构建动脉粥样硬化过程中体外泡沫细胞形成模型的方法
阅读说明：本技术 构建动脉粥样硬化过程中体外泡沫细胞形成模型的方法 (Method for constructing in-vitro foam cell forming model in atherosclerosis process ) 是由 穆玉明 袁晨 关丽娜 刘丽云 拜合提亚·塔依尔 吴治胜 于 2021-06-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及细胞模型构建方法技术领域,是一种构建动脉粥样硬化过程中体外泡沫细胞形成模型的方法,其在Transwell小室培养内皮细胞和巨噬细胞得到两种细胞共培养体系,向这两种细胞共培养体系添加TNF-α和ox-LDL得到泡沫细胞诱导体系并培养得到含有泡沫细胞的细胞培养体系,即为泡沫细胞形成模型。以该泡沫细胞形成模型能够模拟体外动脉粥样硬化早期形成过程,该构建泡沫细胞形成模型的方法相较于现有模型构建方法,可明显减少造模时间及经费消耗,为动脉粥样硬化诊治过程提供一种新的可供选择的体外细胞筛选模型。(The invention relates to the technical field of cell model construction methods, in particular to a method for constructing an in-vitro foam cell formation model in an atherosclerosis process. Compared with the existing model construction method, the method for constructing the foam cell formation model can obviously reduce the molding time and the expenditure consumption, and provides a new optional in-vitro cell screening model for the atherosclerosis diagnosis and treatment process.)
技术领域
本发明涉及细胞模型构建方法技术领域，是一种构建动脉粥样硬化过程中体外泡沫细胞形成模型的方法。
背景技术
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）严重危害人类健康和生命，AS所致的心、脑血管疾病目前依然是一个严重的公众健康问题，其发病率和死亡率均居各类疾病之首。AS是多因素参与的血管壁的慢性炎症过程，在出现明显临床症状前已产生并进展数十年。由于其具有隐匿性和潜在的危害性，早期诊断AS病变、以便采取及时有效的预防、控制与治疗手段，对改善患者的生活质量和预后有着重要的临床意义。
近年来已有的研究证明在动脉粥样硬化的发生和发展过程中，慢性炎症反应是一个极为重要的因素。血管内皮细胞损伤及内皮功能障碍是动脉粥样硬化发生的始动环节，其损害出现在明显的病理改变之前。其损伤后会分泌多种黏附分子、趋化因子及组织因子来诱发和促进血管内膜发生炎症反应。随后募集到病灶处的单核细胞分化为巨噬细胞开始吞噬沉积在内膜下的ox-LDL，随着巨噬细胞内累积的ox-LDL逐渐增加，引起细胞内胆固醇晶体成核，溶酶体稳定遭破坏，导致胆固醇外排障碍，胆固醇代谢失衡，巨噬细胞泡沫化，细胞功能受损。
目前使用的动物模型制备方法可产生自发性AS，但由于实验动物的购买、饲养费用昂贵，同时可供研究的组织标本太少，导致时间成本和经费预算较高，因此选择动物模型进行实验研究尚存在一定的局限性。目前，已有学者通过自制的可机械拉伸的细胞培养装置中从下至上依次培养平滑肌细胞、内皮细胞和单核细胞，得到多细胞共培养体系，但是目前介于泡沫细胞形成的主要原理是巨噬细胞RAW264.7（MΦ）内胆固醇酯含量超过60%，基于此，本发明使用共培养小室仅保留内皮细胞和巨噬细胞层，简化了实验步骤和程序并优化了经济效应，通过本研究若能在体外采用细胞模拟AS形成过程构建泡沫细胞形成模型，对研究动脉粥样硬化早期发生机制并进行实验分组并有效开展实验具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种构建动脉粥样硬化过程中体外泡沫细胞形成模型的方法，克服了上述现有技术之不足，其通过培养受损内皮-巨噬细胞体外共培养体系制备出可诱导泡沫细胞形成的泡沫细胞形成模型，以模拟体外动脉粥样硬化早期形成过程。
