阅读说明：本技术 治疗新生性疾病的方法 (Methods of treating neogenetic diseases ) 是由 朱正仑 于 2018-03-28 设计创作，主要内容包括：治疗癌症的方法,所述方法包括：提供经修饰的巨噬细胞或单核细胞,其含有编码Hom-1多肽或其含有Hom-1同源框域的片段的外源核酸序列,其中所述经修饰的巨噬细胞或单核细胞表达Hom-1多肽或其片段；并且对患有癌症的受试者施用所述经修饰的巨噬细胞或单核细胞。(A method of treating cancer, the method comprising: providing a modified macrophage or monocyte comprising an exogenous nucleic acid sequence encoding a Hom-1 polypeptide or a Hom-1 homeobox domain-containing fragment thereof, wherein the modified macrophage or monocyte expresses a Hom-1 polypeptide or fragment thereof; and administering the modified macrophage or monocyte to a subject having cancer.)

具体实施方式

应当解释为仅仅是示例性的，而不以任何方式限制本公开的剩余部分。无需进一步阐述，相信本领域的技术人员可以基于本文的描述来最大程度地利用本公开内容。本文引用的所有出版物均通过引用整体并入本文。

实施例

我们鉴定出人同源框蛋白Hom-1在人巨噬细胞的功能性极化中的作用。我们发现了Hom-1促进人巨噬细胞的M1激活，并且是人巨噬细胞的M1激活所需要的，但不是参与M2激活的关键基因的表达所必需的。

使用从癌症中分离出的原代TAM，我们发现了与从正常对照组织中分离出的巨噬细胞相比，TAM中的Hom-1表达显著降低。我们显示了TAM中HAM-1的表达概况与TAM表型相关。此外，Hom-1的异位表达将TAM转化为M1样表型。体外和体内数据均显示了Hom-1赋予TAM以杀肿瘤性活性。我们的研究共同证明了Hom-1将TAM转化为杀肿瘤性细胞。我们显示了表达Hom-1的TAM(表现出M1表型)对多种癌症的生长均施加强烈的抑制效果，表明Hom-1调节的TAM作为治疗癌症的新形式的作用。

Hom-1表达在TAM中是降低的

在晚期肿瘤中，TAM显示出促肿瘤M2样表型。参见Bronte and Murray(2015),NatMed 21,117-119。TAM的可塑性已经得到充分理解，并且多种细胞因子与TAM向M2表型的极化有关。参见Noy and Pollard(2014),Immunity 41,49-61。相比之下，控制TAM极化的转录机制在很大程度上仍然未知。

如下所述，使用从结肠癌切除中丢弃的手术标本从肿瘤组织中分离TAM并从距肿瘤部位15cm的正常粘膜中分离巨噬细胞。如前所述，FACS分析显示了与从正常对照粘膜分离的巨噬细胞相比，TAM表达显著更高水平的与M2表型相关的细胞表面标志物(例如CD68、CD163、CD206)。参见Zhang et al.(2013),Eur J Cancer 49,3320-3334。我们发现了在TAM和对照巨噬细胞中非区别性巨噬细胞标志物CD33的表达没有显著差异。

为了测定Hom-1是否可以在TAM中发挥作用，我们通过qRT-PCR定量了TAM中Hom-1的表达，并且发现与其在对照巨噬细胞中的表达相比，Hom-1的表达在TAM中显著降低。

VentX调节TAM可塑性并使TAM向M1表型极化

先前的研究指示LPS可以诱导TAM以显示出M1表型。参见Zhang等。为了测定Hom-1是否在TAM可塑性中发挥作用，我们检查了暴露于LPS的TAM中Hom-1的表达。我们发现Hom-1表达在用LPS刺激后的TAM中显著升高。与升高的Hom-1表达平行并与先前的发现一致，TAM的LPS刺激导致炎性细胞因子和细胞毒性iNO的分泌增加。

为了测定Hom-1是否在TAM可塑性中发挥调节作用，我们检查了Hom-1敲低对TAM表型的影响。用抗Hom-1吗啉代(MO)处理TAM导致Hom-1表达降低约80％。与Hom-1作为TAM可塑性的关键调节剂的作用一致，我们发现Hom-1MO中止了TAM中LPS诱导的炎性细胞因子和细胞毒性iNO的分泌。CD206是甘露糖受体和M2细胞表面标志物，其在TAM中高度表达。反映TAM的可塑性，将TAM暴露于LPS导致CD68+CD206+群体的显著减少和CD68+CD206-细胞数量增加。Hom-1MO消除了LPS对TAM的这两种效果(p<0.01)。

