阅读说明：本技术 一种利用糖蜜及羽毛水解粉高密度发酵合成谷胱甘肽的方法 (Method for synthesizing glutathione by high-density fermentation of molasses and feather hydrolyzed powder ) 是由 蔡俊 于 2019-12-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用糖蜜高密度发酵合成谷胱甘肽的方法,该方法以酿酒酵母为发酵菌种,以糖蜜为碳源、羽毛水解粉等为氮源,在发酵过程采用多级变速流加碳源、氮源和磷源的方法进行发酵,并在规定的时间内恒速流加一定配比的谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸,不添加ATP,发酵34-36小时,酵母细胞干重达到50-90g/L,谷胱甘肽产量高达10000-16000mg/L,实现谷胱甘肽的高密度培养。(The invention relates to a method for synthesizing glutathione by high-density fermentation of molasses, which takes saccharomyces cerevisiae as a fermentation strain, molasses as a carbon source, feather hydrolyzed powder and the like as a nitrogen source, adopts a method of multi-stage variable-speed flow addition of the carbon source, the nitrogen source and a phosphorus source to carry out fermentation in the fermentation process, and constantly flows and adds glutamic acid, cysteine and glycine with a certain ratio in a specified time, ATP is not added, the fermentation lasts for 34-36 hours, the dry weight of yeast cells reaches 50-90g/L, the yield of glutathione reaches 10000-.)

一种利用糖蜜及羽毛水解粉高密度发酵合成谷胱甘肽的方法

技术领域

本发明涉及一种利用酿酒酵母高密度发酵合成谷胱甘肽的方法，特别涉及一种利用农副资源高密度发酵合成谷胱甘肽的方法。

技术背景

谷胱甘肽（GSH）是一种由甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸组成的三肽化合物，谷胱甘肽具有还原型和氧化型两种形式，两分子还原性谷胱甘肽的巯基(-SH)经氧化脱氢得到氧化型谷胱甘肽，还原型谷胱甘肽具有生理活性，例如其较好的抗氧化性和清除自由基作用，在***、癌症、中毒和抗辐射等方面有明显的治疗效果。因此，高谷胱甘肽含量的酿酒酵母在医疗、食品、化妆品及动物保护等领域具有广泛的市场前景。

总的来说谷胱甘肽的生产方法主要包括萃取法、化学合成法、酶法和发酵法。其中萃取法原料主要来源于动植物组织，具有难以获得且含量极低的缺点；化学合成法主要是通过化学的方法将三种前体氨基酸合成GSH，但操作复杂，分离纯化困难，纯度低，环境污染严重；其中酶法合成主要利用γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSHⅠ）和谷胱甘肽合成酶（GSHⅡ）在ATP的存在下催化三种氨基酸合成谷胱甘肽，但该方法成本太高，不适合大规模生产，综上所述发酵法工业化大规模生产谷胱甘肽最具潜力、最实用的方法，因为其方法简单、成本低、污染小。但目前国内谷胱甘肽的发酵生产存在以下几个方面的问题：1、野生型产谷胱甘肽微生物谷胱甘肽合成产率低；2、酵母高密度发酵合成谷胱甘肽过程中的代谢调控不完善，发酵周期长；3、谷胱甘肽的合成和酵母细胞的生物量没法同时达到较高水平4、谷胱甘肽在水溶液中极易被氧化，导致在谷胱甘肽提取过程中损失大。由于这些因素的制约，使谷胱甘肽的生产受到很大的影响。