本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种构建动脉粥样硬化过程中体外泡沫细胞形成模型的方法，包括在Transwell小室的上、下两室分别培养内皮细胞和巨噬细胞得到两种细胞共培养体系，向这两种细胞共培养体系添加TNF-α（肿瘤坏死因子）和 ox-LDL（氧化低密度脂蛋白）得到泡沫细胞诱导体系，培养所述泡沫细胞诱导体系，得到含有泡沫细胞的细胞培养体系，含有泡沫细胞的细胞培养体系即为泡沫细胞形成模型。
下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：
所述内皮细胞可为人源脐静脉内皮细胞，所述内皮细胞具体可为人脐静脉内皮细胞HUVEC，或者其它人源血管内皮细胞。
所述巨噬细胞可为巨噬细胞系，所述巨噬细胞具体可为RAW264.7巨噬细胞系。
所述构建动脉粥样硬化过程中体外泡沫细胞形成模型的方法，具体地，按下述方法进行：在Transwell小室的上室培养所述人脐静脉内皮细胞（HUVEC），在Transwell小室的下室培养所述RAW264.7巨噬细胞（MΦ），Transwell小室的上室与下室通过上室底部相通，所述人脐静脉内皮细胞培养48小时、所述RAW264.7巨噬细胞培养24小时后，将两者的培养基替换为含有重组肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和ox-LDL的M199培养基后得到泡沫细胞诱导体系，泡沫细胞诱导体系培养24小时得到含有泡沫细胞的细胞培养体系，即泡沫细胞形成模型。
所述人脐静脉内皮细胞先培养24小时，然后与RAW264.7巨噬细胞共同培养24小时后，再将两者的培养基替换为含有TNF-α和ox-LDL的M199培养基继续培养。
所述人脐静脉内皮细胞的接种密度可为5.0×104个/ml，所述RAW264.7巨噬细胞的接种密度可为2.0×104个/ml。
人脐静脉内皮细胞和RAW264.7巨噬细胞的接种密度尽可能达到70%至80%。
所述Transwell小室包括两部分，由上往下依次叠加在一起的组成为：底层覆有通透性膜的上室以及材料与普通的孔板一样的下室。
所述Transwell小室的上室可设有与所述下室数量相等的细胞培养池，所述上室的底部为聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane），膜上带有微孔，孔径大小有0.4μm至8.0μm。
所述Transwell小室上室培养池的直径为12mm，面积1.1cm2；下室培养池的直径为24mm，面积4.5cm2，各细胞的培养均在各自对应的的细胞培养池中进行。
所述泡沫细胞诱导体系中的ox-LDL的浓度可为10mg/L至100mg/L，进一步可为30mg/L至80mg/L。更进一步，所述泡沫细胞诱导体系中的ox-LDL的浓度可为50mg/L至80mg/L。
所述泡沫细胞诱导体系中，TNF-α的浓度为10ng/mL至20ng/mL。
本发明所述构建动脉粥样硬化过程中体外泡沫细胞形成模型的方法，利用Transwell小室内部相互通透的上下室对内皮细胞和巨噬细胞培养形成两种细胞共培养体系，然后诱导该细胞共培养体系制备出可诱导泡沫细胞形成的泡沫细胞形成模型，以该泡沫细胞形成模型模拟体外动脉粥样硬化早期形成过程。该构建泡沫细胞形成模型的方法相较于现有模型构建方法，可明显减少造模时间及经费消耗，为动脉粥样硬化诊治过程提供一种新的可供选择的体外细胞筛选模型。另外，本发明所述构建方法具有如下优点：
（1）本发明中利用Transwell小室模拟体外AS形成的过程，该模型构建方法制作简便；
（2）本发明中的泡沫细胞形成模型的制备耗时短，72h可构建成功，其最后24小时可形成动脉粥样硬化早期标志性事件即泡沫细胞形成；
（3）本发明中泡沫细胞形成模型（即含有泡沫细胞的细胞培养体系）形成稳定，可重复性好，便于不同分组之间结果的比较；
（4）本发明中泡沫细胞形成模型体系经济、有效，大大节省了时间和人力成本；
（5）本发明中泡沫细胞形成模型的形成结果可以通过流式细胞仪、油红O染色及胆固醇试剂盒在较短时间内确定，操作方便。
附图说明
附图1是损伤内皮-巨噬细胞共培养系统的建立。
附图1中，A:共培养体系示意图；B：上层人脐静脉内皮细胞HUVEC ；C：下层巨噬细胞RAW264.7;D：空白对照组巨噬细胞电镜图； E:50mg/L ox-LDL干预巨噬细胞后电镜图片；F:80mg/L ox-LDL干预巨噬细胞后电镜图片。
附图2是流式细胞术验证TNF-α及ox-LDL诱导RAW264.7细胞表达炎症因子CD44。
附图2中，A：经10ng/mL TNF-α及ox-LDL处理；B：经20ng/mL TNF-α及ox-LDL处理；C：未经处理的对照组，D：定量结果。