Hom-1表达水平与TAM表型之间的关联促使我们进一步探索Hom-1控制TAM可塑性的想法。将TAM分离并用编码GPF-Hom-1或对照GFP的质粒转染。与经对照GFP转染的TAM相比，用GFP-Hom-1转染的TAM显示出特征M1形态，具有细长的/成纤维细胞样的细胞形状。FACS分析显示了在用GFP-Hom-1转染的TAM中，M1标志物CD40、CD80和CD86的表面表达显著增加。另外，用GFP-Hom-1转染的TAM中，促炎性细胞因子TNFα、IL-1β和IL-12的分泌显著增加，而M2细胞因子IL-10的分泌显著减少。一致地，基因表达分析显示了用GFP-Hom-1转染的TAM中，M1基因诸如IL-1β、IL-6、TNF-α和iNO显著增加，而在用GFP-Hom-1转染的TAM中，M2基因诸如CCL18、MMP9、VEGFA和Arg1显著降低。我们的数据共同表明Hom-1调节TAM可塑性并促进TAM的M1极化。

Hom-1将TAM转化为肿瘤抑制细胞

我们关于Hom-1促进TAM的M1极化的发现促使我们探索经Hom-1修饰的TAM是否可以施加肿瘤抑制。用编码GPF-Hom-1或对照GFP的质粒转染来自结肠癌的新鲜分离的TAM。然后，使用转孔培养系统将经修饰的TAM与同一患者的肿瘤或正常组织共培养。值得注意的是，共培养7-10天后，在与经GFP-Hom-1修饰的TAM温育期间，肿瘤体积显著减少(约70％)(p<0.01)，而在与经GFP转染的TAM或仅TAM温育的肿瘤大小没有显著变化。为了测定肿瘤体积的缩小是否与癌细胞的减少有关，我们使用CK20抗体对结肠癌细胞进行了组织切片、H&E染色和免疫组织化学。我们发现CK20阳性肿瘤细胞出现在与TAM或经GFP修饰的TAM一起温育的肿瘤的巢(nest)、索(cord)和片中。然而，CK20阳性肿瘤细胞在与用GFP-Hom-1转染的TAM一起温育期间消失。下述发现证明了经Hom-1修饰的TAM的杀肿瘤效果的特异性：在与用GFP或GFP-Hom-1转染的TAM一起温育期间，经Hom-1修饰的TAM对正常结肠粘膜的体积和形态施加最小程度的影响。

Hom-1在体内促进TAM的杀肿瘤性功能

我们关于Hom-1在体外将TAM转化为杀肿瘤性细胞的发现促使我们探索Hom-1调节的TAM在体内肿瘤发生中的潜在作用。将结肠癌切成约0.5cm的块，并通过手术接种到NSG小鼠腹侧的皮下空间中。一周后，通过小鼠尾静脉注射经MO-Hom-1转染的TAM(Hom-1抑制性)或经GFP-Hom-1转染的TAM(Hom-1表达性)。异种移植8周后，在注射经MO-Hom-1转染的TAM的小鼠中形成肿瘤，但在注射了经GFP-Hom-1转染的TAM的小鼠中未形成肿瘤。

此外，我们在相同小鼠模型中评估了抗CK20抗体与经MO-Hom-1转染的TAM组合的效果。肿瘤形成后对小鼠施用单独或与经MO-Hom-1转染的TAM组合的抗体。仅施用抗体的小鼠中的肿瘤继续生长。另一方面，与仅用抗体治疗的小鼠相比，施用抗体和经MO-Hom-1转染的TAM的小鼠中的肿瘤停止生长或以慢得多的速率生长。

我们还发现TAM或单核细胞可以通过在M1分化培养基中培养它们而诱导以表现出M1表型。可以将这些M1分化的TAM/单核细胞输注入NSG小鼠中，并抑制体内癌症生长。通过抑制这些TAM或单核细胞中Hom-1的表达消除M1分化的TAM对肿瘤生长的影响。

