阅读说明：本技术 一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法 (Method for separating inherent and infiltrated macrophages of liver ) 是由 季菊玲 季煜华 沈宓 李静 何理 孙玉风 陆鹏 吕秀芳 于 2019-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法,包括如下步骤：(1)建立并鉴定小鼠异体骨髓移植模型,受体小鼠单核巨噬细胞表面标志物为CD45.2,供体小鼠单核巨噬细胞表面标志物为CD45.1；(2)IHC法和流式细胞术观察照射对肝脏实质细胞和固有巨噬细胞造成的影响；(3)原代分离照射移植组小鼠肝脏单个核细胞,根据供体和受体小鼠单核巨噬细胞表面标志物,流式细胞术分选肝脏固有和浸润巨噬细胞,并描述其数量、分布和表型。本发明通过照射去除CD45.2受体小鼠骨髓来源巨噬细胞,并以CD45.1供体小鼠骨髓补充替代受体小鼠骨髓细胞。从而保证骨髓来源的浸润巨噬细胞细胞和固有巨噬细胞具有不同的分子表型,达到准确高效分离肝脏不同来源巨噬细胞的效果。(The invention provides a method for separating inherent macrophages and infiltrated macrophages of a liver, which comprises the following steps: (1) establishing and identifying a mouse allogeneic bone marrow transplantation model, wherein the surface marker of the recipient mouse mononuclear macrophage is CD45.2, and the surface marker of the donor mouse mononuclear macrophage is CD 45.1; (2) IHC and flow cytometry observe the effects of irradiation on liver parenchymal cells and resident macrophages; (3) primary isolation irradiated transplantation group mouse liver mononuclear cells, flow cytometry sorting liver resident and infiltrating macrophages according to donor and recipient mouse mononuclear macrophage surface markers, and describing the number, distribution and phenotype of the liver resident and infiltrating macrophages. The invention removes CD45.2 acceptor mouse marrow-derived macrophages through irradiation and replaces acceptor mouse marrow cells with CD45.1 donor mouse marrow supplementation. Therefore, infiltrating macrophage cells and inherent macrophages from bone marrow are guaranteed to have different molecular phenotypes, and the effect of accurately and efficiently separating macrophages from different sources of the liver is achieved.)

一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法。

背景技术

肝脏不仅是重要的物质代谢场所，也是重要的免疫器官。肝脏巨噬细胞由固有和浸润巨噬细胞共同组成，表型和功能复杂，在维持肝脏正常生理功能以及各种毒物、药物和病原微生物引起的肝脏损伤以及各种肝脏代谢性疾病中发挥着重要作用，始终是肝脏病理研究的一个重要领域。

肝脏固有巨噬细胞与来源于外周血单核细胞的浸润巨噬细胞是具有不同起源和不同生物学功能的细胞群体。近年来研究表面肝脏损伤早期固有巨噬细胞数量减少，之后通过自身增殖补充，这种增殖与趋化到局部的外周血单核来源巨噬细胞无关。2014年，Zigmond等在急性肝损伤模型中，再次证实浸润的外周血单核细胞不参与损伤过程中肝脏固有巨噬细胞的补充，后者可自我更新。在肝脏损伤过程中，肝脏浸润巨噬细胞和固有巨噬细胞各自的作用尚不清楚，但是到目前还缺乏能有效区分肝脏浸润和固有巨噬细胞的表面标志物。现有方法多根据单核巨噬细胞表面标志物 F4/80和CD11b 表达的高低来区分不同来源肝脏巨噬细胞，但巨噬细胞是一个复杂的群体，浸润和固有巨噬细胞中可能同时存在F4/80和CD11b高表达或低表达的细胞，因此这两种标志物不能准确区分巨噬细胞来源。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法，有助于区分不同来源巨噬细胞，进而研究它们在肝脏局部损伤修复及免疫调控中作用的认识，为深入解析肝脏巨噬细胞在多种肝脏病理过程中的作用提供基础。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法，包括如下步骤：

