阅读说明：本技术 一组倍半萜类化合物及其制备方法和应用 (Sesquiterpenoids and preparation method and application thereof ) 是由 何祥久 王宜海 孙莲莲 徐静雯 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,提供了一组倍半萜化合物及其制备方法和应用,通过理化常数和现代波谱学对从三裂蟛蜞菊花中提取出的倍半萜化合物进行鉴定,明确了其理化性质和化学结构,并通过药效学试验发现该组倍半萜化合物具有抗肿瘤、抗炎活性,可用于制备抗肿瘤药物、抗炎药物,且该组倍半萜化合物尤其对与阿尔兹海默病相关的炎症具有很好的药学活性,也可用于制备抗阿尔兹海默病药物。(The invention belongs to the technical field of medicines, and provides a group of sesquiterpene compounds, a preparation method and application thereof.)

一组倍半萜类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一组倍半萜类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所产生的防御反应，大多数疾病都伴有炎症的发生，炎症会加重疾病的发生和发展，有些慢性炎症会导致肿瘤的发生，因此，对炎症的控制和治疗具有非常重要的意义。

肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，它是目前威胁人类健康的主要杀手之一，目前尚无有效治愈的药物。

阿尔兹海默病(AD)是一种进行性认知障碍和记忆力损伤的中枢神经退行性疾病，伴有情感及性格的改变，严重影响患者的工作能力和生存质量。现如今AD的发病率逐年增高。AD的主要病理特征是细胞外β-淀粉蛋白沉积形成的蛋白斑块和细胞内微观相关的蛋白过度磷酸化形成神经元纤维缠结，最终导致炎症、氧化应激、神经元死亡等造成一系类AD病症。小胶质细胞(BV-2)是中枢免疫细胞，激活状态下能抑制β-淀粉样蛋白沉积和聚集。大量研究表明，多种因素引起BV-2激活进而引发的神经炎症反应在AD的发展中扮演重要的角色。

天然药物尤其是来源于植物的药物具有化学结构多样性和生物活性多样性，一直是人类预防和治疗疾病的主要来源。临床上应用的许多药物都直接或间接来源于天然产物，天然产物不仅可以作为药物半合成的前体物，还可以作为化学合成药物的模板，为新药设计提供新思路，天然产物已成为发现新药物或先导化合物的主要源泉之一。

三裂蟛蜞菊(Wedelia trilobata)为菊科(Compositae)蟛蜞菊属(Wedelia)的一种草本植物，民间主要用来治疗蛇伤、鱼伤、腹泻、肾结石、感冒等疾病。现代药理实验研究也表明，三裂蟛蜞菊具有一定的药学活性，不过其中发挥作用的具体活性成分、所对应的病症及药理机制仍处于未知状态。

发明内容

本发明的目的在于提供一组倍半萜化合物及其制备方法和应用。

本发明所提供的一组倍半萜类化合物及其互变异构体、药学上可接受的盐，所述一组倍半萜类化合物的结构式如下：

本发明还提供上述倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将三裂蟛蜞菊花干燥、醇提、得提取液；

(2)将提取液依次用低极性溶剂、中极性溶剂和高极性溶剂进行萃取；

(3)将中极性层进行硅胶柱层析分离，利用中极性溶剂和高极性溶剂进行梯度洗脱，得中极性溶剂和高极性溶剂体积比100:1和50:1的洗脱部分的干重样品A和B；

(4)对样品A进行硅胶柱层分离、ODS柱层析分离、半制备反相HPLC分离得到化合物1，2和3；

(5)对样品B进行硅胶柱层分离，并对其中极性和高极性溶剂体积比为50：1洗脱部分进行ODS柱层析分离、半制备反相HPLC分离得到化合物4；

(6)或对样品B进行硅胶柱层分离，并对其中极性和高极性溶剂体积比为30：1洗脱部分进行ODS柱层析分离、半制备反相HPLC分离得到化合物5，6，7和8。

进一步，所述低极性溶剂选自环己烷、石油醚、正己烷、异辛烷、三甲基戊烷、环戊烷、庚烷等烃类溶剂中的至少一种。

进一步，所述中极性溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、***、甲酸甲酯、硝基甲烷、乙酸丁酯、异丙醚中的至少一种；高极性溶剂选自正丁醇、甲醇、叔丁醇、丙醇、异丙醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、吡啶中的至少一种。