谷胱甘肽的发酵生产已有一些报道，如：专利CN1450168，以产朊假丝酵母WSH02-08为菌株，以葡萄糖为主要碳源，在发酵过程中一次性添加L-半胱氨酸，在7L发酵罐中发酵24h，细胞干重14-16g/L，干细胞谷胱甘肽含量400-520mg/L，其生物量和谷胱甘肽含量均较低。专利CN101235405，以葡萄糖为主要碳源，在7L发酵罐中发酵30h，谷胱甘肽含量320mg/L。专利CN101245363，以葡萄糖为主要碳源，在发酵中后期流加L-半胱氨酸、L-甘氨酸、 L-谷氨酸，在7L发酵罐中发酵92h，谷胱甘肽含量650mg/L。专利CN101429537以葡萄糖为主要碳源，在发酵中后期流加L-半胱氨酸、L-甘氨酸、 L-谷氨酸，发酵42h，生物量128g/L，谷胱甘肽含量2080mg/L。专利CN101824451A，以葡萄糖为主要碳源，在发酵中后期大量流加葡萄糖，发酵48h，生物量91.2g/L，谷胱甘肽含量825.0mg/L。专利CN101880702A，以葡萄糖为主要碳源，在发酵过程中中滴加复合维生素B和含硫氨基酸，发酵65-75h，谷胱甘肽含量7000-10000mg/L。专利CN103014104A，以巴斯德毕赤酵母Pichia.pastoris SL1220为菌株，在发酵后期流加L-半胱氨酸，在50L发酵罐中发酵55h，谷胱甘肽含量5840mg/L。

甘蔗糖蜜又称糖浆，是制糖工业将压榨出的甘蔗汁液，经加热、中和、沉淀、过滤、浓缩、结晶等工序制糖后所剩下的浓稠液体，是糖厂的副产品之一。甘蔗糖蜜成分复杂，包括蛋白质、维生素、有机酸和一些金属离子，且含糖量很高，一般占到 30 %～50 %，是发酵、饲料、食品和建筑行业中常见原料，但其中还混有大量的非糖成分和杂质，如含有5 %～10%的胶体物质（主要由果胶质、焦糖和黑色素等组成），会降低发酵效率，色素、重金属和糠醛等物质也会对酵母的生长繁殖产生不利的影响。目前酵母生产谷胱甘肽的培养基主要以葡萄糖为碳源，后期还要流加氨基酸前体，导致生产成本过高，企业利润空间低。

羽毛水解粉为脱落的羽毛及制作羽绒制品筛选后的毛梗，经清洗、高温高压水解处理、干燥和粉碎制成的粉粒状物质，目前羽毛水解物主要用于动物饲料，未见有用于酵母菌发酵的报道。

发明内容

本发明针对现有技术的空白和不足，旨在提供一种利用糖蜜及羽毛水解粉高密度发酵合成谷胱甘肽的方法，本发明能有效利用农副资源（糖蜜）及羽毛水解粉进行高密度发酵大量合成谷胱甘肽的方法，该方法发酵周期短，酵母细胞干重达到50-90g/L，谷胱甘肽产量高达10000-16000mg/L。

为了实现本发明，发明人通过大量试验反复研究工艺技术参数，并终于获得了一种利用糖蜜及羽毛水解粉高密度发酵合成谷胱甘肽的方法，具体如下：

（1）酿酒酵母（酿酒酵母CICC1532）接种于试管斜面上活化，30℃培养40-48h，然后将活化后的酿酒酵母接入液体种子培养基中，28-32℃，180-200rpm振荡培养20-24h，得到高活性酵母细胞；

其中活化斜面培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，胰蛋白胨20g/L，琼脂20g/L，pH5.5-6.5；液体种子培养基为：蔗糖 50g/L，酵母粉20g/L，磷酸二氢钾 1.0g/L，硫酸镁1.0g/L，pH 6.0-6.5；

（2）将糖蜜进行预处理，过滤分离，取滤液加入0.001-0.005%（W/V）的硫化钠，充分搅拌30-50分钟，静置1-2小时，再过滤分离，取滤液先加入果胶酶50℃反应1-2小时，然后再加入木瓜蛋白酶反应2-3小时，稀释至含糖量为26%～28%，最后用酸调节pH至5.0～6.0，混合均匀，备用；

所述果胶酶的用量为：每升滤液中加入10-30U的果胶酶；

所述木瓜蛋白酶的用量为：每升滤液中加入25-55U的木瓜蛋白酶；

所述果胶酶、木瓜蛋白酶的酶活分别为4000U/g、 2000U/g；

（3）羽毛水解粉的制备：取鸡的羽毛，用剪刀剪成长1-2cm，宽1-3cm大小的小段，加入羽毛质量2倍的水，在120-150℃下处理1-3小时，再加入羽毛质量2倍的水，待温度至40-60℃后，按1Kg羽毛加入1000-1500U的角蛋白酶，在50-55℃、pH5.5-6.5条件下酶解2-3小时，升温至90-100℃维持30-50分钟，得到羽毛水解液，水解液喷雾干燥后即为羽毛水解粉；