（1）建立并鉴定小鼠异体骨髓移植模型，受体小鼠单核巨噬细胞表面标志物为CD45.2，供体小鼠单核巨噬细胞表面标志物为CD45.1；

（2）IHC法和流式细胞术观察照射对肝脏实质细胞和固有巨噬细胞造成的影响；

（3）原代分离照射移植组小鼠肝脏单个核细胞，根据供体和受体小鼠单核巨噬细胞表面标志物，流式细胞术分选肝脏固有和浸润肝脏巨噬细胞，并描述其数量、分布和表型。

其中，步骤（1）的具体步骤包括：

a.CD45.1的C57BL/6小鼠骨髓细胞的制备：

处死小鼠并消毒皮肤；

游离出小鼠四肢长骨，浸泡在RPMI-1640中；

剪去两端软骨，冲出骨髓腔内细胞；

反复吹打混匀细胞悬液，收集骨髓细胞悬液并过滤；

收集细胞悬液，250g离心10min，去上清，加红细胞裂解液2ml裂解红细胞，室温静置3min，400g离心5min，去上清；

所获细胞200μlPBS重悬，计数；

b.小鼠骨髓移植模型的建立：

照射移植组小鼠，经单次γ射线全身照射，破坏骨髓细胞，照射后继续饲抗生素水一周、标准饮食，在异氟烷麻醉下接受静脉注射骨髓细胞；

照射未移植小鼠，不做进一步处理，作为对照；

骨髓移植完毕，于动物中心屏障环境中继续观察，饮用抗生素水一周，后自由饮水，饲标准饮食。不接受骨髓移植的小鼠2周后全部死亡。

其中，步骤（2）的具体步骤包括：

a、C57BL/6小鼠随机分为阴性对照组（不接受照射）、照射后24h、48h、7d处理组，每组6只，饲养方式同前，一周后C57BL/6小鼠经单次γ射线全身照射，破坏骨髓细胞，照射后继续饲抗生素水一周、标准饮食，照射后收集照射24h、48h、7d处理组以及阴性对照组小鼠组织制作石蜡切片；

b、免疫组织化学：

60℃烤片8h；

脱蜡至水：常规二甲苯脱蜡20min×2次，梯度酒精脱水，无水乙醇5min×2次，95%乙醇5min×2次，80%乙醇5min×2次，70%乙醇5 min×2次，50%乙醇5min,流水冲洗1min；

抗原修复：将切片浸入装有0.01 M柠檬酸缓冲液（pH6.0）于电热锅中加热至沸腾持续10min，取出自然冷却至室温后用1×PBS冲洗5min×3次；

阻断内源性过氧化物酶：切片在30% H₂O₂甲醇溶液中浸泡10min，后用1×PBS冲洗5min×3次；

每张切片加入按1:100稀释后的一抗100ul，室温孵育1h后4℃过夜。阴性对照的切片则滴加1× PBS，次日取出室温静置1h后用1×PBS冲洗3 min×3次；

