阅读说明：本技术 降碳新木脂烷类化合物及其医药用途 (Carborundum-reducing neolignan compound and medical application thereof ) 是由 宋少江 黄肖霄 吕天铭 郭睿 于 2019-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,涉及降碳新木脂烷类化合物及其医药用途,尤其涉及从植物山楂果实中提取制备的降碳新木脂烷类化合物及这类化合物在制备抗帕金森病(PD)药物方面的应用。本发明提供了四种从蔷薇科山楂属植物山楂(Crataegus pinnatifida)中分离得到的降碳新木脂烷类化合物,结构如下：对发明所述四个新的降碳新木脂烷类化合物对MPP<Sup>+</Sup>诱导的人SH-SY5Y神经细胞损伤的神经保护作用进行了考察,体外细胞试验结果表明化合物1a/1b-2a/2b对MPP<Sup>+</Sup>诱导的人SH-SY5Y细胞氧化损伤具有显著的保护作用。<Image he="195" wi="700" file="DDA0002146431620000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention belongs to the technical field of medicines, relates to a carbon-reducing neolignanoid compound and medical application thereof, and particularly relates to the carbon-reducing neolignanoid compound extracted from plant hawthorn fruits and application of the compound in preparation of anti-Parkinson Disease (PD) medicines. The invention provides four carbon-reducing neolignan compounds separated from Crataegus pinnatifida (Crataegus pinnatifida) of Crataegus of rosaceae, which have the following structures: for the four novel carbon-reduced neolignanoid compound pairs MPP + The neuroprotective effect of induced human SH-SY5Y nerve cell injury is investigated, and the in vitro cell test result shows that the compound 1a/1b-2a/2b is applied to MPP + The induced oxidative damage of human SH-SY5Y cells has obvious protective effect.)

降碳新木脂烷类化合物及其医药用途

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及降碳新木脂烷类化合物及其医药用途，尤其涉及从植物山楂果实中提取制备的降碳新木脂烷类化合物及这类化合物在制备抗帕金森病(PD)药物方面的应用。

背景技术：

山楂(Crataegus pinnatifida)：为蔷薇科(Rosaceae)，苹果亚科，山楂属植物。果实微酸涩，核质地较硬，果肉略薄，归脾、胃、肝经，具有消食健胃，行气散瘀的效用。可以治疗胃脘胀满，肉食积滞及心率失常，充血性心力衰竭等症状。

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)：一种常见的神经系统变性疾病，其最主要的病理性改变是中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，由此引起纹状体多巴胺能神经元含量显著性减少而致病。PD常见于中老年人，流行病学调查显示，PD目前影响全世界1000多万人，我国患病人数达170多万人。导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与多巴胺能神经元的变性死亡过程，但已有足够的证据表明氧化应激引起的细胞凋亡增多与多巴胺能神经细胞退行性病变密切相关。

几十年来对PD的研究越来越受到关注，但是无论研究其发病机制，还是探索新的治疗方法都离不开PD实验模型。建立一个稳定可靠的多巴胺能神经元细胞模型对研究PD的发病和治疗是尤其必要的。1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP⁺)是1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP) 的活性代谢产物，能产生对中脑黑质多巴胺能神经元的选择性破坏作用，从而发挥其诱导PD 的毒性作用。MPP⁺不仅可以诱导整体动物模型，还能诱导体外培养细胞模型，因此MPP⁺细胞模型正逐渐成为一类较为理想的PD实验模型，在全世界范围内广泛应用。

发明内容

：

本发明提供了四种从蔷薇科山楂属植物山楂(Crataegus pinnatifida)中分离得到的降碳新木脂烷类化合物，结构如下：

本发明的制备技术方案包括如下步骤：(1)取干燥的山楂果实以乙醇回流提取，合并提取液浓缩得浸膏；

(2)浸膏采用乙酸乙酯萃取并将所得组分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系统100:1-5:1进行梯度洗脱，共收集到4个馏分A、B、C、D；

