具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

第一方面，在某次具体的实施方式中，本发明通过提供了多肽在调控巨噬细胞体外转型和制备调控巨噬细胞体外转型产品中的应用，所述多肽固相全合成技术合成，氨基酸序列为EAGSAKELEGDPVAG（如SEQ ID No.1所示），分子量为1428.6731Da。经验证，所述多肽的加入能够显著增加M2型巨噬细胞标志物的表达，同时抑制M1型巨噬细胞标志物的表达。

基于第一方面，第二方面本发明提供一种巨噬细胞体外转型的调控方法，所述调控方法包括向M1型巨噬细胞的细胞悬液中添加终浓度为200~800μg/mL的多肽后，经细胞培养得到M2型巨噬细胞的细胞悬液；

所述多肽为由序列SEQ ID No.1所示氨基酸序列组成的多肽。

在可选的实施方式中，所述M1型巨噬细胞的细胞悬液包括向巨噬细胞悬液中添加炎症诱导因子后，经细胞培养得到M1型巨噬细胞的细胞悬液。

在可选的实施方式中，所述巨噬细胞悬液包括巨噬细胞经DMEM高糖培养基培养得到的对数生长期的巨噬细胞悬液。

在可选的实施方式中，所述炎症诱导因子包括LPS，所述LPS加入巨噬细胞悬液后的终浓度为0.5~1.5μg/mL，优选终浓度为1μg/mL。

基于第二方面，第三方面本发明提供一种调控巨噬细胞体外转型制剂，所述制剂包括调控巨噬细胞体外转型的多肽、M1型巨噬细胞分子标志物检测试剂和M2型巨噬细胞分子标志物检测试剂。

为了便于标准化操作，所述制剂还可以包括第二方面中所述的DMEM高糖培养基和LPS。

类似于第三方面，第四方面本发明提供一种调控巨噬细胞体外转型试剂盒，所述试剂盒包括调控巨噬细胞体外转型的多肽、M1型巨噬细胞分子标志物检测试剂、M2型巨噬细胞分子标志物检测试剂和耗材。

为了便于高效操作，所述耗材包括孔板、移液装置、试剂容器等。

在上述三方面和第四方面中所述M1型巨噬细胞分子标志物检测试剂包括扩增编码iNOS的基因的正向扩增引物ACTCAGCCAAGCCCTCACCTAC（如SEQ ID No.2所示）和扩增编码iNOS的基因的反向扩增引物TCCAATCTCTGCCTATCCGTCTCG（如SEQ ID No.3所示）；和/或，扩增编码TNF-α的基因的正向扩增引物ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC（如SEQ ID No.4所示），和扩增编码TNF-α的基因的反向扩增引物GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA（如SEQ ID No.5所示）；

所述M2型巨噬细胞分子标志物检测试剂包括扩增编码Arg-1的基因的正向扩增引物CATATCTGCCAAAGACATCGTG（如SEQ ID No.6所示）和扩增编码Arg-1的基因的反向扩增引物GACATCAAAGCTCAGGTGAATC（如SEQ ID No.7所示）；和/或，

扩增编码IL-10的基因的正向扩增引物TTCTTTCAAACAAAGGACCAGC（如SEQ ID No.8所示）和扩增编码IL-10的基因的反向扩增引物GCAACCCAAGTAACCCTTAAAG（如SEQ ID No.9所示）。

经研究，发明人能够确认的是，对于DMEM高糖培养基培养和LPS诱导形成的M1型巨噬细胞，加入本发明提供的多肽后，能够诱导M1型巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞，并且，该转变过程能够采用核苷酸序列为上述SEQ ID No.2~SEQ ID No.9所示引物的组合准确地检测。

结合前述几个方面，本发明提供前述实施方式所述的制剂或者前述实施方式所述的试剂盒在药物预防和/或治疗效果评价中的应用，所述药物预防和/或治疗过程中伴随有M1型巨噬细胞转型为M2型巨噬细胞的过程。

下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

本实施例提供了一种调控巨噬细胞体外转型制剂，包括由序列SEQ ID No.1所示氨基酸序列组成的多肽（HE-D），扩增编码iNOS的基因的引物、扩增编码TNF-α的基因的引物、扩增编码Arg-1的基因的引物和扩增编码IL-10的基因的引物，还包括对照基因β-actin的扩增引物，具体的引物组成如表1所示。

