一种多细胞和人肝微粒体共培养方法、共培养培养基及其应用
阅读说明：本技术 一种多细胞和人肝微粒体共培养方法、共培养培养基及其应用 (Co-culture method of multicellular and human liver microsome, co-culture medium and application thereof ) 是由 华辰凤 尚平平 史清照 赵俊伟 李翔 谢复炜 赵阁 秦亚琼 刘惠民 于 2021-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种多细胞和人肝微粒体共培养方法、共培养培养基及其应用。本发明提供了多细胞和人肝微粒体共培养方法,包括收集细胞、接种细胞、装载人肝微粒体以及共培养步骤,首次实现了Beas-2b、HUVEC、人肺巨噬细胞和人肝微粒体的体外共培养,为表征肺、血液循环、肝脏共同参与的暴露和代谢后再次损伤的研究奠定了基础。(The invention relates to a cocultivation method of multicellular and human liver microsome, a cocultivation medium and application thereof. The invention provides a method for co-culturing multicellular and human liver microsome, which comprises the steps of collecting cells, inoculating cells, loading human liver microsome and co-culturing, realizes the in-vitro co-culturing of Beas-2b, HUVEC, human lung macrophage and human liver microsome for the first time, and lays a foundation for representing the research of lung, blood circulation, exposure of liver participation and secondary injury after metabolism.)
技术领域
本发明属于体外多种细胞共培养技术领域，具体涉及一种多细胞和人肝微粒体共培养方法、共培养培养基及其应用。
背景技术
可吸入污染物如烟气、汽车尾气、大气PM2.5可从口鼻吸入，经气管在肺部暴露后，通过血液循环系统到达人体各组织脏器对机体肺、心等器官产生损伤；其中部分吸入污染物经肝脏代谢解毒或活化后，可再次进入血液循环作用各脏器造成二次损伤。当前对于可吸入污染物的体外细胞毒性作用多集中于单一细胞或单一器官，或者单次损伤如暴露损伤或代谢后损伤，但是对于表征肺、血液循环、肝脏共同参与的暴露和代谢后再次损伤作为一个整体的研究较少。
人肺巨噬细胞作为先天免疫细胞，形成抵御外部损伤的第一道防线，在肺部炎症反应的发生、进展、消退和组织修复中起关键作用；Beas-2b(Human Bronchial EpithelialCells，Beas-2b)是永生化的人正常支气管上皮细胞，并具有间充质干细胞特性，被广泛用于汽车尾气、大气PM2.5等引起的呼吸系统损伤的体外建模研究中；人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)是血管内皮细胞的一种，广泛用于血管建模、炎症、药理和肿瘤研究中，如可吸入污染物如大气PM2.5等对血管损伤的研究。人肝微粒体具有完整的I相代谢酶(如细胞色素P450、黄素单加氧酶、单胺氧化酶等)，II相代谢酶(如葡萄糖醛酸转移酶，硫酸基转移酶)、酯酶等，能够在体外较好的模拟外源物在体内的代谢。