进一步，所述低级醇为C1～C6的烷基醇。

进一步，步骤(3)中的中极性-高极性溶剂梯度洗脱顺序为：100:1、80:1、50:1、30:1、20:1、15:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1。

本发明还提供上述倍半萜化合物1～4及其互变异构体、药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供上述倍半萜化合物5～8及其互变异构体、药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用。

本发明还提供上述倍半萜化合物5～8及其互变异构体、药学上可接受的盐在制备抗阿尔兹海默病药物中的应用。

进一步，所述抗阿尔兹海默病药物为口服剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、片剂中的任意一种剂型。

相对于现有技术，本发明从三裂蟛蜞菊花中提取出一组新的倍半萜类化合物，通过理化常数和现代波谱学进行鉴定，明确了其理化性质和化学结构。通过药效学试验发现该组倍半萜化合物具有抗肿瘤、抗炎活性，可用于制备抗肿瘤药物、抗炎药物，且该组倍半萜化合物尤其对与阿尔兹海默病相关的炎症具有很好的药学活性，也可用于制备抗阿尔兹海默病药物。

附图说明

图1～3依次为化合物1的¹H-NMR，¹³C-NMR，HR-ESI-MS谱图；

图4～6依次为化合物2的¹H-NMR，¹³C-NMR，HR-ESI-MS谱图；

图7～9依次为化合物3的¹H-NMR，¹³C-NMR，HR-ESI-MS谱图；

图10～12依次为化合物4的¹H-NMR，¹³C-NMR，HR-ESI-MS谱图；

图13～15依次为化合物5的¹H-NMR，¹³C-NMR，HR-ESI-MS谱图；

图16～18依次为化合物的6的¹H-NMR，¹³C-NMR，HR-ESI-MS谱图；

图19～21依次为化合物7的¹H-NMR，¹³C-NMR，HR-ESI-MS谱图；

图22～24依次为化合物8的¹H-NMR，¹³C-NMR，HR-ESI-MS谱图；

图25为实施例2中化合物1～3Hochest染色实验结果；

图26为实施例2中化合物1～3抑制癌细胞生长的实验结果；

图27为实施例2中Western Blot实验的结果；

图28为实施例3中Western Blot实验的结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来说明本发明的技术方案。

实施例1

本实施例1从三裂蟛蜞菊花中提取、分离出一组化合物，并对所的化合物进行鉴定。

所述提取、分离过程包括以下步骤：

(1)将三裂蟛蜞菊花干燥、醇提、得提取液；

(2)将提取液依次用低极性溶剂、中极性溶剂和高极性溶剂进行萃取；

(3)将中极性层进行硅胶柱层析分离，利用中极性溶剂和高极性溶剂进行梯度洗脱，得中极性溶剂和高极性溶剂体积比100:1和50:1的洗脱部分的干重样品A和B；

(4)对样品A(中极性和高极性溶剂体积比100:1)硅胶柱层分离、ODS柱层析分离、半制备反相HPLC分离得到化合物1，2和3；

(5)对样品B进行硅胶柱层分离，并对其中极性和高极性溶剂体积比为50：1洗脱部分进行ODS柱层析分离、半制备反相HPLC分离得到化合物4；

(6)或对样品B进行硅胶柱层分离，并对中极性和高极性溶剂体积比为30：1洗脱部分进行ODS柱层析分离、半制备反相HPLC分离得到化合物5，6，7和8。

对上述分离的化合物1～8进行鉴定，结果如下：

1、化合物1的鉴定：

HR-ESI-MS m/z 517.2412[M+Na]⁺(calcd for C₂₆H₃₈O₉Na，518.2408)，确定化合物分子式为C₂₆H₃₈O₉。

¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)在低场区δ_H 5.45(1H，m，H-1)，5.80(1H，dd，J＝10.5，8.3Hz，H-9)以及相互耦合的4.97(1H，dd，J＝9.7，3.2Hz，H-8)和5.35(1H，d，J＝3.2Hz，H-6)有四个连氧的次甲基或亚甲基的氢信号；δ_H6.26(1H，d，J＝3.2Hz，H-13)，5.58(1H，d，J＝3，2Hz，H-13)有两个相互耦合的端基烯氢信号；高场区δ_H 3.41(1H，m，H-7)有一个次甲基的氢信号，δ_H 0.90(3H，s，4”’)，0.91(3H，s，5”’)，1.24(3H，s，3”)，1.26(3H，s，4”)，1.29(3H，s，15-CH₃)，1.83(3H，s，14-CH₃)，1.97(3H，s，2’)有七个甲基的氢信号。

¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)中给出26个碳信号，在δ_C170.9，43.0，25.0，22.5，21.9为一个酯羰基，一个次甲基，一个亚甲基，两个甲基碳信号，结合氢谱化学位移值，可以推测出该化合物母核9位连接一个2-甲基丁酯基基团。

确定化合物1的化学结构为1α-acetoxy-4α-hydroxy-6α-isobutyryloxy-9β-15α-methylisovaleryloxyprostatolide，其结构式下：

2、化合物2的鉴定：

HR-ESI-MSm/z 515.2254[M+Na]⁺(calcdforC₂₆H₃₆O₉Na，516.2252)，确定化合物分子式为C₂₆H₃₆O₉。

¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)在低场区δ_H5.46(1H，t，J＝8.5Hz，H-1)，5.90(1H，m，H-6)以及两个相互耦合的δ_H5.00(1H，dd，J＝9.8，3.1Hz，H-8)，5.43(1H，d，J＝3.1Hz，H-9)有四个连氧的次甲基或亚甲基的氢信号，δ_H1.73(1H，m，H-5)，3.42(1H，m，H-7)有两个次甲基的氢信号，δ_H6.73(1H，m，3”’)以及相互耦合的δ_H6.21(1H，d，J＝3.2Hz，H-13)和5.56(1H，d，J＝2.8Hz，H-13)三个烯氢信号，δ_H1.26(3H，s，14-CH₃)，1.31(3H，s，15-CH₃)，1.94(3H，s，2’)，1.23(3H，s，3”)，1.20(3H，s，4”)，1.75(3H，s，4”’)，1.74(3H，s，5”’)七个甲基氢信号。其中δ_H1.26(3H，s，14-CH₃)，1.31(3H，s，15-CH₃)为其母核上面14，15位甲基特征氢信号。

¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)中给出26个碳信号，在δ_C 166.2，127.4，139.2，12.3，14.7有一个酯羰基，两个双键，两个甲基碳信号，可推测该化合物9位连接一个(反)3-甲基-2-丁烯酯基基团。

化合物2为1β-acetoxyl-4a-hydroxy-6β-isobutyryloxy-9a-Tiglinoyloxyprostatolide，其具体结构式如下：

3、化合物3的鉴定：

HR-ESI-MS m/z 515.2252[M+Na]⁺(calcd for C₂₆H₃₆O₉Na，515.2252)，确定化合物分子式为C₂₆H₃₆O。

¹H-NMR(500MHz，Methanol-d₆)在低场区δ_H5.48(1H，t，J＝8.8Hz，H-1)，5.31(1H，d，J＝2.8Hz，H-6)以及相互耦合的δ_H5.16(1H，dd，J＝9.7，2.6Hz，H-8)，3.53(1H，tt，J＝9.6，3.0Hz，H-7)有四个连氧次甲基或亚甲基的氢信号；δ_H 6.84(1H，m，3”’)以及相互耦合的δ_H5.58(1H，d，J＝2.8Hz，H-13)和6.10(1H，d，J＝3.2Hz，H-13)三个烯氢信号。高场区δ_H 3.53(1H，tt，J＝9.6，3.0Hz，H-7)有一个次甲基氢信号，δ_H 1.34(3H，s，15-CH₃)，1.35(3H，s，14-CH₃)，1.21(3H，d，J＝6.9Hz，3”)，1.26(3H，d，J＝7.1Hz，4”)，1.77(3H，s，4”’)，1.79(3H，s，5”’)，1.89(3H，s，2’)有七个甲基氢信号。

¹³C-NMR(125MHz，Methanol-d₆)中给出26个碳信号，与化合物2碳谱数据对比两者的不同在δ_C 70.4(C-1)、23.0(C-2)、36.0(C-3)、70.9(C-4)、74.0(C-6)、44.5(C-7)、75.5(C-8)、41.8(C-10)、137.6(C-11)、171.5(C-12)这几个母核上面的碳信号。从而可以推测两者的相对构型存在差异。