每张切片上加相应的二抗室温孵育1h，1×PBS冲洗3 min×3次；

显色：除去PBS，将切片滴加DAB工作液，同时在显微镜下观察控制显色程度，看到抗原明显表达时，则置流水下冲洗及时终止显色；

苏木素复染30s-2min，流水冲洗，1%盐酸-乙醇分化，流水冲洗；

脱水：70%乙醇3min， 80%乙醇3min，95%乙醇3min，无水乙醇3min，二甲苯1 min；

封片：中性树胶封片。

其中，步骤（3）的具体步骤包括：

a.原代肝脏单个核细胞的分离：

处死小鼠并消毒皮肤，固定于鼠板；

于原代培养超净工作台内，打开腹腔，暴露心脏和肝脏，心脏插管；

原位灌流D-Hanks液,灌流50ml液体，至肝脏表面变白，离体肝脏。将肝脏放入含青-链霉素的1×PBS液中清洗2次，放入无菌烧杯中；

于小烧杯中剪碎肝脏，37℃水浴中继以含有胶原酶（0.005%）以及Dnase（0.005%）的消化液消化35min；

细胞悬液经200目滤网过滤；

滤液均匀分至离心管中，4℃离心47g，5min.吸取上清至新的离心管；

400g离心8min,弃上清留沉淀。细胞沉淀加10ml 1×PBS 重悬，重复离心一次；

细胞沉淀以25%percoll、50%percoll梯度密度离心，4℃，400g，30min；

吸取50%、25%percoll间的悬浮细胞至新的离心管中，加1×PBS液8ml重悬，经4℃、400g离心8min，弃上清留取沉淀，如此重复一次；所得沉淀加200ul 1×PBS重悬后计数；

b.流式细胞分选：

细胞以适量CSB重悬，加入CD16/32抗体（10^6个细胞加入0.5ul），冰上封闭5-10min；

加入10ul的流式分选对应抗体，4℃避光孵育20min；

加入红细胞裂解液1ml 室温孵育5min ，350g 离心5min，弃上清；

沉淀以0.5ml Cell Staining Buffer（CSB） 重悬，加入7-AAD（10⁷个细胞加入5ul），避光孵育3-5min；经流式细胞仪分选；

c、流式细胞仪检测的细胞表面表示：未经照射移植的野生型小鼠正常肝脏中CD45.2CD11b阳性单核巨噬细胞细胞中可见两个亚群，分别为F4/80^hiCD11b^low, F4/80^lowCD11b^hi；骨髓移植小鼠肝脏中CD11b 阳性单核巨噬细胞中约28.7%为来自受体的CD45.2阳性固有巨噬细胞，67.5%为来自供体的CD45.1阳性单核巨噬细胞；来自受体的CD45.2阳性巨噬细胞表型为F4/80^hiCD11b^low，接近典型固有巨噬细胞；自供体的CD45.1阳性巨噬细胞表型为F4/80^lowCD11b^hi，接近浸润单核细胞。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

1、本发明采用异体骨髓移植小鼠建立急性肝损伤模型，有效分离肝损伤过程中肝脏内的这两群细胞，并研究其数量、表型和生物学功能的动态变化。本发明的分离方法有助于区分不同来源巨噬细胞，进而研究它们在肝脏局部损伤修复及免疫调控中作用的认识，为深入解析肝脏巨噬细胞在多种肝脏病理过程中的作用提供基础。

2、本发明通过照射去除CD45.2受体小鼠骨髓来源巨噬细胞，并以CD45.1供体小鼠骨髓补充替代受体小鼠骨髓细胞。从而保证骨髓来源巨噬细胞细胞和固有巨噬细胞具有不同的分子表型，达到准确高效分离肝脏不同来源巨噬细胞的效果。

3、骨髓移植小鼠肝脏巨噬细胞由受体肝脏固有巨噬细胞和供体骨髓来源巨噬细胞共同组成，本发明的分离方法可用于生理状态和肝损伤状态下肝脏巨噬细胞来源和功能特点的研究。

附图说明

图1为本发明中建立小鼠异体骨髓移植模型示意图；

图2为照射24h及48h 后，肝脏组织形态基本正常，CD68阳性细胞数较未照射组减少，7d时，CD68阳性细胞数显著增高的示意图；

图3为C57BL/6小鼠原代肝脏巨噬细胞的分离和鉴定示意图；

图4为流式检测单纯骨髓移植小鼠和未移植野生型小鼠中巨噬细胞的数量和表型的示意图；

图5为本发明中小鼠异体骨髓移植6周后，CD45.2受体小鼠外周血单核细胞的流式检测结果示意图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明提供了一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法，包括如下步骤：