实现三种细胞与肝微粒体共培养，是进行表征肺、血液循环、肝脏共同参与的暴露和代谢后再次损伤研究的前提。但是，三种细胞与肝微粒在机体的存在部位和在体外培养中的培养环境均不同，由于不同细胞具有不同的细胞生长环境，因而根据参与的细胞确定共培养环境从而保证Beas-2b，HUVEC，人肺巨噬细胞和人肝微粒体独立又统一的共培养存在形式是急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多细胞和人肝微粒体共培养方法，该方法能够在体外实现Beas-2b、HUVEC、人肺巨噬细胞和人肝微粒体独立又统一的共培养。
本发明的第二个目的在于提供上述方法的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种共培养培养基。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种多细胞和人肝微粒体共培养方法，包括以下步骤：
1)使用共培养培养基分别和Beas-2b、HUVEC、人肺巨噬细胞配制Beas-2b细胞悬液、HUVEC细胞悬液和人肺巨噬细胞悬液；
所述共培养培养基由基础培养基和胎牛血清、二甲胺四环素盐酸盐、青霉素、链霉素组成，其中，所述二甲胺四环素盐酸盐的终浓度为2-3μg/mL，所述青霉素的终浓度为80-120U/mL，所述链霉素的终浓度为80-120μg/mL；所述基础培养基为DMEM培养基；
2)将Beas-2b细胞悬液接种于第一Transwell小室上，HUVEC细胞悬液接种于第二Transwell小室上，由人肝微粒体、NADPH再生系统和所述共培养培养基组成的人肝微粒体混合液装载至透析袋内，然后将第一Transwell小室、第二Transwell小室、透析袋共同置于人肺巨噬细胞悬液中进行共培养。
本发明的方法，提供三种细胞和肝微粒体独立又统一的培养和共孵育形式，利用有孔的Transwell和透析袋，既隔离了细胞与细胞，细胞与肝微粒体的直接接触，又使细胞与肝微粒体分泌或代谢物质互通，能够在体外较好的模拟外源物在体内的代谢。
优选的，步骤1)所述共培养培养基中，胎牛血清的体积终浓度为8-12％。更优的，胎牛血清的体积终浓度为10％，二甲胺四环素盐酸盐的终浓度为2.5μg/mL，青霉素的终浓度为100U/mL，链霉素的终浓度为100μg/mL。
优选的，步骤2)中，Beas-2b和HUVEC细胞的接种浓度均为20×104个/mL，人肺巨噬细胞的浓度为5×104个/mL。
优选的，步骤3)中，所述人肝微粒体混合液中，人肝微粒体的终浓度为1mg/mL，NADPH再生系统的体积终浓度为6％，胎牛血清的体积终浓度为8-12％。NADPH再生系统由A液、B液按体积比5:1的比例混合配制。
优选的，所述步骤3)中透析袋的截留分子量为3.5-5KD。
上述多细胞和人肝微粒体共培养方法在可吸入外源物的暴露、代谢研究方面的应用，向共培养体系中引入可吸入外源物。
可利用上述共培养方法模拟可吸入外源物经肺细胞暴露，肝微粒体代谢，模拟了人体经呼吸暴露外源物(如烟气)、血液循环、肝脏代谢这一过程。
优选的，使用可吸入外源物染毒Beas-2b细胞，模拟可吸入物经肺、血液循环、肝脏共同参与的暴露和代谢过程。
优选的，所述可吸入外源物为烟气、汽车尾气、大气PM2.5、药物喷雾剂、有毒气体或气溶胶。
一种共培养培养基，所述共培养培养基由基础培养基和胎牛血清、二甲胺四环素盐酸盐、青霉素、链霉素组成，其中，所述二甲胺四环素盐酸盐的终浓度为2-3μg/mL，所述青霉素的终浓度为80-120U/mL，所述链霉素的终浓度为80-120μg/mL；所述基础培养基为DMEM培养基。
优选的，胎牛血清的体积终浓度为8-12％。
本发明提供了多细胞和人肝微粒体共培养方法，首次实现了Beas-2b、HUVEC、人肺巨噬细胞和人肝微粒体的体外共培养，为表征肺、血液循环、肝脏、免疫应答共同参与的暴露和代谢后再次损伤的研究奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例1构建的共培养系统示意图；
其中，1-Beas-2b Transwell小室，2-HUVEC Transwell小室，3-人肝微粒体用透析袋，4-培养仓，5-人肺巨噬细胞悬液，6-小室膜；