化合物3为1α-acetoxy-4β-hydroxy-6α-isobutyryloxy-9β-15α-methylTiglinoyloxyprostatolid e，其具体结构式如下：

4、化合物4的鉴定

HR-ESI-MS m/z 475.1941[M+Na]⁺(calcd for C₂₃H₃₂O₉Na，475.1939)，确定化合物分子式为C₂₃H₃₂O₉。

¹H-NMR(400MHz，DMSO)谱图中，在低场区δ_H 5.26(1H，d，J＝4.7Hz，H-9)，4.68(1H，dd，J＝8.4，4.7Hz，H-8)相互耦合的两个连氧次甲基或亚甲基的氢信号；δ_H 4.92(1H，dd，J＝11.3，4.1Hz，H-1)有一个连氧的次甲基的氢信号。

¹³C-NMR(100MHz，DMSO)中总共有23个碳信号，在δ_C 166.8，127.1，136.3，18.5为一个酯羰基，两个双键，一个甲基，结合氢谱化学位移值，形成一个异丙烯酰基基团连接在6位。

最终确定化合物4为1a,9β-diacetoxyl-4β-hydroxy-6a-methacryloxy-11β-methylprostatolide，其结构式为：

5、化合物5的鉴定

HR-ESI-MS m/z 369.1918[M+Na]⁺(calcd for C₁₉H₂₉O₇，369.1913)，确定化合物分子式为C₁₉H₂₈O₇。

¹H-NMR(500MHz，DMSO)在低场区δ_H 5.68(1H，m，H-13)，6.19(1H，d，J＝1.4Hz，H-13)两个烯氢信号；δ_H 4.68(1H，t，J＝2.8Hz，H-9)，3.72(1H，m，H-8)，3.44(1H，m，H-1)三个连氧次甲基或亚甲基氢信号，δ_H 4.14(1H，td，J＝10.7，4.0Hz，H-6)和高场区δ_H 1.57(1H，d，J＝10.9Hz，H-5)为相互耦合的连氧的次甲基或亚甲基氢信号，δ_H 0.84(3H，s，14-CH₃)、1.20(3H，s，15-CH₃)、1.12(3H，d，J＝7.0Hz，3’)，1.10(1H，d，J＝6.9Hz，4’)有四个甲基氢信号，其中δ_H 0.84(3H，s)，1.20(3H，s)为桉烷醇苷型倍半萜内酯类化合物14，15位甲基氢信号。

¹³C-NMR(125MHz，DMSO)中总共有19个碳信号，碳谱低场区δ_C 166.8，175.1有两个羰基碳信号，而δ_C 166.8为其化合物母核上12位羰基碳信号，高场区δ_C18.7，19.0，33.5两个甲基，一个次甲基碳信号除外其余的碳信号为其母核上面甲基，亚甲基，次甲基以及季碳信号，δ_C 14.9，22.8为母核上14，15位两个甲基特征碳信号。δ_C 175.1，33.5，19.0，18.7一个酯羰基，一个次甲基，两个甲基，结合氢谱化学位移值组成异丁酰基基团，从而通过可以推测出该化合物为桉烷醇苷型倍半萜内酯类化合物。

化合物5为1a,9β,4a-dihydroxy-6β-isobutyryloxyprostatolide，其结构式为：

6、化合物6的鉴定

HR-ESI-MS m/z 281.1390[M+Na]⁺(calcd for C₁₅H₂₁O₅，281.1369)，确定化合物分子式为C₁₅H₂₀O₅。

¹H-NMR(500MHz，DMSO)在低场区δ_H 5.33(1H，d，J＝3.8Hz，H-3)以及δ_H 5.76(1H，dd，J＝2.9，1.2Hz，H-13)，5.83(1H，dd，J＝3.3，1.2Hz，H-13)两个相互耦合的三个烯氢信号，δ_H 3.98(1H，m，H-1)，3.84(1H，m，H-9)，3.60(1H，dd，J＝5.7，2.8Hz，H-6)和4.83(1H，dd，J＝9.0，2.5Hz，H-8)存在四个连氧次甲基的氢信号，高场区δ_H 0.80(3H，s，15-CH₃).1.82(3H，s，14-CH₃)两个甲基氢信号为其化合物母核上14，15位甲基氢信号。