(3)馏分A经HP-20大孔树脂，以50％乙醇及90％乙醇进行洗脱，得两个组分A₁、A₂。

(4)将两个组分A₁、A₂利用ODS柱色谱以甲醇-水系统20:80-90:10进行梯度洗脱，并通过薄层色谱和自动分析HPLC分析合并进一步得到了5个组分1-5。

(5)所得组分3经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1-3:1进行梯度洗脱，得到5个组分3.1-3.5。

(6)利用制备HPLC对组分3.3以甲醇-水系统45:55进行分离，得到了3.3.1-3.3.6。

(7)利用半制备HPLC对3.3.5以乙腈-水系统30:70进行洗脱，得到了化合物(±)-1，并利用相同方法，对3.5.3进行分离得到了化合物(±)-2。利用Daicel Chiralpak IG手性色谱柱以正己烷-异丙醇系统1:1对化合物(±)-1进行手性拆分得到化合物1a和1b。利用Daicel Chiralpak IG手性色谱柱对化合物(±)-2进行手性拆分得到化合物2a和2b。

所述的制备方法，其中，所述提取为回流提取，提取3～5次，每次2～3小时。

所述的制备方法，使用山楂为蔷薇科山楂属植物山楂(Crataegus pinnatifida)。

所得化合物经过系统结构鉴定结果如下：

利用紫外光谱、高分辨质谱、一维和二维NMR技术对化合物1、2的平面结构进行鉴定。利用实测ECD和计算ECD对比及计算核磁技术，对拆分后的光学纯化合物1a/1b-2a/2b的绝对构型进行确定。

化合物1:淡黄色油状化合物，HRESIMS给出准分子离子峰m/z 457.1472[M+Na]⁺(计算为C₂₂H₂₆NaO₉,457.1469)，结合¹H,¹³C-NMR数据确定其分子式为C₂₂H₂₆O₉，计算不饱和度为10。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)谱显示出2组芳香质子信号[δ6.31(1H,d,J＝2.0Hz,H-2),6.78(1H,d,J＝8.2Hz,H-5),6.48(1H,dd,J＝8.2,2.0Hz,H-6)]和[δ6.44(2H,br s,H-2′/H-6′)]提示为一个1,3,4-三取代芳香环和一个1,3,4,5-四取代对称芳香环系统。另外¹H NMR谱显示出了4个脂肪族质子信号[δ3.41(1H,d,J＝5.7Hz,H-7),4.02(1H,d,J＝8.4Hz,H-7′),2.69(1H, ddd,J＝8.4,5.7,2.6Hz,H-8′),5.52(1H,J＝2.6Hz,H-9′)]以及5个甲氧基质子信号[δ3.26(3H, s),3.55(3H,s),3.74(3H,s),3.81(6H,s)]。¹³C NMR谱与HSQC谱提示化合物1具有22个碳信号分别对应5个甲氧基、4个次甲基、1个酯羰基碳与2个苯环片段。利用HSQC谱对该化合物进行碳氢直接相关归属，同时HMBC中H-7,H-8′和H-9′与C-8的相关显示出γ-丁内酯片段的存在。δ2.69(1H,ddd,J＝8.4,5.7,2.6Hz,H-8′)与C-1/C-7/C-1′/C-8′的相关显示出γ-丁内酯[C₇-C₈-O-C_9′-C_8′]片段通过C-8′与C-7′相连，并通过C-1与苯环相连。由此推测化合物1为具有C₆C₃-C₂C₆骨架的降碳新木脂烷类化合物。CH₃O-3/C-3,CH₃O-3′/C-3′, CH₃O-5′/C-5′,CH₃O-7′/C-7′以及CH₃O-9′/C-9′的HMBC相关显示出这些甲氧基分别与 C-3,C-3′,C-5′,C-7′,C-9′相连，从而确定了化合物1的平面结构。