图2为Beas-2b细胞在Beas-2b常用培养基下的细胞形态；
图3为Beas-2b细胞在HUVEC常用培养基下的细胞形态；
图4为Beas-2b细胞在巨噬细胞常用培养基下的细胞形态；
图5为Beas-2b细胞在本发明共培养培养基下的细胞形态；
图6为巨噬细胞在Beas-2b常用培养基下的细胞形态；
图7为巨噬细胞在HUVEC常用培养基下的细胞形态；
图8为巨噬细胞在巨噬细胞常用培养基下的细胞形态；
图9为巨噬细胞在本发明共培养培养基下的细胞形态；
图10为HUVEC在Beas-2b常用培养基下的细胞形态；
图11为HUVEC在HUVEC常用培养基下的细胞形态；
图12为HUVEC在巨噬细胞常用培养基下的细胞形态；
图13为HUVEC在本发明共培养培养基下的细胞形态；
图14为二甲胺四环素盐酸盐对含有人肝微粒体共培养体系的对比试验；
图15为本发明试验例3构建的共培养/共孵育系统示意图；
其中，1-Beas-2b Transwell小室，2-HUVEC Transwell小室，3-人肝微粒体用透析袋，4-培养仓，40-培养仓盖体，5-人肺巨噬细胞悬液，6-小室膜，7-循环泵，8-水浴装置，9-进气口，10-出气口，11-三通管。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；实施例及试验例中所用的各类培养基、试剂、细胞系试剂等均为市售商品。人肝微粒体，购自汇智泰康生物技术有限公司。
实施例1 Beas-2b，HUVEC，人肺巨噬细胞和人肝微粒体共培养方法
该实施例提供了一种Beas-2b，HUVEC，人肺巨噬细胞和人肝微粒体共培养方法，包括以下步骤：
1)配制共培养培养基；
配制无菌的体积终浓度为10％FBS(v/v)(Gbico，北美优级)，终浓度为2.5μg/mL的无菌二甲胺四环素盐酸盐，终浓度为100U/mL的无菌青霉素和终浓度为100μg/mL的无菌链霉素的DMEM(Gbico，11965092)培养基溶液。
2)制作装载人肝微粒体的透析袋；
将市售生物技术级再生纤维素膜(3.5-5KD截留分子量、10mm宽度、耐温极限为60℃)利用塑封机塑封成U形开口的透析袋。利用在袋子中加入无菌去离子水后指压法观察袋子是否渗漏，将不渗漏的透析袋其依次浸泡于95％酒精、75％酒精、75％酒精、75％酒精、无菌去离子水、无菌去离子水、无菌去离子水、无菌去离子水、无菌去离子水中各10、10、10、10、10、10、5、5、5min待用。
3)配制代谢用人肝微粒体混合液；
配制终浓度分别为10％FBS(v/v)，2.5μg/mL的无菌二甲胺四环素盐酸盐，100U/mL的无菌青霉素，100μg/mL的无菌链霉素，1mg/mL的人肝微粒体(汇智泰康生物技术有限公司)，6％(v/v)NADPH再生系统A+B混合液的DMEM培养基溶液。现用现配。
4)收集细胞；
收集待传代Beas-2b，HUVEC和人肺巨噬细胞，利用共培养培养基重悬至终密度分别20×104个/mL，20×104个/mL和5×104个/mL的细胞悬液。
5)接种细胞；
将20×104个/mL的Beas-2b和20×104个/mL的HUVEC分别接种于Transwell小室上，12孔，6孔Transwell小室加入细胞悬液体积分别约为0.5mL，1.5mL。将Beas-2b小室和HUVEC小室置于液体可互相流通的培养皿或培养仓中。将人肺巨噬细胞接种于该培养皿或培养仓中，加入细胞悬液的液面高度浸没Transwell小室膜，并低于Transwell小室内液面高度。
6)装载人肝微粒体；
将配制代谢用人肝微粒体装载至无菌透析袋内，体积为1-2mL。并将装载有人肝微粒体的透析袋置于共培养的培养皿或培养仓中。培养皿或培养仓中液面应浸没透析袋液体垂直高度的2/3以上。
根据以上步骤构建的共培养系统如图1所示，包括Beas-2b Transwell小室1，HUVEC Transwell小室2，人肝微粒体用透析袋3和培养仓4；培养仓4包括下部主体和上部盖体，Beas-2b Transwell小室1，HUVEC Transwell小室2，人肝微粒体用透析袋3搭载在下部主体上，培养仓4内盛装人肺巨噬细胞悬液5，人肺巨噬细胞悬液5的液面高度高于Transwell小室的小室膜6。