附图3是油红O染色验证ox-LDL诱导RAW264.7细胞为泡沫细胞，此时均使用10ng/mL TNF-α进行干预。
附图3中，A：未经ox-LDL处理；B：20mg/L ox-LDL处理；C：40mg/L ox-LDL处理，D：60mg/L ox-LDL处理， E：80mg/L ox-LDL处理， F：定量结果，*：与20mg/L组比较，P<0.05;#:与40mg组比较，P<0.05。
附图4是巨噬细胞内胆固醇定量情况。
附图4中，A:总胆固醇荧光吸收标准曲线;B：游离胆固醇荧光吸收标准曲线；C：标曲浓度稀释表；D：ox-LDL干预后巨噬细胞活性。
附图5不同程度荷脂细胞内胆固醇酯的比重。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的内皮细胞为武汉普诺赛生命科技有限公司的人脐静脉内皮细胞HUVEC-T1细胞；巨噬细胞为武汉普诺赛生命科技有限公司的RAW264.7-T1细胞；ox-LDL为广州奕元生物技术有限公司产品；所述TNF-α为北京博奥森生物技术有限公司产品；所述Transwell小室具体为美国康宁公司产品。
下述实施例中培养巨噬细胞所使用的培养基均为90%高糖DMEM(中乔新舟,中国)添加如下量的物质得到的培养基：10％胎牛血清(Biological Industries/以色列),1%双抗 (Gbico/USA)。细胞培养条件为细胞恒温培养箱95%空气，5％CO2，37 ℃。
培养内皮细胞所使用的培养基均为93%基础培养基ECM(sciencell，USA)添加如下量的物质得到的培养基：5％胎牛血清(sciencell，USA)，1%内皮细胞生长因子(sciencell，USA)，1%双抗 (sciencell，USA)。细胞培养条件为细胞恒温培养箱95%空气，5％CO2，37 ℃。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例：该构建动脉粥样硬化过程中体外泡沫细胞形成模型的方法，按下述方法进行：将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）接种到Transwell小室上室涂明胶的聚碳酸酯滤膜上，人脐静脉内皮细胞的接种密度为5.0×104个/ml，培养48h可形成内皮单层；将RAW264.7巨噬细胞系（MΦ）铺入Transwell下室中，RAW264.7巨噬细胞的接种密度为2.0×104个/ml，与上室HUVEC共培养24h后，将培养基替换为含有TNF-α 10ng/mL至20ng/mL和 ox-LDL 10mg/至100mg/L的M199培养基培养24h，得到含有泡沫细胞的细胞培养体系，即泡沫细胞形成模型。
损伤内皮-巨噬细胞共培养系统的建立如图1中A、B、C图；50mg/L ox-LDL干预巨噬细胞后电镜图片如图1中E图；80mg/L ox-LDL干预巨噬细胞后电镜图片如图1中F图。
图1的E、F图相较于图1的D图，巨噬细胞形态发生明显变化，E、F图中细胞呈不同程度泡沫化。
所述构建动脉粥样硬化过程中体外泡沫细胞形成模型的方法的研究过程：
（1）在不同浓度的TNF-α条件下，诱导HUVEC表达炎症因子CD44，造成内皮细胞损伤开启动脉粥样硬化发生的始动环节。
本环节为模拟体内受损的血管，首先,将在培养皿内生长良好的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）用PBS清洗，加入胰酶消化收集、离心、再使用新鲜的培养基重悬以后，对细胞进行计数，对细胞进行稀释至5.0×104个/ml，接种到涂明胶的Transwell聚碳酸酯滤膜，培养2天以形成内皮单层，然后将内皮细胞专用培养基换成分别含10 ng/mL重组肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和20 ng/mL重组肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的M199培养基培养24h。
细胞接种后每日显微镜拍照观察，HUVEC逐渐由圆形变为梭形，培养2天后密度可达70%至80%。注意：①在移液器取试剂前，需要用该试剂平衡枪头（缓慢吸液，反复吹打三次）。②不能将枪头外壁的液体加入到反应体系中。
反应结束后吸除培养基上清液，用含无钙、镁离子的PBS漂洗一次；以25mL培养基为例，加入1mL消化液（0.1%胰蛋白酶），置室温（25℃）或37℃消化2min至5min；在倒置显微镜下观察，发现胞质回缩、间隙加大，立即吸除消化液并加入等倍体积含血清的培养基终止消化；用吸管吸取瓶内液体，反复吹打瓶壁细胞。吹打动作要轻柔并尽量避免产生泡沫；转移至离心管，1000r离心5min，弃上清；用细胞染色buffer离心洗涤1次至2次；用细胞染色buffer调整细胞浓度至1x106/mL备用。
