阅读说明：本技术 一种线粒体dna的富集方法 (Enrichment method of mitochondrial DNA ) 是由 林芹 龙欢 袁方 陶晔 曾亮 林爱婷 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于分子生物学技术领域,特别涉及一种线粒体DNA的富集方法。本发明的方法基于动物细胞中的线粒体DNA与细胞核DNA甲基化位点存在的差异,利用带有蛋白A修饰的磁珠,通过MBD2-Fc蛋白媒介,将动物基因组DNA中的细胞核DNA和线粒体DNA进行分离,并进一步实现对线粒体DNA的富集。利用本发明的方法,在测序前进行线粒体DNA的富集,然后对富集后的线粒体DNA进行测序,可有效提高测序数据中线粒体DNA序列的比例,显著提高测序的准确度、降低测序成本。(The invention belongs to the technical field of molecular biology, and particularly relates to a mitochondrial DNA enrichment method. The method of the invention separates the nuclear DNA and the mitochondrial DNA in the animal genome DNA by using the protein A modified magnetic beads through the MBD2-Fc protein medium based on the difference of the methylation sites of the mitochondrial DNA and the nuclear DNA in the animal cells, and further realizes the enrichment of the mitochondrial DNA. By utilizing the method, the enrichment of mitochondrial DNA is carried out before sequencing, and then the sequencing is carried out on the enriched mitochondrial DNA, so that the proportion of mitochondrial DNA sequences in sequencing data can be effectively improved, the sequencing accuracy is obviously improved, and the sequencing cost is reduced.)

一种线粒体DNA的富集方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种线粒体DNA的富集方法。

背景技术

线粒体广泛分布于动物细胞内，越来越多的研究将线粒体与疾病的发生进行关联。然而，线粒体疾病在发病原因和病症上具有很大的差异，传统的单基因检测诊断疾病的方法有很大的局限性。由于细胞核和线粒体DNA上存在大量的突变，同时对细胞核和线粒体DNA序列进行检测分析在线粒体疾病的诊断上具有非常大的优势。

此外，对动物线粒体基因组的测序被应用于遗传、系统发育和进化学研究中。线粒体基因组DNA具有以下特征：基因组非常小，进化速度快，结构简单，母系遗传，包含的信息量大。因此线粒体基因组中的某些位点很可能成为区分生物原始系统进化关系的重要标志。近年来，二代测序技术结合生物信息注释已成为获得动物线粒体基因组序列最普遍的方式，但我们能直接从NCBI(National Center for Biotechnology Information)上获得线粒体基因组序列的物种并不多，很多物种的线粒体基因组还有待研究。传统的通过细胞全基因组测序或外显子测序来获得线粒体DNA序列的方法对测序深度要求非常高，并且获得的线粒体DNA的信息较少，准确性较低。

现有的对线粒体DNA的提取方法主要有密度梯度离心法和提取总DNA扩增线粒体DNA序列的方法。然而，通过密度梯度离心法来提取线粒体DNA，操作繁琐，耗时长，提取必须快速，否则会影响线粒体酶的活性，需要超速低温离心机。而使用Chelex-100方法提取总DNA扩增线粒体DNA序列，对测序深度要求非常高，并且获得的线粒体DNA的信息较少，准确性较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种线粒体DNA的富集方法，以实现更高效率地针对动物的线粒体DNA进行测序或其他分子生物学研究。

为解决上述技术问题，本发明所提供的线粒体DNA的富集方法，包括：(1)提取动物基因组DNA；(2)使蛋白A修饰的磁珠与MBD2-Fc蛋白结合，得到处理后的磁珠；(3)将所述动物基因组DNA加入所述处理后的磁珠中，混匀，对混合物进行室温下孵育；(4)对孵育后的混合物离心，于磁力架上静置，细胞核DNA通过与磁珠上的MBD2-Fc蛋白结合而附着到磁珠上，线粒体DNA保留在上清液中，取上清液；(5)使用磁珠对所述上清液中的线粒体DNA进行回收。

与现有技术相比，本发明至少具有如下的有益效果：

本发明的申请人提出，动物细胞中线粒体DNA与细胞核DNA甲基化位点存在差异：动物细胞核DNA的CpG上存在很多甲基化位点，而线粒体DNA上的甲基化位点非常少。而MBD2-Fc蛋白由两部分组成：MBD2蛋白可以特异地跟甲基化的CpG结合，Fc是人类IgG上的Fc片段，它可与磁珠上的蛋白A结合。申请人利用带有蛋白A修饰的磁珠，通过MBD2-Fc蛋白媒介，将动物基因组DNA中的细胞核DNA和线粒体DNA分离，并进一步实现对线粒体DNA的富集。

利用本发明的方法，在测序前进行线粒体DNA的富集，然后对富集后的线粒体DNA进行测序，可有效提高测序数据中线粒体DNA序列的比例，显著提高测序的准确度、降低测序成本。

优选地，步骤(1)中，在提取动物基因组DNA时，保证所述动物基因组DNA的完整性，并且完全去除动物蛋白，以免影响后续蛋白相互结合的实验。

优选地，步骤(1)中，提取动物基因组DNA可使用试剂盒或其他动物基因组DNA的提取方法，例如可以选用的提取方法为：对待提取样本使用蛋白酶K处理，然后用酚氯仿或酒精提取。

优选地，步骤(1)中，还包括对提取的动物基因组DNA进行质量检测的步骤和/或对提取的动物基因组DNA进行纯化的步骤。

进一步优选地，所述对提取的动物基因组DNA进行质量检测的步骤包括浓度检测、有无降解检测、杂质检测中的一种或多种。具体来说，对提取的动物基因组DNA的质量检测中，一般使用Qubit、1％的琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop分别对它的浓度、完整性、纯度进行检测。对提取的动物基因组DNA进行浓度测定应保证总量不少于1μg。如有检测结果显示提取的动物基因组DNA中含有杂质，则需对提取的基因组DNA进行纯化。