7)共培养。
根据实验目的，在Beas-2b，HUVEC，人肺巨噬细胞的细胞和或人肝微粒体的独立空间中加入或不加受试物，然后将装载有Beas-2b，HUVEC，人肺巨噬细胞和人肝微粒体的培养板置于培养箱中孵育培养。
实施例2共培养培养基
该实施例提供了一种培养基，由基础培养基、胎牛血清、二甲胺四环素盐酸盐、青霉素和链霉素，基础培养基为DMEM培养基，胎牛血清的体积终浓度为10％，二甲胺四环素盐酸盐的终浓度为2.5μg/mL，青霉素的终浓度为100U/mL，链霉素的终浓度为100μg/mL。该培养基能够应用于Beas-2b，HUVEC，人肺巨噬细胞和人肝微粒体的共培养。
试验例1共培养培养基对Beas-2b、HUVEC、人肺巨噬细胞的细胞形态试验
用本发明实施例2提供的共培养培养基分别培养Beas-2b、HUVEC，人肺巨噬细胞三种细胞，并采用Beas-2b、HUVEC、人肺巨噬细胞常用培养基作为对照，对比细胞形态变化。
选取生长状态良好的指数期HUVEC、Beas-2b和人肺巨噬细胞，分别用不同培养基(ECM完全培养基，BEGM完全培养基，DMEM完全培养基，共培养培养基)制成细胞悬液，并调节细胞浓度分别为5.0×104个/mL。每孔1.5mL接种于12孔板中，每种培养基的HUVEC、Beas-2b和人肺巨噬细胞设置3个复孔。细胞培养板在37℃、5％CO2培养箱内孵育培养，显微镜观察细胞形态。
24h后显微镜下观察细胞形态。Beas-2b、HUVEC，人肺巨噬细胞常用培养基为表1中每种细胞对应的完全培养基。
表1三种细胞常用培养基
试验结果如图2-13所示，Beas-2b在其常用培养基下呈现梭形，是其正常的细胞形态(图2)；在HUVEC常用培养基下呈现鹅卵石形，细胞形态发生变化(图3)；在巨噬细胞常用培养基(图4)以及在本发明共培养培养基(图5)下呈现梭形，提示巨噬细胞常用培养基以及本发明共培养培养基可维持Beas-2b细胞的良好细胞形态。
人肺巨噬细胞在其常用培养基下呈现圆形抱团样生长形态，是其正常的细胞生长形态(图8)；在Beas-2b和HUVEC常用培养基下细胞形态部分发生非圆形形状，细胞形态发生变化(图6、7)；在本发明共培养培养基中呈现圆形抱团样生长形态(图9)，提示发明共培养培养基可维持人肺巨噬细胞的良好细胞形态。
HUVEC在其常用培养基下呈现铺路鹅卵石形态，是其正常的细胞培养状态(图11)；在Beas-2b常用培养基下呈现梭形，细胞形态发生变化(图10)；在巨噬细胞常用培养基以及在发明共培养培养基下呈现铺路鹅卵石形态(图12、图13)，提示巨噬细胞常用培养基以及在发明共培养培养基可维持HUVEC的良好细胞形态。
比较发明共培养培养基与巨噬细胞常用培养基成分，共培养培养基比巨噬细胞常用培养基多了一个2.5μg/mL的无菌二甲胺四环素盐酸盐成分，提示2.5μg/mL的无菌二甲胺四环素盐酸盐不影响三种细胞的生长形态。最后，发明共培养培养基可维持三种细胞的共同生长。
试验例2二甲胺四环素盐酸盐对含有人肝微粒体共培养体系的对比试验
人的肝源很难保证无菌，在制备人源肝微粒体时，几乎无法获得无菌的肝微粒。共培养时，如不加控制，人肝微粒体中的污染源会对细胞的无菌环境造成影响，造成细胞的正常生长难以维系。
配制培养基溶液，培养基溶液由终浓度为100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的BEGMBulletKit组成。分别配制仅含有25供体人肝微粒体的培养基溶液(对照组)以及终浓度为200mg/L红霉素溶液(深圳子科生物科技有限公司；红霉素组)、25mg/L氯霉素(碧云天公司；氯霉素组)和2.5mg/L二甲胺四环素盐酸盐(碧云天公司；二甲胺四环素盐酸盐组)的含25供体人肝微粒体的培养基溶液。