按照说明书加入5ul抗体于3.0X105细胞，混匀后置于4℃，避光孵育30分钟。加入适量细胞染色buffer重悬细胞，1000r离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。加入0.4 mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)重悬细胞，用流式细胞仪进行检测和分析，如图2所示。
图2的D图显示：其定量结果显示模型显著表达CD44抗体，经10ng/mL TNF-α和20ng/mL TNF-α处理模型效果无统计学差异，因此后续的实验均使用10ng/mL TNF-α处理。
（2）在不同浓度的氧化低密度脂蛋白条件下，诱导泡沫细胞形成。
本环节为模拟体内受损的血管，首先,将在培养皿内生长良好的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）用PBS清洗，加入胰酶消化收集、离心、再使用新鲜的培养基重悬以后，对细胞进行计数，对细胞进行稀释至3.0×105个/ml，接种到涂明胶的Transwell聚碳酸酯滤膜。而后将生长良好的RAW264.7巨噬细胞用PBS清洗，加入胰酶消化、离心，并使用新鲜的培养基重悬以后，对细胞进行计数，对细胞进行稀释至2.0×104个/ml，铺入Transwell下室中，与上室HUVEC共培养24h后，将培养基替换为含10 ng/mL重组肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和分别为0mg/L，10 mg/L，20 mg/L，40 mg/L，60 mg/L，80 mg/L L，100 mg/L的ox-LDL的M199培养基培养24h。
（3） ox-LDL浓度对泡沫细胞形成的影响。
步骤(2)得到的内皮细胞-巨噬细胞共培养体系，加入含有不同浓度 ox-LDL的培养基后进行培养，可以得到不同浓度ox-LDL条件下的泡沫细胞形成结果。实验中ox-LDL的浓度分别设置为0mg/L，10 mg/L，20 mg/L，40 mg/L，60 mg/L，80 mg/L，100 mg/L。
（4）泡沫细胞的鉴定。
对实验结束的两种细胞的共培养体系，使用PBS溶液清洗，1.培养好的细胞样品固定于 Cell ORO Fixative 15-25min。 2. PBS 缓冲液或生理盐水稍冲洗，稍晾干。 3. 60%异丙醇滴洗 20s至30s。 4. 滴加油红 O 染色液，密闭染色 10min至15min。 5. 分色: 入60%异丙醇稍洗以便去除染液。 6. PBS 缓冲液或生理盐水稍冲洗。 7. 入 Mayer 苏木素染色液，复染核 1min至2min。 8.入 ORO Buffer 1min。 9. 晾干，然后使用倒置显微镜，在明场下观察并拍照。实验结果如图3所示。
将拍摄的照片，通过图片处理软件Image J中的颜色区分功能，对脂滴的红色面积进行定量分析并统计，进而得到定量信息。
通过使用不同浓度的ox-LDL对两种细胞的共培养体系进行处理后，使用油红染色对共培养体系中生成的泡沫细胞进行显示，油红染色会使脂滴显示为红色，有脂滴聚集的细胞确定为泡沫细胞，通过观察油红的多少，来指示泡沫细胞形成的程度变化。
由图3可知，A图中无红色细胞，B、C、D、E图出现数量呈浓度依赖性增加的红色细胞（图中为细胞中部分区域呈颜色稍深，实际为红色），即图3中的B、C、D、E图观察到泡沫细胞，结果显示成功建立泡沫细胞模型。
此外，我们观察了不同浓度的OX-LDL与巨噬细胞共同孵育后，巨噬细胞细胞活性变化（如附图4所示）以及巨噬细胞内胆固醇量的变化。通常巨噬细胞内的胆固醇酯比重小于50%，用ox-LDL诱导细胞后，实验结果表明当浓度为0mg/L，10mg/L，20mg/L，40mg/L，60mg/L，80mg/L，100mg/L时，随着浓度的递增，细胞内总胆固醇、胆固醇酯含量及的比重呈浓度依赖性增加，泡沫细胞形成程度逐渐增加，如图5所示。图5中，当ox-LDL浓度超过60mg/L时，细胞内胆固醇酯比重分别超过60%，说明细胞内有大量胆固醇聚集，已成为泡沫细胞。在没有ox-LDL存在的情况下，即使培养基内含有TNF-α，也没有形成泡沫细胞。所以，在泡沫细胞形成的过程中，ox-LDL的浓度起关键作用。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
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