采用β-葡萄糖苷酶抑制剂对草菇进行冷藏保鲜的方法
阅读说明：本技术 采用β-葡萄糖苷酶抑制剂对草菇进行冷藏保鲜的方法 (Method for refrigerating and preserving straw mushrooms by adopting beta-glucosidase inhibitor ) 是由 龚明 邹根 万佳宁 鲍大鹏 黄天宇 李正鹏 唐利华 于 2021-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了采用草菇β-葡萄糖苷酶抑制剂对草菇进行冷藏的方法,所述的β-葡萄糖苷酶抑制剂的结构式依次如下所示：将草菇β-葡萄糖苷酶抑制剂Conduritol B epoxide(CB)和D-Glucono-1,5-lactone(DG)分别加水,使得β-葡萄糖苷酶抑制剂CB和DG的浓度为150μM和300μM,将蛋形期草菇浸泡在上述溶液中2min,然后在4℃进行储存。本发明发现浓度为150μM的草菇β-葡萄糖苷酶抑制剂CB和300μM的草菇β-葡萄糖苷酶抑制剂DG对子实体冷藏保鲜效果最佳。(The invention provides a method for refrigerating straw mushrooms by adopting a straw mushroom beta-glucosidase inhibitor, wherein the structural formula of the beta-glucosidase inhibitor is sequentially as follows: adding water into Volvariella volvacea beta-glucosidase inhibitor Conduritol B epoxide (CB) and D-Glucono-1,5-lactone (DG) respectively to make the concentration of the beta-glucosidase inhibitor CB and DG 150 μ M and 300 μ M, soaking Volvariella volvacea in the above solution for 2min, and storing at 4 deg.C. The invention discovers that the sub-entity refrigeration and fresh-keeping effects of the straw mushroom beta-glucosidase inhibitor CB with the concentration of 150 mu M and the straw mushroom beta-glucosidase inhibitor DG with the concentration of 300 mu M are optimal.)
技术领域
本发明属于食品领域，涉及一种食品冷藏保鲜技术，具体来说采用β-葡萄糖苷酶抑制剂对草菇进行冷藏保鲜的方法。
背景技术
草菇(Volvariella volvacea)被称为“中国菇”，是一种重要的食用菌。草菇不仅味道鲜美，而且具有重要的医疗保健作用，如抗氧化、调节免疫、抗肿瘤等。草菇肉质鲜美且生长周期短(大约10天左右)，本应成为经济效益很高的食用菌。然而，草菇菌丝的生长和结实要求比较高的温度(28–35℃)，尤其是其菌丝和子实体不耐冷藏，即使在常规冷藏4℃下，菌丝和子实体在短时间内便会软化、液化甚至腐烂，即通常所说的“低温自溶”。草菇“低温自溶”的独特性提出了保鲜难题。所以，一直以来草菇的货架期明显短于其它菇类，使其栽培和普及受到极大地限制，也间接影响了降解秸秆经济效益的发挥。