表1实施例1中所述调控巨噬细胞体外转型制剂中的引物组成

实施例2

本实施例提供了一种调控巨噬细胞体外转型制剂，与实施例1的区别在于，所述引物组成如表2所示。

表2实施例2中所述调控巨噬细胞体外转型制剂中的引物组成

实施例3和4

本组实施例在实施例1和2提供的调控巨噬细胞体外转型制剂的基础上，分别提供了一种调控巨噬细胞体外转型试剂盒，实施例3和4所述试剂盒均包括孔板、移液枪和试剂溶剂，还分别包括实施例1和2提供的调控巨噬细胞体外转型制剂。

实施例5

本实施例提供了采用实施例1提供的调控制剂或采用实施例3提供的调控试剂盒调控巨噬细胞体外转型的方法，包括以下步骤：

（1）取对数生长期细胞，用体积百分比为10%FBS的DMEM高糖培养基将对数生长期Raw264.7细胞配制为5×10⁵个/mL密度的细胞悬液，接种在六孔板内，在5% CO₂，37℃环境下培养。

（2）实验共分为五组，包括空白组，LPS模型组，低剂量组（LHED）LPS+200μg/mL HE-D组，中剂量组（MHED）LPS+400μg/mL HE-D组，高剂量组（HHED）LPS+800μg/mL HE-D组，每组取3个生物学重复。待步骤（1）中Raw264.7细胞培养24h后，LPS模型组、低剂量组、中剂量组以及高剂量组分别加入LPS使其终浓度为1.0μg/mL，处理1h后，各剂量组加入HE-D，使其终浓度分别为200μg/mL、400μg/mL、800 μg/mL，继续培养24h。

（3）吸弃每孔中的培养液，用PBS缓慢清洗三遍，每孔加入1mL TRIZOL将细胞吹打均匀，使其充分裂解，立即放入液氮速冻20min，随后转移至-80℃低温保存以待送样。

效果例1

采用qRT-PCR检测巨噬细胞转型相关基因mRNA水平，对实施例5中的五组细胞培养液的相关基因mRNA水平进行检测，检测方法如下：

（1）制备RNA样品

1.弃去各组细胞培养基，PBS洗涤并加入TRIZOL裂解细胞，转移至无RNase EP管中，静置10 min。

2.往EP管中加入氯仿提取核酸，每1mL TRIZOL裂解液添加0.2mL氯仿，充分混匀，静置10min，4 ℃下12000rpm离心15min。

3.吸取上层无色的上清液至无RNase EP管中，加入500μL异丙醇，充分混匀，静置10min，4 ℃下12000 rpm离心10min。

4.弃去上清液，加入DEPC水配制的75%乙醇1mL，慢慢吹起，轻摇上下颠倒15s，4 ℃下7000 rpm离心5min。

6.小心吸弃上清液，打开管盖，室温干燥10min，使残留的乙醇挥发，然后加入DEPC水50μL，充分溶解，-80℃保存。

（2）RNA浓度测定

将分光光度计调零，取1μL样品溶液与99μLDEPC水中混匀，测定A₂₆₀/A₂₈₀，该值处于1.8-2.1范围可以用于后续实验。

（3）样品cDNA合成

1.在RNase Free管中加入以下成分，首先进行去基因组DNA反应：

混和均匀，42℃水浴5min后置于冰上。

2.继续在同一管中加入以下成分进行cDNA合成：

瞬时离心，混和均匀，50℃水浴15min，85℃水浴5min，使SPAPKscript И HRTase和gDNA Eraser失活，冷却后-80℃保存。

（4）qRT-PCR

1.在PCR管中按照以下反应体系进行（25μL反应体系）：

瞬时离心，混和均匀，冰上避光操作。

2.使用qRT-PCR仪运行以下程序：

1.95 ℃变性2 min；

2.95 ℃变性15 s，退火 15 s（温度为“Tm值-5”℃），72℃延伸30s，共循环40次；

3.熔解段，95℃ 1min→65℃ 1min→95℃ 20s→40℃ 1min。

Arg-1基因、iNOS基因、IL-10基因和TNF-α基因检测结果分别如图1~4所示，如图所示，qRT-PCR结果显示，HE-D干预后，M1型巨噬细胞的典型标志物iNOS和TNF-α基因下调，M2型巨噬细胞典型标志物Arg-1和IL-10基因上调。1μg/mL LPS可以显著促进iNOS和TNF-α的mRNA水平，200-800μg/mL的HE-D可以显著降低iNOS和TNF-α的mRNA水平且伴随浓度依赖性（800μg/mL HE-D浓度下最大抑制率分别为40.3%、53.5%）。同时，与LPS组相比，200-800 μg/mL HE-D可以显著增加Arg-1的mRNA水平（800μg/mL HE-D浓度下最大促进率为94.5%），400-800μg/mL HE-D可以显著增加IL-10的mRNA水平（800μg/mL HE-D浓度下最大促进率为44.5%）。上述结果表明HE-D可以促使LPS诱导的M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。

