420 425 430

Thr His Leu Phe Asp Ala Val Ala Pro Gly Ala Thr Glu Arg Leu Phe

435 440 445

Cys Gly Gly Val Tyr Ser Ser Ser Gly Asp Ala Val Glu Ala Leu Lys

450 455 460

Ala Asp Cys Ala Ala Ala Phe Thr Ala His Pro Gln Tyr Arg Ala Ile

465 470 475 480

Leu Gln Lys Arg Asn Glu Leu Tyr Thr Arg Leu Asn Arg Ala Met Gln

485 490 495

Arg Leu Gly Arg Gly Glu Glu Glu Ala Ser Arg Glu Ser Pro Glu Val

500 505 510

Pro Arg Pro Ala Gly Ala Arg Glu Pro Gly Pro Ser Gly Ala Leu Ser

515 520 525

Asp Ala Leu Lys Arg Lys Glu Gln Tyr Leu Arg Gln Val Ala Thr Glu

530 535 540

Gly Leu Ala Lys Leu Gln Ser Cys Leu Ala Gln Gln Ser Glu Thr Leu

545 550 555 560

Thr Glu Thr Leu Cys Leu Arg Val Trp Gly Asp Val Val Tyr Trp Glu

565 570 575

Leu Ala Arg Met Arg Asn His Phe Leu Tyr Arg Arg Ala Phe Val Ser

580 585 590

Gly Pro Trp Glu Asp Arg Arg Ala Gly Glu Gly Ala Ala Phe Glu Asn

595 600 605

Ser Lys Tyr Ile Lys Thr His Leu Phe Thr Gln Thr Leu Ser Ser Glu

610 615 620

His Leu His Ala Leu Thr His Ser Leu Tyr Thr Phe Ile Thr Gly Pro

625 630 635 640

Leu Ala Glu Glu Ser Gly Leu Phe Pro Pro Pro Ser Asn Val Ala Leu

645 650 655

Ala Arg Cys Cys Asp Ala Ala Gly Thr Leu Pro His Gln Lys Ala Phe

660 665 670

Leu Thr Ser Leu Ile Trp Pro Gly Ile Glu Pro Ser Asp Trp Ile Glu

675 680 685

Thr Ser Phe Asn Ser Phe Tyr Ser Val Pro Gly Gly Ser Leu Ala Ser

690 695 700

Ser Gln Gln Ile Leu Cys Arg Ala Leu Arg Glu Ala Val Leu Thr Val

705 710 715 720

Ser Leu Tyr Asn Lys Thr Trp Gly Arg Ser Leu Ile Leu Arg Arg Ala

725 730 735

Asp Ala Val Ser Pro Gly Gln Ala Leu Pro Pro Asp Gly Leu Tyr Leu

740 745 750

Thr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Leu Ile Leu Leu Tyr Lys Gly Arg Gly

755 760 765

Trp Val Phe Lys Asp Leu Tyr Ala Leu Leu Tyr Leu His Leu Gln Met

770 775 780

Arg Asp Asp Ser Ala

785

<210> 4

<211> 2367

<212> DNA

<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)

<400> 4

ggacgacgcg gagtacttat tgggccgctt ctccgtcctg gcggacagcg tcctagaaac 60

cctggcgacc attgcctcca gcgggataga gtggacggcg gaggccgctc gggactttct 120

ggagggagtg tggggtgggc ccggggcagc ccaggacaac tttatcagcg tggccgagcc 180

ggtcagcacc gcgtcgcagg cctcggccgg gctgctgctg ggtggaggag ggcagggctc 240

cgggggcaga cgcaagcgcc gtctggccac cgttctcccc ggactcgagg tctagagacc 300

cctggggcgg cgatgtcggg gctgctggcg gcggcgtaca gccaggtgta cgccctggcg 360

gttgagctga gcgtgtgcac ccggctggac ccccggagtc tggacgtggc tgcggtggtg 420

cgcaacgccg gcctgctggc cgagctggag gccatcctcc ttccccgttt gagacggcag 480

aatgaccgtg catgcagcgc cctgtccctg gagctggtgc acctgctaga gaactcgaga 540

gaggcctctg ccgcgctgct cgcccctggt agaaagggta cccgggtccc gcctctccgt 600

accccctcag tcgcgtactc tgtggagttt tacggggggc ataaagtcga tgtaagtttg 660

tgcctaataa atgacataga gattttaatg aagagaatca atagcgtgtt ttattgcatg 720

tctcacacca tggggctgga gagcctggaa cgggccctgg atctgctggg ccgctttcgg 780

ggcgtaagtc ccatcccaga cccgcgcctc tacatcacct ctgtgccctg ctggcgctgt 840

gtgggcgagc tgatggttct gcccaaccac ggcaaccctt ccacggcaga ggggacccac 900

gtctcctgta accacctggc ggtgccggtg aatccggagc cggtctcggg actgtttgag 960

aatgaagtcc gccaggcggg gctcgggcac ctgttggagg ctgaggagaa ggcgaggccg 1020

ggcggcccag aggagggcgc ggtcccgggc ccggggcggc cggaggcaga gggggcgacc 1080

agagcgctgg acacctacaa cgtcttctcg acagtgcccc cggaggtggc ggagctctcg 1140

gagctcctct attggaactc tggcggccat gctatcggtg caacggggca gggggagggt 1200

ggcggccatt cccgcctctc tgccctgttt gcccgggagc gtcgcctggc cctggtgcgg 1260

ggggcctgcg aggaggcgct ggcgggggca aggctgactc acctgtttga cgccgtggct 1320

cccggggcca cggagcggct cttctgcggc ggggtctaca gctcctcggg cgacgcggtg 1380

gaggcgctga aggcggactg cgccgccgcc ttcacggcgc acccccagta ccgggccatc 1440

ctgcaaaaga ggaacgagct gtacacgcgg ctcaaccgag ccatgcagcg gttgggccga 1500

ggcgaggagg aggcgtcccg ggagagcccg gaggtgcccc ggccggctgg ggcacgagag 1560

cccggcccgt ccggcgccct ctcggacgcg ctcaagcgca aggagcagta cctgcgccag 1620

gtggccaccg agggtctggc caagctgcag tcctgcctgg cgcaacagag cgagaccctg 1680

accgagaccc tgtgcctgcg cgtctggggg gacgtggtct actgggagct ggcccgcatg 1740

cgcaaccact tcctctacag acgggccttc gtctcgggtc cctgggagga caggcgcgcc 1800

ggcgagggtg ccgcctttga gaattccaag tacatcaaaa cacacctgtt tacccagacc 1860

ctgagctcgg agcacctgca cgcgctgacg cacagcctgt acaccttcat cacggggccc 1920

ctggcggagg agagcgggct ctttccccca cccagcaacg tggccctggc tcgctgctgt 1980

gacgccgcag gtacgctgcc ccaccagaag gcattcctga cttccctgat atggccaggc 2040

atcgagccga gcgactggat agagacctcc ttcaacagct tctacagcgt acccgggggc 2100

tcactggcat ctagccagca aattctgtgc cgggcgctgc gcgaggccgt cctaaccgtg 2160

tccctctaca acaagacctg ggggcggtcc ttgatcctgc gccgggcgga cgcggtcagc 2220

cccggccagg ccctgccccc ggatgggctt tacctcacgt acgactctga ccgcccccta 2280

attcttctgt ataagggcag ggggtgggta tttaaggatc tatatgccct tctctacctg 2340

cacctccaaa tgagagatga ctcggcg 2367