对草菇保鲜技术方面的研究已有展开，但都通过作用于草菇子实体进行保鲜。例如，采用乙烯利和1-甲基环丙烯(1-MCP)作用于蛋形期的草菇；采用化学药剂浸泡方法对草菇保鲜进行研究，例如壳聚糖复合膜浸泡处理；采用表面冷藏风干处理和微波加热杀菌处理等物理方式对草菇保鲜。将这些技术作用于采收后的草菇子实体，普遍存在效果不显著、影响品质等问题。并且这些技术都作用于草菇子实体15℃低温保鲜研究，在4℃冷藏保鲜的技术缺乏研究。
近来研究证实了一种类型的草菇泛素化结合酶E2(a type of ubiquitin-conjugating E2 enzyme，UBEV2)是促进低温自溶的效应因子，通过加入UBEV2的小分子抑制剂L345-0044能够一定程度抑制低温自溶，减少冷压对草菇的伤害。在此基础上，利用绝对定量转录组和非靶向代谢物组联合组学分析冷压作用下UBEV2抑制剂(L345-0044)处理的子实体的基因和代谢物表达谱来挖掘UBEV2介导的下游通路的酶，以此来研发草菇冷藏保鲜技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用β-葡萄糖苷酶抑制剂对草菇进行冷藏保鲜的方法，所述的这种对草菇进行低温保鲜的方法要解决现有技术中对草菇子实体无法进行冷藏保鲜、实用性不强、食品安全性等问题。
本发明提供了采用β-葡萄糖苷酶抑制剂对草菇进行保鲜的方法，所述的草菇β-葡萄糖苷酶抑制剂结构式为CB或者DG型，如下所示：
将β-葡萄糖苷酶抑制剂加水，如果β-葡萄糖苷酶抑制剂为CB型，加水后使得β-葡萄糖苷酶抑制剂CB的浓度为150μM，然后对蛋形期草菇进行浸泡2min，然后在1-6℃进行储存；如果β-葡萄糖苷酶抑制剂为DG型，加水后使得β-葡萄糖苷酶抑制剂DG的浓度为300μM，然后对蛋形期草菇进行浸泡2min，然后在1-6℃进行储存。
具体的，CB和DG分别为Conduritol B epoxide(CAS No.:6090-95-5)和D-Glucono-1,5-lactone(CAS No.:90-80-2)。
进一步的，在4℃进行储存。
本发明还提供了β-葡萄糖苷酶抑制剂作为草菇保鲜剂的用途，所述的β-葡萄糖苷酶抑制剂的结构式分别为CB和DG型，如下所示：
CB和DG的浓度分别为150μM和300μM。
本发明通过设计不同浓度和类型的β-葡萄糖苷酶抑制剂溶液进行草菇抗冻实验验证，为草菇冷藏保鲜技术的研发提供最优的方案。本发明基于已报道的UBEV2抑制剂小分子化合物L345-0044对草菇冷藏保鲜具有一定的改善作用，设计实验来挖掘位于UBEV2介导的下游通路的靶标基因，进而研发可推广性强及安全性的草菇冷藏保鲜技术。
本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明采用β-葡萄糖苷酶抑制剂溶液对草菇处理进行冷藏保鲜的方法，具有以下优点：
(1)明确了β-葡萄糖苷酶作为UBEV2介导的下游通路的靶标基因，通过抑制该酶活性就可以达到草菇冷藏保鲜的目的。
(2)鉴于DG作为食品添加剂(StandardNo:GB 7657-2005)广泛应用在食品工业中，采用DG进行草菇子实体浸泡能够较好的解决抑制剂化合物浸泡带来的食品安全性问题。
(3)由于DG的市场成本较低(纯度98％，1kg价格大约500元)，较好的解决了采用抑制剂化合物溶液浸泡草菇子实体进行冷藏保鲜的成本问题。
(4)较好的解决了利用β-葡萄糖苷酶抑制剂溶液进行草菇冷藏保鲜的浓度和剂量问题。
附图说明
图1浸泡处理下的草菇子实体的4℃冷藏实验。0H为水浸泡处理2min的子实体，24H为水浸泡处理2min的4℃冷藏24h的子实体，L24H为150μM的L345-0044浸泡处理2min的4℃冷藏24h的子实体。
图2草菇绝对定量转录组的主成分分析，子实体样品编号参照图1标题注释。
图3草菇非靶向代谢组的基峰色谱图，子实体样品编号参照图1标题注释。
图4显示了绝对定量转录组和代谢组获得的显著差异基因，(|log2FoldChange|>1,P-value<0.05)和显著差异代谢物(p-value≤0.05和VIP≥1)的关联性化合物。
图5显示了绝对定量转录组和非靶向代谢组获得的显著差异基因和显著差异代谢物的关联性酶。