效果例2

采用Western blot检测巨噬细胞转型相关基因mRNA水平，对实施例5中的五组细胞培养液的相关基因mRNA水平进行检测，检测方法如下：

（1）制备蛋白样品

1.弃去各组细胞培养基，PBS缓慢清洗三次。

2.配置向待测细胞中加入适量细胞裂解液，4℃裂解30 min，然后在4℃ 12000rpm 条件下离心5 min，取上清液备用。

3.BCA法测定并调平样品蛋白浓度，加入loading buffer至1×，95℃水浴5min，冷却后置于-20℃待用。

（2）SDS-PAGE电泳

将制胶玻璃板洗净并固定在夹子中，并按以下标准制备分离胶。配置分离胶时需充分混匀每一种成分，并且加入TEMED后需即刻进行灌胶，并使用超纯水对分离胶进行液封，待出现明显的两相分界线后，吸去水相。

10%分离胶（两块胶，10 mL），依次加入：

5%浓缩胶（两块胶，4 mL），依次加入：

加入浓缩胶后即插入电泳梳，待胶凝固后加入电泳缓冲液，并拔出电泳梳。加入适量Marker和待测样品，调节电压80V电泳15-20 min后改为120V，电泳70-80 min。

（3）转膜

提前准备转膜装置和PVDF膜，切取目标条带，置于转膜装置中，并将PVDF膜放置于胶条上。待电泳完成后，根据Marker的蛋白大小，将目标蛋白从分离胶中切取出来，并放于1×转膜液中浸润5min。然后将目标蛋白所在胶带转移至滤纸上方，按照由下至上海绵垫/滤纸/胶带/PVDF膜/滤纸/海绵垫的顺序放置，在1×转膜液中轻轻挤压气泡，随后合上转膜夹子，并转移至转膜槽中，加入足量的1×转膜液，100V转膜110min。

（4）免疫反应

完成转膜后，将PVDF膜与蛋白胶条接触的一面朝上过夜封闭，用1×TBST洗涤PVDF膜，随后一抗孵育2 h并用1×TBST洗涤。再将PVDF膜放入二抗中，室温下摇床孵育2 h，最后使用1×TBST在室温下摇床洗五次，每次5min。

（5）显影

提前打开化学发光成像仪，滴加ECL发光试剂，随后盖上仪器盖进行曝光，设置曝光时间为1-2 min。曝光结束后，保存条带图片，随后使用Image J对条带进行分析。

条带结果如图5所示，Arg-1基因、iNOS基因、IL-10基因和TNF-α基因的蛋白表达量分别如图6~9所示，Western blot结果显示，HE-D可以抑制由LPS诱导的iNOS、TNF-α的蛋白表达，并增加Arg-1和IL-10的蛋白表达，表明HE-D可以促进巨噬细胞由M1型向M2型转化。

400-800μg/mL HE-D可以显著增加Arg-1的蛋白水平（800μg/mLHE-D浓度下最大促进率为52.8%），800μg/mL HE-D可以显著增加IL-10的蛋白水平（促进率为77.4%）。同时，400-800μg/mLHE-D可以显著降低iNOS（800μg/mL HE-D浓度下最大抑制率为72.7%），800μg/mLHE-D可以显著降低TNF-α的蛋白水平（抑制率为16.3%）。上述结果表明HE-D可以促使LPS诱导的M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 汇泰渤海水产有限责任公司 山东大学威海工业技术研究院

<120> 多肽在调控巨噬细胞体外转型中的应用

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 水蛭肽

<400> 1

Glu Ala Gly Ser Ala Lys Glu Leu Glu Gly Asp Pro Val Ala Gly

1 5 10 15

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actcagccaa gccctcacct ac 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccaatctct gcctatccgt ctcg 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtctcagc ctcttctcat tc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcttgtcact cgaattttga ga 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catatctgcc aaagacatcg tg 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gacatcaaag ctcaggtgaa tc 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttctttcaaa caaaggacca gc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcaacccaag taacccttaa ag 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctacctcatg aagatcctga cc 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cacagcttct ctttgatgtc ac 22