化合物1的相对构型是通过NOESY谱与核磁计算确定的。在NOESY谱中观察到H-8′与H-2/6和CH₃O-9′的NOE相关，表明H-7与H-8′,H-8′与H-9′为反式取向。另外，通过核磁计算对C-7′的相对构型进行确证，并使用DP4+概率分析对2种可能的异构体 (7S*,7′S*,8′S*,9′R*)-1和(7S*,7′R*,8′S*,9′R*)-1的理论¹³C NMR化学位移计算结果的可靠性进行评估。通过在B3LYP/6-311+G(d,p)水平下，使用GIAO方法及Gaussian 09软件，利用甲醇中的连续极化模型进行理论¹³C NMR化学位移计算，将所得结果与实测¹³C NMR比较并利用DP4+概率分析进行结果分析，其相对构型为7S*,7′R*,8′S*,9′R*的可靠性接近100％。因此确定了化合物1的相对构型为7S*,7′R*,8′S*,9′R*。考虑到自然界存在的降碳新木脂烷类化合物存在潜在的手性，因此对化合物1进行手性拆分以获得光学纯化合物。随后，利用DaicelChiralpak IG手性色谱柱将化合物1拆分为一对对映异构体1a和1b(比例约为1:1)。它们的ECD光谱呈现出了镜像的Cotton效应及相反的旋光(1a:

1b:

)。该化合物的绝对构型是通过计算ECD谱与实测ECD谱对比确定的。经比对确定化合物1a、1b绝对构型分别为7S,7′R,8′S,9′R和7R,7′S,8′R,9′S。

化合物2:淡黄色油状化合物HRESIMS给出准分子离子峰m/z 487.1572[M+Na]⁺(计算为C₂₃H₂₈NaO₁₀,487.1575)，结合¹H,¹³C-NMR数据确定其分子式为C₂₃H₂₈O₁₀，不饱和度为 10。¹H(400MHz,CDCl₃)与¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)谱中显示出6个甲氧基、4个次甲基、 1个酯羰基碳以及12个芳香碳(其中8个为季碳)。对NMR谱图数据进行分析，发现化合物 2具有与化合物1相同的降碳新木脂烷类化合物的母核，其不同仅为化合物2在化合物1的 C-5位额外连有一个甲氧基。故化合物2的平面结构得到了确定。

化合物2相对构型的确定与化合物1的方法相同。NOESY谱观察到H-8′与H-2/6及CH₃O-9′的NOE相关，表明H-7与H-8′,H-8′与H-9′为反式取向。利用与化合物1相同的核磁计算方法，对化合物2的C-7′相对构型进行确证，从而确定了化合物2的相对构型为 7S*,7′R*,8′S*,9′R*。化合物2的比旋光度接近于零且ECD上无明显Cotton效应，推测其为外消旋混合物。利用Daicel Chiralpak IG手性色谱柱对化合物2进行手性拆分，结果得到一对对映异构体(2a:

2b:

)。它们的绝对构型是通过实验ECD光谱与计算ECD光谱比较确定的。2a和2b实验ECD谱中的Cotton效应峰分别与预设为7S,7′R,8′S,9′R和7R,7′S,8′R,9′S构型的计算ECD谱中的Cotton效应峰能够较好的吻合。由此，可以确定化合物2a与2b的绝对构型分别为7S,7′R,8′S,9′R和7R,7′S,8′R,9′S。1a/1b-2a/2b的核磁数据如下表所示：

表1 1a/1b-2a/2b在CDCl₃中¹H(400MHz)与¹³C(100MHz)NMR数据

对发明所述四个新的降碳新木脂烷类化合物对MPP⁺诱导的人SH-SY5Y神经细胞损伤的神经保护作用进行了考察，体外细胞试验结果表明化合物1a/1b-2a/2b对MPP⁺诱导的人 SH-SY5Y细胞氧化损伤具有显著的保护作用。因此本发明所述的新的降碳新木脂烷类化合物，具有抗PD作用的医药新用途。