¹³C-NMR(125MHz，DMSO)中总共有15个碳信号，¹³C-NMR低场区在δ_C 170.7有一个羰基碳信号，δ_C 117.5，120.9，133.4，140.1有四个双键碳信号，δ_C 64.6，73.0，73.1，75.9存在四个连氧次甲基碳信号，高场区δ_C 16.9，25.9有两个甲基碳信号，其余碳信号为化合物母核上亚甲基，次甲基以及季碳信号。

化合物6被鉴定为1a,6a,9β-trihydroxy-4,10a-dimethyl-5aH,7aH,8aH-endesm-3-en-8,12-olide，其结构式为：

7、化合物7的鉴定

HR-ESI-MS m/z 369.1908[M+Na]⁺(calcd for C₁₉H₂₉O₇，369.1913)，确定化合物分子式为C₁₉H₂₈O₇。

¹H-NMR(500MHz，DMSO)在低场区δ_H 6.34(1H，s，H-13)、5.64(1H，s，H-13)为两个末端烯氢信号，δ_H 3.54(1H，m，H-1)、5.27(1H，m，H-6)、4.09(1H，s，H-8)、4.35(1H，s，H-9)存在四个连氧次甲基或连氧亚甲基氢信号，高场区δ_H 1.13(3H，s，14-CH₃)、1.12(3H，s，15-CH₃)、1.10(3H，s，3’)、1.14(3H，s，4’)为四个甲基氢信号。

¹³C-NMR(125MHz，DMSO)中总共有19个碳信号，该化合物的8位少一个2-甲基丙烯酰基基团，从而使该化合物的7(δ_C 45.6)、8(δ_C 60.3)、9(δ_C 84.2)位化学位移发生变化。化合物低场区δ_C 163.7、175.1有两个酯羰基碳信号，其中δ_C 163.7为化合物母核上12位酯羰基碳信号。δ_C 130.6、134.5有两个双键碳信号为其化合物母核上11，13位碳信号。δ_C 18.9、18.4、14.5、24.6为四个甲基碳信号。

最后确定该化合物的化学结构为1α,4β,9β-trihydroxy-6α-isobutyryloxyeudesman-9,12-olide，其结构式为：

8、化合物8的鉴定

HR-ESI-MSm/z 369.1902[M+Na]⁺(calcdforC₁₉H₂₉O₇，369.1913)，确定化合物分子式为C₁₉H₂₈O₇。

¹H-NMR在低场区δ_H 5.70(1H，m，3’)、6.02(1H，s，3’)为两个末端烯氢信号，δ_H 4.23(1H，dd，J＝7.9，2.3Hz，H-1)、5.51(1H，d，J＝2.9Hz，H-6)、3.71(1H，dd，J＝5.7，4.2Hz，H-8)、4.67(1H，dd，J＝6.9，3.9Hz，H-9)为四个连氧亚甲基或连氧次甲基氢信号，高场区δ_H1.07(3H，s，15-CH₃)、1.10(3H，s，13-CH₃)、1.87(3H，s，4’)为三个甲基氢信号。

¹³C-NMR中总共有19个碳信号，在δ_C 18.1、125.9、136.4、165.8(一个甲基，两个双键，一个羰基)结合氢谱δ_H 5.70(1H，m)、6.02(1H，s)、1.90(3H，s)可以推测为一个2-甲基丙烯酰基基团，其余的15个碳信号，推测为一个桉烷醇苷型倍半萜类化合物母核骨架，低场区δ_C176.7为一个羰基碳信号，为12位酯羰基碳信号，δ_C 13.1、25.6为13，15位甲基碳信号。

最后确定该化合物8的化学结构为1α,9β-dihydroxy-4β-hydroxymethyl-6β-methacryloxy-13β-methyleudesmanolide：

