阅读说明：本技术 一种从南极磷虾中提取虾青素的方法 (Method for extracting astaxanthin from antarctic krill ) 是由 杨立业 范丽红 欧阳小琨 卢雨清 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及虾青素的提取技术领域,针对酶解法提取虾青素时间长会使虾青素变性的问题,提供一种从南极磷虾中提取虾青素的方法,包括以下步骤：1)将干的南极磷虾破碎,加入由蛋白酶和几丁质酶组成的复合酶,在水溶液中酶解,得到酶解液、残渣和色素沉淀,旋转蒸发后离心取沉淀物；2)离心后的沉淀物加入乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂,搅拌提取过滤,收集滤液,旋转蒸发去除混合溶剂,浓缩滤液；3)滤液先通过大孔吸附树脂吸附游离的虾青素,后经硅胶柱进一步分离纯化,最后冷冻干燥得到虾青素粉末。本发明通过复合抗氧化剂各成分的协同作用降低酶解过程中对类胡萝卜素蛋白的破坏,虾青素提取率高。(The invention relates to the technical field of astaxanthin extraction, and provides a method for extracting astaxanthin from antarctic krill aiming at the problem that astaxanthin is denatured due to long time of astaxanthin extraction by an enzymatic hydrolysis method, which comprises the following steps: 1) crushing dried antarctic krill, adding a complex enzyme consisting of protease and chitinase, carrying out enzymolysis in an aqueous solution to obtain an enzymolysis solution, residues and pigment precipitate, carrying out rotary evaporation, and centrifuging to obtain a precipitate; 2) adding the precipitate after centrifugation into a mixed solvent of ethyl acetate and methanol, stirring, extracting and filtering, collecting filtrate, removing the mixed solvent by rotary evaporation, and concentrating the filtrate; 3) adsorbing free astaxanthin by the filtrate through macroporous adsorption resin, further separating and purifying through a silica gel column, and finally freeze-drying to obtain astaxanthin powder. The method reduces the damage to carotenoid protein in the enzymolysis process through the synergistic effect of the components of the composite antioxidant, and has high extraction rate of astaxanthin.)

一种从南极磷虾中提取虾青素的方法

技术领域

本发明涉及虾青素的提取技术领域，尤其是涉及一种从南极磷虾中提取虾青素的方法。

背景技术

南极磷虾是一种海洋软甲纲的无脊椎动物，是世界上生物质能最大的物种，是地球上储量最丰富且亟待开发利用的渔业资源。南极磷虾富含虾青素等类胡萝卜素物质，虾青素酯是南极磷虾甲壳内色素的主要组成成分，因此南极磷虾是天然虾青素的极好来源之一。天然虾青素是一种具有活性羟基酮基团的多烯式类胡萝卜素，分子式为C₄₀H₅₂O₄。虾青素是最重要的天然类胡萝卜素之一，是自然界抗氧化性最强的天然分子，此外虾青素还具有多种有益的生理学功能，如着色功能、增强免疫力功能、预防癌症及抗紫外线功能等，因此天然虾青素有多方向的研究价值，在保健品和化妆品制造业都有广阔的开发和利用前景。天然虾青素大多与蛋白质结合，以类胡萝卜素蛋白结合物的形式存在。酶解法因为提取条件温和，提取率较高被应用于提取虾青素，但持续的蛋白水解会使类胡萝卜素蛋白的防护值降低，虾青素一旦游离非常不稳定，极易受光、热、碱、酸、氧化剂和紫外光等条件影响而导致分子被氧化成虾红素，据此需要一种理想的虾青素提取方法。

发明内容

本发明为了克服酶解法提取虾青素时间过长会使虾青素变性的问题，提供一种从南极磷虾中提取虾青素的方法，通过复合抗氧化剂各成分的协同作用降低酶解过程中对类胡萝卜素蛋白的破坏，虾青素提取率高。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种从南极磷虾中提取虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以干的南极磷虾为原料，破碎后，加入质量为南极磷虾质量1-5%的由蛋白酶和几丁质酶组成的复合酶，在水溶液中进行酶解，得到酶解液、残渣和色素沉淀，旋转蒸发后离心取沉淀物；