将指数生长期的Beas-2b悬液(5×104个/mL)接种于6孔板，细胞贴壁后，移除细胞上清液，分别加入五种溶液分别用于培养Beas-2b细胞，记为培养基组(a)、对照组(b)、红霉素组(c)、氯霉素组(d)和二甲胺四环素盐酸盐组(e)，48h后观察细胞形态，结果如图4所示。
由图14可知，对照组(b)、红霉素组(c)和氯霉素组(d)均不见生长良好细胞、呈现污染状态；二甲胺四环素盐酸盐组(e)可见生长良好细胞、无污染状态，且与培养基组(a)细胞形态一致，提示二甲胺四环素盐酸盐组可抑制本实验肝微粒体中的污染源且不影响细胞的生长。
本实验例以BEGM BulletKit培养基为例说明了二甲胺四环素盐酸盐的应用情形，本发明的DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素组成的培养基的性质与上述培养基组的情形基本相同。
试验例3卷烟烟气在Beas-2b，HUVEC，人肺巨噬细胞和人肝微粒体共孵育下的细胞毒性
使用如图15所示的共培养/共孵育系统考察卷烟烟气在Beas-2b，HUVEC，人肺巨噬细胞和人肝微粒体共孵育下的细胞毒性，该系统包括Beas-2b Transwell小室1、HUVECTranswell小室2、人肝微粒体用透析袋3和培养仓4，培养仓4包括培养仓主体和培养仓盖体40，培养仓主体分内槽和外槽，外槽可注水，37℃孵育；内槽可放置小室，透析袋以及人肺巨噬细胞悬液5，内槽内人肺巨噬细胞悬液5的高度高于小室膜6，内槽内液体利用循环泵7实现循环流动，利用三通管11实现换液；外槽连接有水浴装置8，来实现对内槽内孵育温度的控制。各小室上设置有进气口9和出气口10，以实现染毒和保持小室内压力平衡。
实验过程如下：
1)将共培养/共孵育装置(培养仓4)与循环泵和水浴泵连接，保证连接不漏水。
2)调整水浴泵中水温度为37℃，水浴泵向共培养/共孵育装置外槽注入37℃循环水。
3)紫外灭菌共培养/共孵育装置30min，将75％酒精加入共培养/共孵育装置内槽中注满，注满过程中打开循环泵7，保证整个管路均有酒精，分别3次，每次10min；废液由三通管11排出。将PBS溶液加入共培养/共孵育装置内槽中注满，注满过程中打开循环泵7，保证整个管路均有PBS，分别5次，每次5min；
4)使用共培养/共孵育装置对细胞共培养或共孵育，共培养/共孵育时，循环泵流速为1ml/min。
将共孵育的Beas-2b、HUVEC、人肺巨噬细胞和灭活人肝微粒体的Beas-2b的小室中分别暴露0剂量的烟气和1/2口剂量的烟气，分别记为无肝微粒体对照组和无肝微粒体烟气组；期间，循环泵的流速为1mL/min，循环泵提供动力以加速共培养/孵育体系中液体的交换。
共孵育的Beas-2b、HUVEC，人肺巨噬细胞和人肝微粒体的Beas-2b的小室中分别暴露0剂量的烟气和1/2口剂量的烟气，分别记为肝微粒体对照组和肝微粒体烟气组，期间，循环泵的流速为1mL/min。暴露结束后，孵育培养24h后，利用CCK-8检测各细胞的细胞存活率。
表2各组中各细胞存活率
分组
Beas-2b(％)
HUVEC(％)
人肺巨噬细胞(％)
灭活肝微粒体对照组
100
100
100
灭活肝微粒体烟气组
38
89
95
肝微粒体对照组
100
100
100
肝微粒体烟气组
82
95
123
注：*灭活条件：100℃高温煮沸5min
由表2可知，在无肝微粒体的Beas-2b、HUVEC，人肺巨噬细胞和灭活人肝微粒体共孵育下，烟气从Beas-2b小室染毒后，可经Transwell膜扩散至HUVEC和人肺巨噬细胞所处的环境中，引起HUVEC和人肺巨噬细胞的损伤，提示这一过程可模拟可吸入物经肺-血液循环的过程。
在有活性肝微粒体的Beas-2b、HUVEC，人肺巨噬细胞和人肝微粒体的共孵育下，烟气从Beas-2b小室染毒后，Beas-2b、HUVEC和人肺巨噬细胞的细胞存活率显著高于灭活肝微粒体烟气组的三种细胞的细胞存活率，提示有活性的肝微粒体的存在对烟气进行了一定的代谢活化。提示在发明的共培养的细胞培养基下Beas-2b、HUVEC，人肺巨噬细胞与人肝微粒体可良好的共孵育进行受试物体外代谢，进而影响细胞的存活率。