TAM中Hom-1异位表达对各种癌症类型的影响

TAM已经牵涉基本上所有肿瘤的癌发生。在我们对结肠癌细胞中TAM的研究之后，我们将研究扩展到了其他肿瘤类型。

获得了肺癌、黑素瘤、食道癌、胃癌和胰腺癌的手术种类，并分离TAM，如上所述。获得来自同一患者的相应正常组织的巨噬细胞。使用实时RT-PCR对TAM和组织巨噬细胞中Hom-1的表达进行定量。与来自远处正常组织的相应巨噬细胞中的Hom-1表达相比，所有这些肿瘤的TAM中Hom-1表达均较低。

为了测定Hom-1是否可以将这些TAM转化为杀肿瘤性细胞，将GFP或GFP-Hom-1转染到TAM中。转染48小时后，分选出GFP阳性细胞并与单独的肿瘤共培养。与经GFP-Hom-1转染的TAM而非与经对照GFP转染的TAM共培养期间，所有肿瘤的肿瘤体积均减少。我们的结果表明不依赖于肿瘤类型，Hom-1可以将TAM转化为杀肿瘤性细胞。

收集结肠组织样品

从来自病理实验室的患者的手术切除的标本中获得癌组织和正常组织。从每个肿瘤块或距肿瘤块15cm处的正常粘膜收集约5-10克组织。还收集患者血液样品。

上皮内淋巴细胞的制备

在有修改的情况下使用先前描述的技术(Kamada N等,2008；Pignata C等,1990)分离固有层单核细胞(LPMC)。简而言之，将经解剖的新鲜粘膜和肿瘤块在10cm培养皿中用不含Ca²⁺且不含Mg²⁺的汉克平衡盐溶液(HBSS)(lifetechnologies)冲洗，该溶液含有2％胎牛血清(FBS)和1mMD二硫苏糖醇(DTT)(Sigma-Aldrich)以除去粘液。用剃须刀刀片将粘膜和肿瘤切成0.5cm碎片，并在具有含有1mM EDTA(Sigma-Aldrich)的5mL HBSS的6孔板中于37℃温育1小时，然后通过灰色网孔(gray-mesh)(100微米)。流过物包含上皮内淋巴细胞和上皮细胞，并通过流式细胞仪进行分析。

从肿瘤块和正常粘膜中分离巨噬细胞

随后，将粘膜和肿瘤在含有2％FBS、1.5mg/mL胶原酶D(Roche)、0.1mg/mL DNA酶I的HBSS(含Ca²⁺和Mg²⁺)中于37℃温育1小时。将经消化的组织通过灰色网孔(70微米)滤器。收集流过物，并重悬浮在40％Percoll溶液(Pharmacia)中，然后在60％Percoll上分层，并在不制动的情况下以2000rpm离心30分钟。收集界面处的LPMC。在不消减CD16的情况下使用EasySep^TM人单核细胞/巨噬细胞富集试剂盒(StemCell Technologies)根据制造商的用法说明，从LPMC中纯化正常的粘膜巨噬细胞和TAM。通过碘化丙啶(PI)染色，通过这些技术分离的细胞通常是超过98％存活的。肠道巨噬细胞的纯度超过95％。

从外周血制备巨噬细胞

通过Ficoll密度梯度离心分离来自布列根妇女医院(Brigham and Womenhospital)的健康成年供体的外周血单个核细胞(PBMC)。在不消减CD16的情况下使用EasySep^TM人单核细胞富集试剂盒根据制造商的用法说明从PBMC中纯化人单核细胞。将纯化的细胞在含10ng/mL M-CSF(PeproTech)的完全RPMI培养基中培养。富集后，将单核细胞在含M-CSF的完全RPMI培养基中培养5天，将细胞用于共培养系统。

FACS分析

使用缀合有荧光染料的抗体对细胞进行免疫标记后，使用流式细胞术对TAM和其他淋巴细胞进行表型分析。使用以下抗体：缀合有PE的抗CD3(OKT3)、CD25(BC96)、CD14(61D3)、CD68(eBio Y182A)、CD163(eBioGH161)、-CD206、缀合有FITC的抗CD4(RPA-T4)、CD33(HIM3-4)，缀合有APC的抗CD8(OKT8)、CD4(OKT4)(eBioscience，Inc)。按照制造商提供的方案，用缀合有PE的抗体对Foxp3(236A/E7)、IFN-γ，穿孔蛋白和粒酶B进行胞内染色。平行进行同位素对照标记。按照供应商的建议稀释抗体。用Cell-Quest软件(BDBiosciences)在FACScan流式细胞仪上收集标记的细胞，并通过FlowJo软件进行分析。结果表示为阳性细胞的百分比。

