阅读说明：本技术 一种桉叶烷型倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物及其制备方法与应用 (eudesmane type sesquiterpene geranylhomogentisate heterocomplex and preparation method and application thereof ) 是由 文松松 徐玉文 牛冲 张雷 刘琦 周广涛 窦艳丽 陈真 王雪 李琳 于 2019-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,公开了一种桉叶烷型倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物,及其制备方法与应用。该化合物分离自樟科山胡椒属植物乌药(<I>Linderaaggregata</I>)的干燥块根,命名为Linderin B。该化合物的制备方法采用了天然产物化学领域较为成熟分离纯化手段,在实际操作中容易实现。经体外生物活性研究表明Linderin B能够显著延长血浆的活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT),可以作为抗凝血药物的先导化合物。(The invention relates to the technical field of medicines, and discloses eudesmane type sesquiterpene geranylurea-nigrosine heterozygotes, and a preparation method and application thereof Linderaaggregata ) The dried root tuber of (1) is named Linderin B. The preparation method of the compound adopts a mature separation and purification means in the field of natural product chemistry, and is easy to realize in actual operation. In vitro biological activity research shows that Linderin B can remarkably prolong the Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) of plasma, and can be used as a lead compound of an anticoagulant.)

一种桉叶烷型倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物及其制备方 法与应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及从传统中药樟科山胡椒属植物乌药(Lindera aggregata)中分离得到的一种桉叶烷倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物的制备方法及应用。

背景技术

血瘀证常表现为血栓性疾病，如心肌梗塞、脑血栓形成、血栓闭塞性脉管炎、视网膜血管阻塞等。活化的部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)是检查内源性凝血因子的一种过筛试验，主要用于检查是否存在内源性途径凝血因子VII、因子IX、因子XI的缺乏和某些因子的特殊抑制物，是肝素治疗监测的首选指标，也是凝血因子治疗以及狼疮抗凝物检测的主要手段。APPT的缩短常见于血小板增多症，血栓前状态及血栓性疾病，心肌梗死、不稳定型心绞痛、脑血管病变，深静脉血栓的形成。

乌药(Lindera aggregata)为樟科山胡椒属植物，该植物为2015年版《中国药典》收录的乌药的唯一品种，有悠久的使用历史。本品辛、温。归肺、脾、肾、膀胱经，具有行气止痛，温肾散寒的功效，用于治疗寒凝气滞、胸腹胀痛、气逆喘急、膀胱虚冷，遗尿尿频，疝气疼痛，经寒腹痛等病症。

发明内容

本发明的目的在于提供一种桉叶倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物，及其制备方法与在治疗凝血症方面的应用。

一种倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物，命名为Linderin B，其化学结构式如下所示：

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本发明还提供了这种杂合物的制备方法，包括如下步骤：

（1） 将乌药干燥块根粉碎，获得粗粉，所述粗粉的粒度小于等于10目，将乌药块根粗粉用80%乙醇加热回流提取3次，第一次提取时间为2小时，第二次和第三次的提取时间为1小时，滤过，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，得到总浸膏；

（2） 将步骤（1）的总浸膏分散于水中，然后用等体积的石油醚萃取，得到石油醚相提取物；

（3） 将将步骤（2）的提取物先经过硅胶柱层析，石油醚-丙酮梯度洗脱，薄层色谱检视后，得到A–G七个组分，组分E经过反相C-18柱层析甲醇-水梯度洗脱后，再分别经过反相C-8乙腈-水等度洗脱和反相C-18甲醇-水等度洗脱，得到1个倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物，即Linderin B。

所述步骤（3）的石油醚-丙酮梯度洗脱过程中，石油醚和丙酮的体积比为100:0至0:100。

所述步骤（3）的甲醇-水梯度洗脱中，甲醇和水的体积比为30:70至100:0。

所述步骤（3）的乙腈-水等度洗脱的乙腈和水的体积比为65:35；甲醇-水等度洗脱的甲醇和水的体积比为70:30。

本发明还提供了上述杂合物在制备抗凝血药物上的应用。

本发明的有益效果：

1. 新化合物

本发明从樟科山胡椒属植物乌药的干燥块根中分离得到了1个结构新颖的桉叶烷型倍半萜并香叶基尿黑酸甲酯杂合物，该类化合物在天然界中极为罕见，本发明丰富了该类化合物的化学多样性，为化合物领域增加了1种新的化合物，也为乌药的化学分类学研究提供了新的证据。

2. 提取方法简单

该化合物的制备方法都采用了天然产物化学领域较为成熟的技术手段，在实际操作容易实现。

3. 治疗凝血症

体外生物活性实验表明Linderin B能够显著延长羊血浆的活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time, APTT），可以作为抗凝血药物的先导化合物。

附图说明

图1 化合物Linderin B的高分辨质谱；

图2 化合物Linderin B的氢谱；

图3化合物Linderin B的碳谱和DEPT135谱；

图4 化合物Linderin B的¹H-¹H COSY 谱；

图5 化合物Linderin B的HSQC谱；

图6 化合物Linderin B的HMBC谱；

图7 化合物Linderin B的NOESY谱；

图8 化合物Linderin B的紫外吸收图谱；

图9 化合物Linderin B的圆二色谱；

图10 化合物Linderin B的红外图谱。

具体实施方式

实施例1 Linderin B的制备

提取：将樟科山胡椒属植物乌药(产于浙江台州，5.0 kg)的干燥块根粉碎，以80%乙醇回流提取3次，每次1至2小时，过滤合并提取液，提取液减压浓缩，提取浓缩液加水稀释后用等体积的石油醚萃取4次，减压回收溶剂分别得到石油醚相提取物。

分离：将上一步得到的石油醚相提取物(127.5 g)经硅胶柱层析，以体积比石油醚-丙酮(100:0至0:100)梯度洗脱，进一步经过反相C18硅胶柱层析甲醇-水(30:70至100:0)梯度洗脱，再经过半制备高效液相色谱C8柱分离乙腈-水(65:35)洗脱，最后经过半制备高效液相色谱C18柱分离甲醇-水(70:30)得到Linderin B (3.0 mg)。

Linderin B

[α]22.5 D –22.7 (c 0.3, MeOH);

紫外光谱 (甲醇): λ _max (log ε): 195 (4.35), 225 (4.04);

圆二色谱 (甲醇): 230 (Δε +5.58) nm;

红外光谱, ν _max 3746, 3302, 2975, 2361, 1743, 1458, 1199, 1025, 960, 735 cm^-1;

核磁数据见表1;

高分辨质谱 m/z 569.2887 [M + Na]⁺ (计算值为 C₃₄H₄₂O₆, 569.2874)，564.3333[M+ NH₄]⁺ (计算值为 C₃₄H₄₂O₆ 564.3320)。

核磁数据见表1。

表1 Linderin B的氢谱和碳谱数据

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实施例2 体外APPT的测定

取正常羊血浆，25 mM CaCl₂溶液在37^oC预热5至10 min，分别在凝血杯中加入50 μl羊血浆，50 μl样品待测液，将凝血杯放入凝血测定仪，37^oC 预热1 min后，快速加入50 μlAPTT试剂，继续37^oC 预热3 min，加入50 μl 25 mM CaCl₂溶液，开始测定凝血时间，平行测定6次，同时分别以等体积的羊血浆以及相应的空白溶剂作为空白对照。结果显示LinderinB在0.5 mg/ml浓度下，可以显著延长APTT (P<0.05)，凝血时间为85.97 ± 2.22 s，空白对照凝血时间为51.43 ± 2.25 s。