表1本发明化合物1～4的¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱数据

a类化合物溶剂为氘代氯仿，b类化合物溶剂为氘代甲醇。

化合物1～3为500MHz和125MHz，化合物4为400MHz和100MHz。

表2本发明化合物5～8的¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱数据。

化合物5～8溶剂为DMSO，为500MHz和125MHz。

实施例2

本实施例2对实施例1中的化合物1～4对HeLa、HepG2、SGC-7901、HUVEC四种人体肿瘤细胞的细胞毒活性进行研究，具体如下：

(1)细胞的培养及供试品溶液配制

将HeLa、HepG2、SGC-7901、HUVEC等人肿瘤细胞培养于RPMI-1640培养液中，加入10％胎牛血清、1％抗生素，于5％CO₂、37℃条件下培养。每两天继代培养，使细胞保持在对数生长期。

分别配制化合物1～4的DMSO溶液作为供试品溶液保存于4℃下备用，使用时用完全培养基稀释至相应浓度。MTT用PBS(phosphate buffer solution)溶液配成浓度为5mg/mL的溶液，于4℃避光保存，使用时用基础培养基稀释至0.5mg/mL。

(2)活性测试(MTT法)

在96孔培养板的每一孔中加入100μL步骤(1)中生长良好的肿瘤细胞(约含5000个细胞)，在5％CO₂、37℃条件下培养12h后加入供试品溶液或者抗癌药cis-dichlorodiamineplatinum(Ⅱ)(顺铂)，每组平行设3个复孔。同时设空白对照组(无细胞及不加入供试品溶液的细胞培养液)和阴性对照组(不加入供试品溶液的细胞液)。

在5％CO₂、37℃条件下培养48h后，离心弃去培养液，每孔加入100μL的MTT溶液(0.5mg/mL)继续培养4h，加入100μL SDS(十二烷基磺酸钠)，6h后用酶标仪于546nm处测定OD值，根据OD值计算细胞增殖抑制率[胞增殖抑制率＝(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值)÷(阴性对照组OD值平均值-空白对照组OD值平均值)×100％]以及半数抑制浓度IC₅₀值，结果如表3所示。

表3化合物1～4对肿瘤细胞的细胞抑制活性

由表3数据可得，化合物1～4对HeLa、SGC-7901、HepG2和HUVEC四种肿瘤细胞均有较好的抗增殖作用。

(3)Hochest染色来观察细胞核形态实验

将肿瘤细胞接种在48孔板上，每孔约8×10³个，孵育12小时。待细胞贴壁后，分别将加入不同浓度的化合物1～3的DMSO溶液，作用48个小时以刺激细胞凋亡。然后用荧光显微镜物镜拍照3次，弃去上清液，将细胞用PBS洗三次，再用4％的聚甲醛来固定细胞20分钟，再用PBS洗三次。最后在各孔板加入200μL的Hochest的染料稀释四倍后，用PBS清洗三次并在荧光显微镜下观察细胞核的降解，结果如图25所示。

图25反映，随着化合物1～3浓度逐渐增加，肿瘤细胞的细胞核由正常形态逐渐转变为肾形，再裂解为碎片，进一步证实了化合物1～3对肿瘤细胞具有抑制作用。

(4)抑制癌细胞生长实验

取24孔板接种80个肿瘤细胞培养12h，待细胞贴壁后，将化合物1～3分别设置低剂量组、中剂量组和高剂量组作用于肿瘤细胞。经过药物处理48h后，去掉上清液，加入完全培养基(1640+10％FBS+1％双抗)，三天换一次液。经过四次换液后，观察细胞形态。再弃去上清液，用PBS洗三次，4％多聚甲醛固定细胞20分钟，再用PBS洗三次，待挥干后加入0.2％的结晶紫染色20分钟，用蒸馏水冲洗各孔，将24孔板倒置吸水纸晾干后，拍照计数。

如图26所示，化合物1～3能够抑制了肿瘤细胞的增殖，且随着浓度的增加细胞数量逐渐的减少，抑制作用越强。

(5)Western Blot实验

将处于指数生长期的肿瘤细胞种于96孔板中，分别加入不同浓度的化合物1～2(10、20、40μmol.L^-1)和化合物3(5、10、20μmol.L^-1)，并于相应时间点提取各组总蛋白，采用10％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，按常规操作方法进行Western blot实验，最后采用ECL试剂盒显影并成像。每组实验重复3次，实验结果见图27，其中图中的“*”表示蛋白表达的显著性，^*p＜0.05，^***p＜0.01，^***p＜0.001)。