肿瘤和巨噬细胞的器官型共培养

将转孔***物(孔径为0.4μm，Costar，Corning)放置在12孔聚苯乙烯组织培养板(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中。称重粘膜和肿瘤块，并用加上抗生素的1xPBS缓冲液洗涤，然后切成0.5cm的块。将约50mg组织接种在12孔转孔的上层隔室中，并用0.5mLRPMI 1640完全培养基填充。将5x 10⁵的TAM以50万个细胞/孔的密度添加到下部隔室中，没有直接的细胞-组织接触，并填充2mL PRMI完全培养基。将板在37℃，5％CO₂下温育。收集0.5mL培养基用于细胞因子分析，并且每三天添加新鲜培养基。共培养两周后，收集下部隔室巨噬细胞，并通过TRIzol试剂(Ambion)分离总RNA。每周两次用卡尺监测肿瘤和正常粘膜，以根据公式(长度x宽度²)/2计算肿瘤体积。组织的照片由Leica EZ4D立体显微镜上的3百万像素CMOS相机或iPhone上的数码相机拍摄。

免疫组织化学

将肿瘤或正常组织固定在***(Fisher Scientific Company，Kalamazoo,MI)中。进行CK20染色(Dako，Carpinteria，CA，克隆Ks20.8，1:50)和苏木精/曙红(H&E)染色。CK20染色在Leica Bone III染色平台上使用Epitope Retrieval 2在线进行20分钟，并使用Bone Polymer Refine检测试剂盒进行。用Nikon Eclipse Ti荧光显微术进行显微镜分析。应用NIS Elements成像软件(Nikon)使用彩色相机以40倍的原始放大倍数捕获图像。代表性图像的亮度和对比度在各组之间均等地调整。

Hom-1过表达

通过lipofectamine 2000(Life Technologies)根据制造方案将GFP-Hom-1转染到血液巨噬细胞和TAM中。转染后48小时，通过70um滤器过滤细胞以进行细胞分选。在BakerBio-Protect Hood中通过BD FACSAria II在无菌条件下对GFP阳性细胞进行分选。分选后，将细胞在RPMI 1640完全培养基中培养。Hom-1敲低

使用人单核细胞核转染剂(Nucleofector)试剂盒(Lonza,Walkersville,MD)根据制造商的用法说明用吗啉代(MO)反义寡核苷酸转染结肠TAM或人原代单核细胞。简而言之，将5×10⁶个细胞与2.5nmol的Hom-1MO寡核苷酸或标准对照MO寡核苷酸重悬于100μl核转染剂溶液中，并用核转染剂II装置(Lonza)电穿孔。然后立即从装置中取出细胞，并与1ml预热的含有2mM谷氨酰胺和10％FBS的人单核细胞核转染剂培养液温育过夜。然后将细胞重悬于完全RPMI培养基中，并用适当的细胞因子处理以诱导分化为巨噬细胞。所有的MO寡核苷酸都自Gene Tools(Philomath，OR)订购。

细胞因子测量

使用从eBiosciences获得的ELISA试剂盒，对经大肠杆菌LPS(Sigma-Aldrich)处理的血巨噬细胞或经LPS处理的TAM的上清液中IL-1β、IL-10、TNF-α和IL-12p70的水平进行定量。根据制造商的用法说明进行分析。

定量RT-PCR

用TRIzol试剂分离总RNA，并通过NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测量RNA量。使用SuperScript III第一链合成系统(Life Technologies)根据制造商的方案将等量的RNA用于第一链cDNA合成。为了通过常规PCR扩增Hom-1 cDNA，我们按照制造商的用法说明使用AccuPrimeTaq DNA聚合酶系统(Life Technologies)。在2％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并用溴化乙啶染色。GAPDH用作内部对照。我们在LightCycler(480Real-Time PCRSystem；Roche)上用SYBR Green进行了Hom-1和其他基因cDNA的定量测量。然后使用比较Ct方法(ΔΔC_t方法)计算mRNA的相对表达概况。

