阅读说明：本技术 一种巨噬细胞向m2型巨噬细胞分化的检测方法 (Method for detecting differentiation of macrophages into M2 type macrophages ) 是由 褚一凡 江嘉豪 何美第 陈炽锋 刘锐 王进辉 于 2019-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化的检测方法,涉及干细胞及再生医学领域。该检测方法,包括以下步骤：获取单核巨噬细胞：将稀释血液加入淋巴细胞分离液中,离心,去掉上层液体,保留沉淀,加入清洗液,离心,去掉上层液体,保留沉淀,分选出单核巨噬细胞；分组培养：将获取的单核巨噬细胞分为共培养组和对照组,向共培养组中加入脐带间充质干细胞,将共培养组和对照组放置于相同条件下培养；检测：检测分组培养后巨噬细胞CD163、CD204、CD206、HLA-DR的表达情况。本发明能够全面地评价脐带间充质干细胞对巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化的影响。(The invention provides a method for detecting the differentiation of macrophages to M2 type macrophages, and relates to the field of stem cells and regenerative medicine. The detection method comprises the following steps: obtaining mononuclear macrophages: adding diluted blood into lymphocyte separation liquid, centrifuging, removing upper layer liquid, retaining precipitate, adding cleaning solution, centrifuging, removing upper layer liquid, retaining precipitate, and separating out mononuclear macrophage; grouping culture: dividing the obtained mononuclear macrophages into a co-culture group and a control group, adding umbilical cord mesenchymal stem cells into the co-culture group, and culturing the co-culture group and the control group under the same condition; and (3) detection: detecting the expression of macrophages CD163, CD204, CD206 and HLA-DR after the grouping culture. The method can comprehensively evaluate the influence of the umbilical cord mesenchymal stem cells on the differentiation of the macrophages to M2 type macrophages.)

一种巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化的检测方法

技术领域

本发明涉及干细胞及再生医学领域，特别是涉及一种巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化的检测方法。

背景技术

巨噬细胞是机体免疫的重要组成细胞，广泛分布于全身各处，具有较强的变形运动、识别吞噬和杀伤清除病原体等能力。在局部微环境的影响下，巨噬细胞可以分化为不同的亚群，如M1和M2型巨噬细胞等，其中M2型巨噬细胞主要参与受损组织的修复。间充质干细胞是一类多能干细胞，具有多向分化能力，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，而且间充质干细胞本身还可以促进受损组织的修复与再生。

目前，关于干细胞影响组织再生的研究大多聚焦于干细胞分化为其他细胞，缺乏干细胞调节免疫细胞进而促进组织修复的探讨。因此，本发明的目的在于提供一种检测间充质干细胞影响巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化的方法。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化的检测方法，可以全面地检测和评价脐带间充质干细胞影响巨噬细胞向M2型分化的情况。

一种巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化的检测方法，包括以下步骤：

获取单核巨噬细胞：将血液稀释得到稀释血液，将稀释血液加入淋巴细胞分离液中，离心，去掉上层液体，保留沉淀，加入清洗液，离心，去掉上层液体，保留沉淀，分选出单核巨噬细胞；

分组培养：将获取的单核巨噬细胞分为共培养组和对照组，向共培养组中加入脐带间充质干细胞，将共培养组和对照组放置于相同条件下培养；

检测：检测分组培养后巨噬细胞CD163、CD204、CD206、HLA-DR的表达情况，将CD206阳性、CD204阳性、CD163阳性、HLA-DR阴性定义为M2型巨噬细胞，根据共培养组和对照组的表达情况判断间充质干细胞对巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化的影响。

上述检测方法，提供了四种检测指标，即CD163、CD204、CD206、HLA-DR，当共培养后巨噬细胞CD163、CD204、CD206的表达增加，HLA-DR的表达降低时，则说明该间充质干细胞影响巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化的能力强、质量好，该间充质干细胞调节组织再生的能力强。本发明选择上述四种检测指标，其中CD163为清道夫受体，介导巨噬细胞吞噬血红蛋白复合体；CD204也是清道夫家族成员，参与清除凋亡的细胞；CD206为甘露糖受体，识别病原微生物表达的蛋白多糖，清除外来有害物质；HLA-DR为组织相容性蛋白，介导巨噬细胞的抗原递呈，主要表达在M1型巨噬细胞表面，结合以上四种表面标记可以全面、高效地检测间充质干细胞对巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化影响。