图6显示了淀粉和蔗糖代谢的KEGG通路图(Ko00500)。
图7显示了草菇β-葡萄糖苷酶的基因表达的热图分析，h代表小时。子实体样品编号参照图1标题注释。
图8显示了草菇β-葡萄糖苷酶的qPCR分析。h代表小时，子实体样品编号参照图1标题注释。
图9显示了草菇β-葡萄糖苷酶的western blot分析，h代表小时。子实体样品编号参照图1标题注释。
图10显示了草菇β-葡萄糖苷酶的酶活力。子实体样品编号参照图1标题注释。
图11显示了β-葡萄糖苷酶抑制剂CB的结构式。
图12显示了β-葡萄糖苷酶抑制剂CB(300μM)处理下的草菇4℃冷藏实验。h代表小时。
图13显示了β-葡萄糖苷酶抑制剂CB(150μM)处理下的草菇4℃冷藏实验。h代表小时。
图14显示了β-葡萄糖苷酶抑制剂CB(300μM)处理下的草菇β-葡萄糖苷酶的酶活分析。GC-case代表β-葡萄糖苷酶抑制剂CB处理。h代表小时。
图15显示了β-葡萄糖苷酶抑制剂DG的结构式。
图16显示了β-葡萄糖苷酶抑制剂DG处理下的草菇4℃冷藏实验。DG处理浓度分别为150μM,300μM,1000μM。h代表小时。
具体实施方式
实施例1
①浸泡处理的子实体的4℃冷藏实验
参考文献(万佳宁等."草菇UBEV2蛋白同源模建筛选其小分子抑制剂."食用菌学报，2020)，L345-0044(来自ChemDiv化合物数据库)是一种UBEV2抑制剂，使用150μM的L345-0044溶液浸泡处理草菇子实体2min,对照采用水处理，然后分别放入4℃进行24h，48h冷藏实验。其中，0H为对照处理子实体，24H为水浸泡处理的4℃冷藏24h的子实体，L24H为150μM的L345-0044浸泡处理的4℃冷藏24h的子实体(图1)。
②4℃冷藏下的浸泡处理样品的绝对定量转录组分析
对浸泡处理的样品放入到4℃进行24h冷藏实验，提取对应样品进行绝对定量转录组分析，主要步骤为：样品经过RNA抽提、定量、纯化、建库之后，采用第二代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)，基于Illumina测序平台，对这些文库进行双末端(Paired-end，PE)测序。对测序获得reads进行过滤，然后与参考基因组比对处理，获得基因的表达数据,以此进行样品间的表达量分析。对获得基因表达数据进行主要成分分析，结果显示L345-0044处理后的样品与对照样品明显分离(图2)，表明经L345-0044处理后的样品和水处理的样本在冷压中的表达谱明显不一样。
③4℃冷藏下的浸泡处理样品的非靶向代谢组分析
用LC-MS/MS检测18个子实体(0H、24H和L24H各6个)的代谢产物，主要步骤为：样品经过代谢物提取，部分样品混合进行质量控制，然后剩余样品上机进行LC-MS检测。采用Thermo Ultimate 3000系统配备ACQUITYHSS T3(150×2.1mm,1.8μm,Waters)进行色谱分离。采用Thermo Q Exactive HF-X进行质谱鉴定。从基峰色谱(BPC)可以看出，经过L345-0044处理后，三种处理后的样品在ESI正负离子模式下存在不同程度的差异(图3)，表明在4℃冷藏中，经L345-0044处理后的样品和水处理后样本的代谢谱明显不一样。
实施例2
①绝对定量转录组和非靶向代谢组的关联性分析
将24H_vs_L24H中差异表达的代谢物与基因进行相关性分析，得到相关的差异基因(>3)和差异代谢物(图4),例如葡萄糖1-磷酸(C00103)和纤维二糖(C00185)。这些基因的EC注释显示，β-葡萄糖苷酶(3.2.1.21)是数量第二多的酶(图5)。KEGG通路(Ko00500)显示葡萄糖1-磷酸和纤维二糖参与淀粉和蔗糖代谢，其中β-葡萄糖苷酶负责纤维素二糖分解生成D-葡萄糖(图6)。
②草菇β-葡萄糖苷酶的qPCR和western blot分析