附图说明：

图1化合物1的UV谱；

图2化合物1的HRESIMS谱；

图3化合物1的HMBC谱(600MHz,CDCl₃)；

图4化合物1的HSQC谱(600MHz,CDCl₃)；

图5化合物1的NOESY谱(600MHz,CDCl₃)；

图6化合物1的手性拆分色谱图；

图7化合物2的UV谱；

图8化合物2的HRESIMS谱；

图9化合物2的HMBC谱(600MHz,CDCl₃)；

图10化合物2的HSQC谱(600MHz,CDCl₃)；

图11化合物2的NOESY谱(600MHz,CDCl₃)；

图12化合物2的手性拆分色谱图；

图13化合物1a/1b-2a/2b实测ECD与计算ECD比对图；

图14化合物1-2的HMBC相关图；

图15化合物1-2的NOESY相关图；

图16(7S*,7′S*,8′S*,9′R*)-1和(7S*,7′R*,8′S*,9′R*)-1，(7S*,7′S*,8′S*,9′R*)-2和 (7S*,7′R*,8′S*,9′R*)-2的计算碳谱及DP4+置信度检验。

具体实施方式

：

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：化合物1a/1b-2a/2b的制备。

取干燥的山楂(C.pinnatifida)果实50kg，以70％乙醇回流提取3次，每次2小时。得乙醇粗提物3800g，浸膏采用乙酸乙酯及正丁醇萃取并将乙酸乙酯萃取所得组分(600g)经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统100:1-5:1进行梯度洗脱，共收集到4个馏分A、B、C、D。馏分A经HP-20色谱柱，以50％乙醇-水及90％乙醇-水进行洗脱，得两个组分A₁(40g)、A₂(80g)。将两个组分利用ODS柱色谱以醇-水系统20:80-90:10进行梯度洗脱，并通过薄层色谱和自动分析HPLC分析合瓶进一步得到了5个组分1-5。所得组分3(10g)经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1-3:1进行梯度洗脱，得到5个组分3.1-3.5。利用制备HPLC对组分3.3以甲醇-水系统45:55进行分离，得到了3.3.1-3.3.6。利用半制备HPLC对3.3.5以乙腈-水系统30:70进行洗脱，得到化合物(±)-1(9.4mg,t_R 43.4min)，利用相同方法，对3.5.3进行分离得到化合物(±)-2(7.9mg,t_R 47.4min)。并利用Daicel Chiralpak IG手性色谱柱对化合物 (±)-1进行手性拆分(正己烷/异丙醇，1:1，流速0.5ml/min)得到化合物1a(4mg,t_R 17.6min) 和1b(4.3mg,t_R 20.1min)。利用Daicel Chiralpak IG手性色谱柱对化合物(±)-2进行手性拆分 (正己烷/异丙醇，1:1，流速0.5ml/min)得到化合物2a(3.9mg,t_R39.5min)和2b(3.6mg,t_R 47.8min)。

实施例2：化合物1a/1b-2a/2b在体外对MPP⁺诱导的人SH-SY5Y神经细胞损伤保护作用的考察。

利用MTT实验，考察化合物对MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。将细胞放置在96孔板中，以100μL培养液静置12h，使用不同浓度的化合物1a/1b-2a/2b(12.5,25,50μM) 预处理SH-SY5Y神经细胞1h，并用MPP⁺(1mM)处理细胞36h。随后将培养液替换为含有0.5mg/mL MTT的磷酸盐缓冲溶液并在37℃下放置4h。除去上清液并加入DMSO(150mL/ 孔)，以MPP⁺(1mM)单独处理的细胞为对照组，检测不同浓度处理的细胞在490nm波长下利用紫外分光光度计进行检测(Thermo Scientific Multiskan MK3，上海,中国)。细胞的存活程度以存活百分比表示，并利用GraphPad Prism 6软件进行分析。结果显示，化合物1a/1b-2a/2b 不同浓度下均表现出显著的保护作用，尤其在50μM浓度下作用最强，相较于阳性药的50.5± 3.31％，1a/1b-2a/2b处理下的细胞存活率分别达到了87.5±3.05％、84.2±2.06％、86.3±2.61％、 83.8±1.33％。

表2给药后细胞存活百分比

模型组相比于对照组的细胞存活百分比^###P<0.001；实验组相比于模型组的细胞存活百分比**P<0.01,***P<0.01。