（1）建立并鉴定小鼠异体骨髓移植模型（如图1所示），受体小鼠单核巨噬细胞表面标注物为CD45.2，供体小鼠单核巨噬细胞表面标志物为CD45.1；具体步骤包括：

a.CD45.1的C57BL/6小鼠骨髓细胞的制备：

处死小鼠并消毒皮肤；

游离出小鼠四肢长骨，浸泡在RPMI-1640中；

剪去两端软骨，冲出骨髓腔内细胞；

反复吹打混匀细胞悬液，收集骨髓细胞悬液并过滤；

收集细胞悬液，250g离心10min，去上清，加红细胞裂解液2ml裂解红细胞，室温静置3min，400g离心5min，去上清；

所获细胞200μlPBS重悬，计数。

b.小鼠骨髓移植模型的建立：

照射移植组小鼠，经单次γ射线全身照射，破坏骨髓细胞，照射后继续饲抗生素水一周、标准饮食，在异氟烷麻醉下接受静脉注射骨髓细胞；

照射未移植小鼠，不做进一步处理，作为对照；

骨髓移植完毕，于动物中心屏障环境中继续观察，饮用抗生素水一周，后自由饮水，饲标准饮食。不接受骨髓移植的小鼠2周后全部死亡。

（2）IHC法和流式细胞术观察照射对肝脏实质细胞和固有巨噬细胞造成的影响；具体步骤包括：

a、C57BL/6小鼠随机分为阴性对照组（不接受照射）、照射后24h、48h、7d处理组，每组6只，饲养方式同前，一周后C57BL/6小鼠经单次γ射线全身照射，破坏骨髓细胞，照射后继续饲抗生素水一周、标准饮食，照射后收集照射24h、48h、7d处理组以及阴性对照组小鼠组织制作石蜡切片。

b、免疫组织化学：

60℃烤片8h；

脱蜡至水：常规二甲苯脱蜡20min×2次，梯度酒精脱水，无水乙醇5min×2次，95%乙醇5 min×2次，80%乙醇5 min×2次，70%乙醇5 min×2次，50%乙醇5min,流水冲洗1min；

抗原修复：将切片浸入装有0.01 M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）于电热锅中加热至沸腾持续10 min，取出自然冷却至室温后用1×PBS冲洗5 min×3次；

阻断内源性过氧化物酶：切片在30% H₂O₂甲醇溶液中浸泡10min，后用1×PBS冲洗5min×3次；

每张切片加入按1:100稀释后的一抗100ul，室温孵育1h后4 ℃过夜。阴性对照的切片则滴加1×PBS，次日取出室温静置1h后用1×PBS冲洗3 min×3次；

每张切片上加相应的二抗室温孵育1h，1×PBS冲洗3min×3次；

显色：除去PBS，将切片滴加DAB工作液，同时在显微镜下观察控制显色程度，看到抗原明显表达时，则置流水下冲洗及时终止显色；

苏木素复染30s-2min，流水冲洗，1%盐酸-乙醇分化，流水冲洗；

脱水：70%乙醇3min， 80%乙醇3min，95%乙醇3min，无水乙醇3min，二甲苯1 min；

封片：中性树胶封片。

如图2所示为照射24h及48h 后，肝脏组织形态基本正常，CD68阳性细胞数较未照射组减少，7d时，CD68阳性细胞数显著增高（P < 0.0001）。

（3）原代分离照射移植组小鼠肝脏单个核细胞，根据供体和受体小鼠单核巨噬细胞表面标志物，流式细胞术分选肝脏固有和浸润肝脏巨噬细胞，并描述其数量、分布和表型；具体步骤包括：