2）离心后的沉淀物按料液比0.2-0.5 g/mL加入乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂，搅拌提取过滤，收集滤液，旋转蒸发去除混合溶剂，浓缩滤液；

3）滤液先通过大孔吸附树脂吸附游离的虾青素，后经硅胶柱进一步分离纯化，最后冷冻干燥得到虾青素粉末。

本发明先酶解破坏南极磷虾中甲壳素的糖苷键，得到稳定的虾青素-蛋白质结合体，再利用混合有机溶剂提取，比直接提取减少了有机溶剂的用量。

作为优选，所述步骤1）在酶解过程中加入质量为南极磷虾质量0.6-3 %的复合抗氧化剂，复合抗氧化剂包括特丁基对苯二酚，选自柠檬酸、维生素A、维生素E、维生素C中的一种抗氧化剂，以及介孔分子筛。酶解法虽然提取条件温和，提取率较高，但持续的蛋白水解会使类胡萝卜素蛋白的防护值降低，使虾青素变性，所以需要添加抗氧化剂。由于酶解反应非常复杂，不同抗氧化剂的抗氧化机理各不相同，因而使用单一组分的抗氧化剂所达到的抗氧化活性相对也比较单一，无法有效地抑制生物机体中的氧化应激反应，使得抗氧化效果有限。本发明在实验过程中，选取了多种已知的抗氧化剂，进行复配组合，最后筛选出了上述组分复配而成的抗氧化剂，特丁基对苯二酚和柠檬酸、维生素A、维生素E、维生素C中的一种相互配合，综合抗氧化能力较佳。本发明使用了复合抗氧化剂后，可以适当延长酶解时间来提高虾青素提取率而不用担心类胡萝卜素蛋白的防护值降低。另外，柠檬酸和维生素 C还能起脱钙、软化作用。

作为优选，所述复合抗氧化剂的制备方法为：先将特丁基对苯二酚和介孔分子筛按质量比(0.03-0.1):1混合得混合物一，选自柠檬酸、维生素A、维生素E、维生素C中的一种抗氧化剂和介孔分子筛按质量比(0.02-0.06):1混合得混合物二，再将混合物一与混合物二按质量比(2.2-2.5):1混合。将抗氧化剂负载在介孔分子筛中，可以利用分子筛孔道特性控制颗粒分散程度以及颗粒的大小，提高抗氧化剂的活性。

作为优选，所述步骤1）中酶解的条件为：pH 5-8，温度30-50 ℃，时间4-7 h。

作为优选，所述步骤1）中蛋白酶和几丁质酶的质量比为(2-4):1。蛋白酶为木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。

作为优选，所述步骤2）中乙酸乙酯和甲醇的体积比为(1-3):3，提取温度30-50℃，转速为500-1500 r/min。

作为优选，冷冻干燥的条件为：-50—-10 ℃下冻结至成固态，再在大气压17 Pa以下的真空中干燥6-8 h。冷冻干燥可以防止干燥时温度过高引起虾青素变性。

因此，本发明具有如下有益效果：1) 本发明先酶解破坏南极磷虾中甲壳素的糖苷键，得到稳定的虾青素-蛋白质结合体，再利用混合有机溶剂提取，比直接提取减少了有机溶剂的用量；2) 酶解时添加抗氧化剂防止类胡萝卜素蛋白的防护值降低引起的虾青素变性；3）特丁基对苯二酚和柠檬酸、维生素A、维生素E、维生素C中的一种相互配合，综合抗氧化能力较佳；4）将抗氧化剂负载在介孔分子筛中，可以利用分子筛孔道特性控制颗粒分散程度以及颗粒的大小，提高抗氧化剂的活性。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

复合抗氧化剂的制备：先将特丁基对苯二酚和介孔分子筛按质量比0.08:1混合得混合物一，维生素C和介孔分子筛按质量比0.02:1混合得混合物二，再将混合物一与混合物二按质量比2.3:1混合。