β-葡萄糖苷酶表达的热图分析显示，L345-0044溶液处理下调了β-葡萄糖苷酶的表达(图7)，提示了β-葡萄糖苷酶下调表达对于草菇的抗冻是必须的。热图分析还显示了3个β-葡萄糖苷酶基因在24H上调表达。qPCR实验证实它们在24H表达上调，尤其是VVO_08574在24H异常高表达(图8)。利用SignalP 5.0预测VVO_08574具有信号肽的概率为93.193％(信号肽类型:Sec/SPI)，提示VVO_08574很有可能属于胞外酶。β-葡萄糖苷酶的Westernblot实验显示约70kDa的条带在24H消失(图9)。VVO_08574的分子量为71.35kDa正好在此范围内，该结果证实了VVO_08574属于胞外酶。这些结果表明，冷压诱导了胞外β-葡萄糖苷酶的分泌。
③草菇β-葡萄糖苷酶的酶活分析
β-糖苷酶活性验证结果表明，24H的酶活力值最高(图10)。对24H渗出液中β-葡萄糖苷酶的活性进行检测，测定的ΔA(荧光读数)平均值为0.2809(S.D.＝0.003)，证实冷压诱导胞外β-葡萄糖苷酶的分泌。考虑到L24H没有渗出液，而24H具有渗出液，这就表明冷压处理24H的β-糖苷酶酶活力比实际检测的还要高。
实施例3
①浸泡处理下的子实体的4℃冷藏实验
实施例2的结果提示冷压刺激了β-葡萄糖苷酶活力，导致了低温自溶。将β-葡萄糖苷酶抑制剂CB(图11)和DG分别加水，使得β-葡萄糖苷酶抑制剂CB和DG的浓度依次为150μM和300μM，分别对蛋形期草菇进行浸泡2min，对照采用水处理，然后分别放入4℃进行24h和48h冷藏实验。抗冻试验表明，分别用150μM的CB和300μM的DG浸渍的草菇蛋形期子实体在冷压处理下外形饱满、颜色鲜亮、硬度较硬，明显优于对照处理(图12和图16)。例如，经冷压处理24h后，150μM的CB和300μM的DG溶液浸泡处理的草菇子实体，质地饱满，色泽鲜艳，表面干燥(图12和图16)。相比之下，经过冷压处理24h后，H2O浸泡后草菇蛋形期子实体变软，部分褐变。冷压处理24h后，只有H2O处理才能形成渗出液，CB和DG处理没有这种情况。与水处理相比，冷压处理48h后CB和DG溶液处理较好地保持了子实体的形状，但存在子实体变软，部分褐变，形成渗出液的现象(图12和图16)。
②浸泡处理下的子实体在4℃冷藏中的酶活试验
β-葡萄糖苷酶活性验证结果表明，在24小时冷藏保存中，CB处理明显降低了草菇β-葡萄糖苷酶活性，这与H2O处理的草菇β-葡萄糖苷酶活性升高不同(图13)。以上结果表明β-葡萄糖苷酶抑制剂浸泡通过降低β-葡萄糖苷酶活性改善草菇的抗冻作用，延长草菇的冷藏保鲜时间。
对比例1
(1)采用水作为对照处理，进行浸泡2分钟实验。
(2)结果显示：经过水处理的子实体，在24小时冷藏保存中，菇体出现萎缩，塌陷，部分褐变。在48小时冷藏保存中，菇形已经严重变形，塌陷(图12)。
对比例2
(1)采用300μM的CB溶液作为对照，进行浸泡2分钟实验。
(2)结果显示：经过300μM的CB溶液处理的子实体，在24小时冷藏保存中，菇形保持较为完好，但表面湿润；切面图显示子实体出现了轻微褐变现象。在48小时冷藏保存中，菇体已经变形，部分塌陷，溶解(图14)。
对比例3
(1)采用150μM的DG(图15)溶液作为对照，进行子实体浸泡2分钟实验。
(2)结果显示：经过150μM溶液处理的子实体，在24小时冷藏保存中，菇形保持较为完好，但菇体表面湿润。在48小时冷藏保存中，菇体已经出现部分变形，塌陷和溶解，存在大量渗出液(图16)。
对比例4
(1)采用1000μM的DG(图16)溶液作为对照，进行子实体浸泡2分钟实验。
(2)结果显示：经过1000μM溶液处理的子实体，在24小时冷藏保存中，菇形保持较为完好，但菇体顶部微塌。切面图显示子实体出现了轻微褐变现象。在48小时冷藏保存中，菇体已经出现部分变形，塌陷和溶解，存在大量渗出液(图16)。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
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