a.原代肝脏单个核细胞的分离：

处死小鼠并消毒皮肤，固定于鼠板；

于原代培养超净工作台内，打开腹腔，暴露心脏和肝脏，心脏插管；

原位灌流D-Hanks液,灌流50ml液体，至肝脏表面变白，离体肝脏。将肝脏放入含青-链霉素的1×PBS液中清洗2次，放入无菌烧杯中；

于小烧杯中剪碎肝脏，37℃水浴中继以含有胶原酶（0.005%）以及Dnase（0.005%）的消化液消化35min；

细胞悬液经200目滤网过滤；

滤液均匀分至离心管中，4℃离心47g,5min.吸取上清至新的离心管；

400g离心8min,弃上清留沉淀。细胞沉淀加10ml 1×PBS 重悬，重复离心一次；

细胞沉淀以25%percoll、50%percoll梯度密度离心，4℃，400g，30min；

吸取50%、25%percoll间的悬浮细胞至新的离心管中，加1×PBS液8ml重悬，经4℃、400g离心8min，弃上清留取沉淀，如此重复一次；所得沉淀加200ul 1×PBS重悬后计数。

b.流式细胞分选：

细胞以适量CSB重悬，加入CD16/32抗体（10⁶个细胞加入0.5ul）冰上封闭5-10min

后加入10ul的流式分选对应抗体，4℃避光孵育20min；

加入红细胞裂解液1ml 室温孵育5min ，350g 离心5min，弃上清；

沉淀以0.5ml Cell Staining Buffer（CSB） 重悬，加入7-AAD（10⁷个细胞加入5ul），避光孵育3-5min；经流式分选仪分选。

如图3所示为C57BL/6小鼠原代肝脏巨噬细胞的分离和鉴定: 图3A. 50%与25%percoll间见一层悬浮细胞为肝脏巨噬细胞细胞，箭头所指。图3B. 流式鉴定，成功获得CD45+ F4/80+ 肝脏巨噬细胞；图3C.原代小鼠肝脏巨噬细胞培养24h，Bright field ×100倍视野。

如图4所示为流式检测单纯骨髓移植小鼠和未移植野生型小鼠中巨噬细胞的数量和表型。流式细胞仪检测的细胞表面表示：未经照射移植的野生型小鼠正常肝脏中CD45.2CD11b阳性单核巨噬细胞细胞中可见两个亚群，分别为F4/80^hiCD11b^low, F4/80^lowCD11b^hi；骨髓移植小鼠肝脏中CD11b 阳性单核巨噬细胞中约28.7%为来自受体的CD45.2阳性固有巨噬细胞，67.5%为来自供体的CD45.1阳性单核巨噬细胞；来自受体的CD45.2阳性巨噬细胞表型为F4/80^hiCD11b^low，接近典型固有巨噬细胞；自供体的CD45.1阳性巨噬细胞表型为F4/80^lowCD11b^hi，接近浸润单核细胞。以上结果提示，照射未完全破坏肝脏固有巨噬细胞，同时照射造成的肝脏损伤可吸引外周血单核细胞进入肝脏，分化为巨噬细胞。本模型符合天然状态下肝脏内巨噬细胞的组成，是开展后续研究的理想模型。

本发明利用不同CD45 表型的小鼠进行异体骨髓移植，使得该模型中组织固有巨噬细胞和外周血单核细胞来源的浸润巨噬细胞具有不同的CD45表面标志。通过流式分选可有效区分肝脏中的固有(CD45.2+)和浸润(CD45.1+ )巨噬细胞。目前我们已建立供体为CD45.1，受体为CD45.2的C57BL/6小鼠异体骨髓移植模型。如图5所示：移植6周后，CD45.2受体小鼠外周血单核细胞的流式检测结果（CD45.2 C57BL/6 为野生型小鼠，CD45.1/CD45.2C57BL/6 为接受CD45.1 小鼠骨髓移植的CD45.2 小鼠）。

本发明通过照射去除CD45.2受体小鼠骨髓来源巨噬细胞，并以CD45.1供体小鼠骨髓补充替代受体小鼠骨髓细胞。从而保证骨髓来源巨噬细胞细胞和固有巨噬细胞具有不同的分子表型，达到准确高效分离肝脏不同来源巨噬细胞的效果。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。