由图27可知，浓度为10μmol.L^-1，化合物1～3能显著下调肿瘤细胞的PARP-1和BCL-2的蛋白表达，并且上调BAX蛋白的表达，且随着药物浓度的增加对三种蛋白的表达效果越来越明显，说明化合物1～3可通过PARP-1，BCL-2和BAX蛋白的表达来对细胞起到抗增殖的作用。

通过上述实验证明，本发明的化合物1～4对肿瘤细胞的增殖具有良好的抑制作用，因此可用于制备抗肿瘤药物，其互变异构体、及其药学可接受的盐也可用于制备抗肿瘤药物。

在制备肿瘤药物时，可将化合物1～4或其互变异构体、及其药学可接受的盐与药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂、抗氧剂结合制成口服剂、注射剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、片剂、栓剂、膜剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释与控释剂、靶向制剂或粉剂。其中药学可接受的载体可选用淀粉、壳聚糖、海藻酸、琼脂、纤维蛋白、胶原蛋白、聚磷酸酯类、聚氨酯类、聚酸酐类、脂质体、聚乙二醇、甘露糖、半乳糖、聚维酮等，稀释剂可选自微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉、糖精等，赋形剂可选自甘露糖、甘氨酸、乳糖、氯化钠、葡萄糖等，稳定剂可选自白蛋白、胶原、环糊精及其衍生物、聚乙二醇、吐温、司盘、右旋糖苷、甘露醇等，抗氧剂可选自VC、VE、安息香酸、枸橼酸及其盐、山梨酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠等。

实施例3

本实施例3采用LPS(脂多糖)诱导的BV-2(小鼠小胶质细胞)建立体外炎症模型，利用MTT和Griess实验，以化合物5～8作为供试品，以抗炎药Minocycline(米诺环素)作为阳性对照，考察本发明化合物5～8的抗炎活性，具体如下：

(1)MTT试验

将LPS诱导的BV-2细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入供试品或米诺环素溶液。继续培养24h后用MTT法测定样品对BV-2增殖的抑制率和半数抑制浓度(IC₅₀)，结果如表5所示。

(2)Griess实验

将BV-2细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入LPS诱导产生炎症。接着加入供试品或米诺环素溶液。继续培养24h后，吸取各孔培养液50μL，加入50μL Griess A试剂和50μL Griess B试剂混匀，用酶标仪于546nm处测定OD值，计算对NO产生的抑制率[NO抑制率＝(模型对照组OD值平均值-样品组OD值平均值)÷(模型对照组OD值平均值-阴性对照组OD值平均值)×100％，其中模型对照组为LPS诱导的BV2细胞，阴性对照组为正常的BV2细胞]，并用CalcuSyn软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC₅₀)，结果见表4。

表4化合物5～8对BV-2细胞的抗炎活性

由表4可知，化合物5～8对BV-2细胞具有抗炎作用，且化合物6对BV-2细胞的半数抑制浓度较药米诺环素低，具有更好的抗炎作用。

(3)Western Blot实验

将处于指数生长期的BV-2细胞种于96孔板中，分别加入不同浓度的化合物6(10、20、40μmol.L^-1)，并于相应时间点提取各组总蛋白，采用10％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，按常规操作方法进行Western blot实验，最后采用ECL试剂盒显影并成像。每组实验重复3次，实验结果见图28，其中图中的“#”表示LPS相对于正常细胞(Control)的显著性，“*”表示倍半萜类化合物相对于LPS的显著性，^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001)。

由图28可知，化合物6能通过抑制COX-2和iNOS两种蛋白的表达来下调NO的生物合成。

上述结果表明本发明的倍半萜类化合物5～8对炎症介质NO的抑制作用较好，可用于制备抗炎药物。

由于BV-2细胞炎症与阿尔兹海默症(AD)发展具有重要影响，因此对BV-2细胞具有抗炎活性的化合物5～8也可用于制备抗阿尔兹海默症的药物。

另外，也可以将化合物5～8的互变异构体、药学可接受的盐用于制备抗炎药物、治疗阿尔兹海默症的药物，并可配合药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂、抗氧剂结合制成口服剂、注射剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、片剂、栓剂、膜剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释与控释剂、靶向制剂或粉剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。