精氨酸酶活性和NO测定法

通过使用QuantiChrom精氨酸酶测定试剂盒(DARG-200；BioAssays Systems)测量尿素的产生来定量细胞裂解物中的精氨酸酶活性。使用Griess试剂盒(Molecular Probes)测定培养上清液中的亚硝酸盐浓度。

统计分析

使用Student检验进行统计分析。

其他实施方式

本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由具有相同、等同或相似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列通用等同或相似特征的例子。

根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定所描述的实施方案的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对实施方案进行各种改变和修改以使其适应于各种用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求书内。

序列表

<110> 朱正仑

<120> 治疗新生性疾病的方法

<130> 218008-0007PCT

<150> US 62/477,754

<151> 2017-03-28

<150> US 62/516,401

<151> 2017-06-07

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2428

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (12)..(788)

<400> 1

acctggccgc c atg cgc ctc tcc tcc tcc cca cct cgt ggc ccg cag cag 50

Met Arg Leu Ser Ser Ser Pro Pro Arg Gly Pro Gln Gln

1 5 10

ctc tcc agc ttt ggc tcc gtg gac tgg ctc tcc cag agc agc tgc tca 98

Leu Ser Ser Phe Gly Ser Val Asp Trp Leu Ser Gln Ser Ser Cys Ser

15 20 25

ggg ccg acc cac acc ccc agg cct gcc gac ttc tcc ctg ggg agc ctc 146

Gly Pro Thr His Thr Pro Arg Pro Ala Asp Phe Ser Leu Gly Ser Leu

30 35 40 45

cct ggc cca ggc cag aca tcc ggc gcc cgg gag ccc cct cag gcc gtc 194

Pro Gly Pro Gly Gln Thr Ser Gly Ala Arg Glu Pro Pro Gln Ala Val

50 55 60

agc atc aag gag gcc gcc ggg tcc tca aat ctg cct gcg ccg gag agg 242

Ser Ile Lys Glu Ala Ala Gly Ser Ser Asn Leu Pro Ala Pro Glu Arg

65 70 75

acc atg gcc ggg ttg agt aag gag cca aat acc ttg cgg gcc ccc cgt 290

Thr Met Ala Gly Leu Ser Lys Glu Pro Asn Thr Leu Arg Ala Pro Arg

80 85 90

gtc cgc aca gcc ttc acc atg gag cag gtc cgc acc ttg gag ggc gtc 338

Val Arg Thr Ala Phe Thr Met Glu Gln Val Arg Thr Leu Glu Gly Val

95 100 105

ttc cag cac cac cag tac ctg agc cct ctg gag cgg aag agg ctg gcc 386

Phe Gln His His Gln Tyr Leu Ser Pro Leu Glu Arg Lys Arg Leu Ala

110 115 120 125

agg gag atg cag ctc tca gag gtc cag ata aaa acc tgg ttt cag aat 434

Arg Glu Met Gln Leu Ser Glu Val Gln Ile Lys Thr Trp Phe Gln Asn

130 135 140

cgc cgc atg aaa cac aaa cgg caa atg cag gac ccc cag ctg cac agc 482

Arg Arg Met Lys His Lys Arg Gln Met Gln Asp Pro Gln Leu His Ser

145 150 155

ccc ttc tcg ggg tct ctc cat gcg ccc cca gct ttc tac tca acg tct 530

Pro Phe Ser Gly Ser Leu His Ala Pro Pro Ala Phe Tyr Ser Thr Ser

160 165 170

tct ggc ctt gcc aat ggc ctg cag ctg ctg tgc cct tgg gca ccc ctg 578

Ser Gly Leu Ala Asn Gly Leu Gln Leu Leu Cys Pro Trp Ala Pro Leu

175 180 185

tcc ggg ccc cag gct ctg atg ctg ccc cct ggc tcc ttc tgg ggt ctc 626

Ser Gly Pro Gln Ala Leu Met Leu Pro Pro Gly Ser Phe Trp Gly Leu

190 195 200 205

tgc caa gtg gca caa gag gcc ctg gca tct gcg gga gct tcc tgc tgc 674

Cys Gln Val Ala Gln Glu Ala Leu Ala Ser Ala Gly Ala Ser Cys Cys

210 215 220

ggg cag cct ctg gcg tcc cac ccc cct acc cca ggc cgg cct tcg ctg 722

Gly Gln Pro Leu Ala Ser His Pro Pro Thr Pro Gly Arg Pro Ser Leu