1）取100 g干的南极磷虾为原料，破碎后溶于水中，加入3 g所述复合抗氧化剂，搅匀，加入2 g由蛋白酶和几丁质酶（质量比为3:1）组成的复合酶，在水溶液中进行酶解，酶解的条件为：pH 6，温度40 ℃，时间5 h，得到酶解液、残渣和色素沉淀，旋转蒸发后离心取沉淀物；

2）离心后的沉淀物按料液比0.5 g/mL加入乙酸乙酯和甲醇（体积比为2:3）的混合溶剂，40 ℃下500 r/min搅拌提取过滤，收集滤液，旋转蒸发去除混合溶剂，浓缩滤液；

3）滤液先通过大孔吸附树脂吸附游离的虾青素，后经硅胶柱进一步分离纯化，最后-50℃下冻结至成固态，再在大气压10 Pa的真空中干燥7 h得到虾青素粉末。

虾青素的提取率930mg/g南极磷虾。

实施例2

复合抗氧化剂的制备：先将特丁基对苯二酚和介孔分子筛按质量比0.03:1混合得混合物一，柠檬酸和介孔分子筛按质量比0.06:1混合得混合物二，再将混合物一与混合物二按质量比2.2:1混合。

1）取100 g干的南极磷虾为原料，破碎后溶于水中，加入0.6 g上述复合抗氧化剂，搅匀，加入1 g由蛋白酶和几丁质酶（质量比为4:1）组成的复合酶，在水溶液中进行酶解，酶解的条件为：pH 5，温度30 ℃，时间7 h，得到酶解液、残渣和色素沉淀，旋转蒸发后离心取沉淀物；

2）离心后的沉淀物按料液比0.2 g/mL加入乙酸乙酯和甲醇（体积比为1:3）的混合溶剂，50 ℃下1000 r/min搅拌提取过滤，收集滤液，旋转蒸发去除混合溶剂，浓缩滤液；

3）滤液先通过大孔吸附树脂吸附游离的虾青素，后经硅胶柱进一步分离纯化，最后-30℃下冻结至成固态，再在大气压17 Pa的真空中干燥8 h得到虾青素粉末。大孔吸附树脂吸附和硅胶柱分离纯化与常规操作相同。

虾青素的提取率890mg/g南极磷虾。

实施例3

复合抗氧化剂的制备：先将特丁基对苯二酚和介孔分子筛按质量比0.1:1混合得混合物一，维生素A和介孔分子筛按质量比0.04:1混合得混合物二，再将混合物一与混合物二按质量比2.5:1混合。加入质量为南极磷虾质量0.2-1%的复合抗氧化剂。

1）取100 g干的南极磷虾为原料，破碎后溶于水中，加入1 g所述复合抗氧化剂，搅匀，加入5 g由蛋白酶和几丁质酶（质量比为2:1）组成的复合酶，在水溶液中进行酶解，酶解的条件为：pH 8，温度50 ℃，时间4 h，得到酶解液、残渣和色素沉淀，旋转蒸发后离心取沉淀物；

2）离心后的沉淀物按料液比0.4 g/mL加入乙酸乙酯和甲醇（体积比为1:1）的混合溶剂，30 ℃下1500 r/min搅拌提取过滤，收集滤液，旋转蒸发去除混合溶剂，浓缩滤液；

3）滤液先通过大孔吸附树脂吸附游离的虾青素，后经硅胶柱进一步分离纯化，最后-10℃下冻结至成固态，再在大气压1 Pa的真空中干燥6 h得到虾青素粉末。

虾青素的提取率880mg/g南极磷虾。

实施例4

除了未加复合抗氧化剂外，其他条件与实施例1相同。

虾青素的提取率750mg/g南极磷虾。

结果讨论：本发明先酶解后有机液提取，减少有机溶剂的用量的同时，虾青素仍有较高的提取率。实施例4与实施例1相比未用复合抗氧化剂，实验中可以观察到步骤1）的酶解过程第4个小时左右溶液变成浅红色，表示虾青素变成了虾红素。说明没有复合抗氧化剂的保护，酶解时间过长会使虾青素变性，反而导致虾青素的提取率下降。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。