在其中一个实施例中，所述获取单核巨噬细胞步骤中，稀释血液的步骤为：将获取的血液与生理盐水混合稀释，得到稀释血液，所述血液与生理盐水的体积比为10：(12～18)。优选地，血液与生理盐水的体积比为10:15。

在其中一个实施例中，所述获取单核巨噬细胞步骤中，所述稀释血液离心的条件为：离心温度为20±1℃下，离心力为400～500g，离心时间为18～22min，升速为7，降速为0。

在其中一个实施例中，所述获取单核巨噬细胞步骤中，所述清洗液为磷酸盐缓冲液，加入磷酸盐缓冲液后的离心条件为：离心温度为4±1℃下，离心力为200～300g，离心时间为7～9min，升速为9，降速为9。

在其中一个实施例中，所述获取单核巨噬细胞步骤中，采用磁珠分选单核巨噬细胞。

在其中一个实施例中，所述分组培养步骤中，单核巨噬细胞的浓度5～10×10⁵个/mL。

在其中一个实施例中，所述分组培养步骤中，共培养组中加入的间充质干细胞的数量与单核巨噬细胞的数量比为1:(0.8～1.2)。优选地，共培养组中加入的间充质干细胞的数量与单核巨噬细胞的数量比为1:1。

在其中一个实施例中，所述分组培养步骤中，培养的时间为6～8天。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的检测方法，提供了四种检测指标，即CD163、CD204、CD206、HLA-DR，当共培养后巨噬细胞CD163、CD204、CD206的表达增加，HLA-DR的表达降低时，则说明该间充质干细胞影响巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化的能力强、质量好，脐带间充质干细胞调节组织再生的能力强。本发明选择上述四种检测指标，其中CD163为清道夫受体，介导巨噬细胞吞噬血红蛋白复合体；CD204也是清道夫家族成员，参与清除凋亡的细胞；CD206为甘露糖受体，识别病原微生物表达的蛋白多糖，清除外来有害物质；HLA-DR为组织相容性蛋白，介导巨噬细胞的抗原递呈，主要表达在M1型巨噬细胞表面，结合以上四种表面标记可以全面、高效地检测间充质干细胞对巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化影响。

附图说明

图1为巨噬细胞表达CD163的变化情况；

图2为巨噬细胞表达CD204的变化情况；

图3为巨噬细胞表达CD206的变化情况；

图4为巨噬细胞表达HLA-DR的变化情况。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

一种巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化的检测方法，包括以下步骤：

1)获取健康人捐赠的血液10mL，用生理盐水稀释至25mL，向50mL离心管中缓慢加入15mL淋巴细胞分离液，将稀释血液缓慢加在淋巴细胞分离液中，添加时防止两相混合；

2)将离心管置于离心机中，20℃，400g，离心力为450g，离心20分钟，升速为7，降速为0，离心结束后，取出离心管，使用移液管去掉上层液体，保留沉淀，加磷酸盐缓冲液至50mL，将离心管置于离心机中，4℃，400g，离心力为250g，离心8分钟，升速为9，降速为9，离心结束后，取出离心管，弃去上层液体，轻柔打散沉淀，通过磁珠分选出单核巨噬细胞；

3)将获取的单核巨噬细胞分为共培养组和对照组，单核巨噬细胞的浓度均为6×10⁵个/mL，向共培养组中加入脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞的数量与单核巨噬细胞的数量比为1:1，将共培养组和对照组放置于相同条件下培养，培养温度37℃，相对饱和湿度95％，CO₂浓度为5％；

4)培养7天后，用流式细胞术分别检测巨噬细胞CD163、CD204、CD206、HLA-DR的表达情况。

本实施例巨噬细胞表达情况如图1～4所示，从图中可以看出，相比于对照组，共培养组(图中的实验组)巨噬细胞上调了CD163、CD204、CD206的表达，下调了HLA-DR的表达，说明脐带间充质干细胞影响巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化的能力强、质量好，该脐带间充质干细胞调节组织再生的能力强。

对比例1

一种巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化的检测方法，与实施例1的区别在于，检测步骤中采用CD68与CD204、CD206对巨噬细胞进行染色，统计发现CD204阳性巨噬细胞、CD206阳性巨噬细胞占总巨噬细胞比例并不一致，共定位染色分析也发现存在CD204与CD206不共表达的细胞，表明单一的表面标记并不能完全的描述M2型巨噬细胞。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。