225 230 235

gga cca gcc ctg tcc acg ggg ccc cgg ggc ctg tgt gct atg cca cag 770

Gly Pro Ala Leu Ser Thr Gly Pro Arg Gly Leu Cys Ala Met Pro Gln

240 245 250

acg ggg gat gca ttt tga ggaggcacct ctgactccca cactcgcggt 818

Thr Gly Asp Ala Phe

255

cttgctgatc gcacctggct cctacctgga ggactcagtt gttctgttta catcctggtg 878

gcacctctca ccctgaccca cacaaaggtt ctggagatta ctggagaata tatataaata 938

tatatatgta cgtatatatg taaatacaca tatacgtata tataaatata tatatacata 998

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tctgtcaccc aggctggagt gcaatgacgc aatctcggct cactgcaacc tccgcctcct 1118

gggttcaagc gattctccag cctcagcctc ccgagtagct gggattacag acacccgcca 1178

ccacgcccgg ctaatttttt ctatttttag tagaaatggg gtttcaccat gttagccagg 1238

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gtgtacaaaa gaaaacaggg aatgcaggtg tgtttatagc gttgtggttc aagtccctct 1598

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tgcccagaat gggaggcacg gaagcccctc ccggggagga ctcccgcgtt gatggaccgt 1958

tcttggtgca gactcctgac tgcgtgcatg aaacctgaga caagtgcaat tccttccatg 2018

tcgccccaga gtgcccagga ggcaggcagt gcggggtgcc caggcagacg ggttcagcct 2078

gcagaactgg aggcgacctg tgaaacccac ccgggcaccc caacaggaac agaagcgtgg 2138

tcctgcggct gcgtccccag cgagtttcac tttccccttg ctcgtttctc ccttgttgta 2198

agtgtttaca actggcatgt gcttttaaac gtcaggtaag aggggaacag ctgctgtaca 2258

tcgtcctggc gagtgacaat gtgacagaag cctgggcgag gccctcggag ggcagcagct 2318

ggacaggggc tactgggttt ggcctggaca gcactgattt gtggatgtgg atgggggcac 2378

gttgtccgtg ataaaagtac aagtgcccct cacaaaaaaa aaaaaaaaaa 2428

<210> 2

<211> 258

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Arg Leu Ser Ser Ser Pro Pro Arg Gly Pro Gln Gln Leu Ser Ser

1 5 10 15

Phe Gly Ser Val Asp Trp Leu Ser Gln Ser Ser Cys Ser Gly Pro Thr

20 25 30

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35 40 45

Gly Gln Thr Ser Gly Ala Arg Glu Pro Pro Gln Ala Val Ser Ile Lys

50 55 60

Glu Ala Ala Gly Ser Ser Asn Leu Pro Ala Pro Glu Arg Thr Met Ala

65 70 75 80

Gly Leu Ser Lys Glu Pro Asn Thr Leu Arg Ala Pro Arg Val Arg Thr

85 90 95

Ala Phe Thr Met Glu Gln Val Arg Thr Leu Glu Gly Val Phe Gln His

100 105 110

His Gln Tyr Leu Ser Pro Leu Glu Arg Lys Arg Leu Ala Arg Glu Met

115 120 125

Gln Leu Ser Glu Val Gln Ile Lys Thr Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met

130 135 140

Lys His Lys Arg Gln Met Gln Asp Pro Gln Leu His Ser Pro Phe Ser

145 150 155 160

Gly Ser Leu His Ala Pro Pro Ala Phe Tyr Ser Thr Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Ala Asn Gly Leu Gln Leu Leu Cys Pro Trp Ala Pro Leu Ser Gly Pro

180 185 190

Gln Ala Leu Met Leu Pro Pro Gly Ser Phe Trp Gly Leu Cys Gln Val

195 200 205

Ala Gln Glu Ala Leu Ala Ser Ala Gly Ala Ser Cys Cys Gly Gln Pro

210 215 220

Leu Ala Ser His Pro Pro Thr Pro Gly Arg Pro Ser Leu Gly Pro Ala

225 230 235 240

Leu Ser Thr Gly Pro Arg Gly Leu Cys Ala Met Pro Gln Thr Gly Asp

245 250 255

Ala Phe