优选地，步骤(2)中，所述蛋白A为从A型金黄色葡萄球菌分离得到的一种细胞壁蛋白。蛋白A修饰的磁珠是磁珠上结合有蛋白A，蛋白A是从A型金黄色葡萄球菌分离而得到的一种细胞壁蛋白，可以与人类大多数类型的IGg的Fc段结合。

优选地，步骤(2)中，使蛋白A修饰的磁珠与MBD2-Fc蛋白结合的方法为：取蛋白A修饰的磁珠与MBD2-Fc蛋白混合，室温中孵育10～15分钟。

优选地，步骤(2)中还包括除去未结合的MBD2-Fc蛋白的步骤。

优选地，步骤(3)中，加入到所述处理后的磁珠中的动物基因组DNA的总量不超过1μg，如加入的动物基因组DNA总量过多，会影响细胞核DNA的去除效率。

优选地，步骤(3)中，所述室温下孵育的时间为15～20分钟。

另外，根据本发明的方法分离得到的动物细胞核DNA也可以用蛋白酶K将其洗脱下来，用于其他实验。

附图说明

图1为本发明

具体实施方式

的PCR扩增对比实验中的Marker的电泳图；

图2为本发明具体实施方式的PCR扩增对比实验中样品1、2的电泳图；

图3为本发明具体实施方式的PCR扩增对比实验中样品3、4的电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清晰明了，下面结合具体实施例对发明进一步详细说明。这些描述只是示例性的，并非限制本发明的范围。以下说明中，省略了对已知结构和技术的描述。

1.线粒体DNA富集实验

本实施例是对线粒体DNA进行富集的具体步骤的一个举例，其中所使用的所有蛋白和试剂都应放在冰上；其中所使用的试剂都可以通过商购获得，例如蛋白A修饰的磁珠、MBD2-Fc蛋白、5×Binding Buffer是购于NEW ENGLAND BIOLABS，用于DNA回收的磁珠Agencourt AMPure XP购于Beckman。

(1)取适量新鲜的猪的组织进行基因组DNA的提取，为了获得高质量的DNA，本实施例中采用试剂盒(天根：血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒)提取；

(2)对提取的猪基因组DNA进行质量检测，用Qubit的方法检测它的浓度，总量应大于1μg，用Nanodrop检测它的纯度，它的ODA260/OD280约为1.8～2.0，OD260/OD230约为0.4～0.5，通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测它的片段是否完整；

(3)取160μl蛋白A修饰的磁珠(4℃保存)与16μl MBD2-Fc蛋白混合于1.5ml的离心管中，用枪头轻轻吹打混匀，放于旋转混匀仪上室温孵育10分钟，让磁珠上的蛋白A与MBD2-Fc蛋白上的Fc片段结合；

(4)将步骤(3)的所得的磁珠稍微离心后放于磁力架上静置5分钟，直到磁珠完全吸附到磁力架上；

(5)去除磁珠中的上清，加入1ml 1×Binding Buffer(提前放于冰上解冻)，用枪头混匀重放于磁力架上静置5分钟后去上清；

(6)重复步骤(5)，并用160μl的1×Binding Buffer重悬磁珠；

(7)将1μg步骤(2)获得的猪基因组DNA加入到步骤(6)获得的处理后的磁珠中，并根据所加样品的体积通过加5×Binding Buffer将混合液中的Binding Buffer调整为1×，混匀，室温孵育15分钟，期间用旋转混匀仪轻轻颠倒混匀；

(8)将孵育后的样品和磁珠混合物稍离心后放于磁力架上静置5分钟后取出上清到新的离心管中，猪的线粒体DNA即在上清中；

(9)用1.8的磁珠对上清中的猪的线粒体DNA进行磁珠回收，并溶解于50μl的水中用于后续二代测序建库或其他分子生物学研究。

2.PCR扩增对比实验

取等量的富集前和富集后的线粒体DNA，将两者在相同条件下进行PCR，并对实验结果进行对比分析。

(1)PCR的引物设计如下表1所示：

表1引物设计

(2)PCR扩增程序如下：

采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20μl反应体系：

5×FastPfu Buffer.....................4μl

2.5mM dNTPs.........................2μl

Forward Primer(5μM)..........0.8μl

Reverse Primer(5μM).........0.8μl

FastPfu Polymerase..............0.4μl

Template DNA......................10ng

补ddH₂O至.........................20μl

PCR仪：ABI

9700型

PCR反应参数：

a.1×(95℃5分钟)

b.25/28x(95℃30秒；55℃30秒；72℃45秒)

c.72℃10分钟，10℃至无穷

(3)PCR扩增结果鉴定

下表2显示了对4个样品按照上述方法进行PCR扩增鉴定的分组。

表2 PCR扩增分组

胶图编号	样品名称	m(℃)	cycles
				样品1	富集前	55	25
样品2	富集后	55	25
				样品3	富集前	55	28
样品4	富集后	55	28

图1为PCR扩增对比实验中的Marker的电泳图；图2为PCR扩增对比实验中样品1、2的电泳图；图3为PCR扩增对比实验中样品3、4的电泳图。

从以上实验结果可以看出，富集后的线粒体DNA进行PCR扩增所需循环数较少，条带亮度较明显，扩增效率较高。因此，对富集后的线粒体DNA测序可大大提高线粒体DNA序列的比例，提高测序准确度，从而可以更高效率地针对动物线粒体DNA进行测序和其他分子生物学研究。

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。