（4）将步骤（1）的活性酵母细胞接种于装有底水的发酵罐中发酵，温度28～32℃，发酵23～36h，当生物量湿重达到150-170g/L时开始流加谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸，控制流加速度在4-6小时内流加完毕，整个发酵过程多级变速流加碳源、氮源、磷源，且整个发酵过程中发酵液中酒精的含量控制在0.1%～0.3%（W/V）；

所述流加碳源为糖蜜和/或葡萄糖；

所述流加氮源为羽毛水解粉、硫酸铵；

所述流加磷源为磷酸二氢铵。

优选地，如上所述的一种利用糖蜜及羽毛水解粉高密度发酵合成谷胱甘肽的方法，所述步骤（4）中的谷氨酸浓度为4-6mmol/L、半胱氨酸浓度为4-6mmol/L、甘氨酸浓度为2-5mol/L。

优选地，如上所述的一种利用糖蜜及羽毛水解粉高密度发酵合成谷胱甘肽的方法，所述步骤（4）中多级变速流加碳源、氮源、磷源的方法为：

在50L发酵罐中，流加碳源为糖含量27%的糖蜜及浓度为290 g/L的葡萄糖，发酵前期0-7小时，糖蜜的流加速度为：20mL/h～100mL/h，通风0.5-1.5 m3/h，转速100-400 rpm;发酵中期8-26小时，糖蜜的流加速度为：100mL/h～650mL/h，通风2.0-4.0 m3/h，转速400-600rpm;发酵后期27-34小时，糖蜜的流加速度为：250mL/h～300mL/h，同时流加葡萄糖：250mL/h～480mL/h，溶氧量控制在10-20%，发酵最后阶段，34-36小时，停止流加碳源；

流加氮、磷源的配方为尿素80g/L、硫酸铵35g/L和磷酸二氢钾60g/L；发酵0-24小时，氮、磷源的流加速度为100mL/h～150mL/h，发酵后期24-34小时，停止流加磷源，只流加氮源：60mL/h～100mL/h；

发酵到30-32小时，生物量干重达到50g/L～90g/L，开始流加谷氨酸4-6mmol/L、半胱氨酸4-6mmol/L、甘氨酸2-5mol/L，控制流加速度，在4-6小时内流加完毕。

在200M3发酵罐中，多级流加发酵：发酵温度28-32 ℃，发酵周期23 h，发酵前期0-13小时，糖蜜的流加速度为：800L/h～4000L/h，通风3500-10000 m3/h，发酵后期13-22小时，糖蜜的流加速度为：2000L/h～4000L/h，通风2000-5000 m3/h，发酵最后1小时停止流加，空耗1小时。

发酵0-24小时，氮、磷源的流加速度为100mL/h～150mL/h，发酵后期24-34小时，停止流加磷源，只流加氮源：60mL/h～100mL/h。发酵到30-32小时，生物量干重达到50g/L～90g/L，开始流加谷氨酸4-6mmol/L、半胱氨酸4-6mmol/L、甘氨酸2-5mol/L，控制流加速度，在4-6小时内流加完毕，整个发酵过程中发酵液中酒精的含量控制在0.1%～0.3%（W/V）。

本发明涉及的利用糖蜜高密度发酵合成谷胱甘肽的方法具有如下优点和显著的进步：

其一，采用的原料为可再生生物资源糖蜜及羽毛水解粉；

其二，在50L发酵罐中，采用变速流加碳源、氮源及磷源，在规定的时间内恒速流加一定配比的谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸，不添加ATP，发酵34-36小时，酵母细胞干重达到50-90g/L，谷胱甘肽产量高达10000-16000mg/L；以糖蜜、羽毛水解粉为原料，采用同样的发酵工艺，在200M3发酵罐中，发酵23小时，酵母细胞干重达到50-90g/L，谷胱甘肽产量高达10000-15000mg/L。

具体实施方式

以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1:摇瓶种子培养制备高活性酿酒酵母细胞

（1）菌株：

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1532，湖北工业大学生物工程209实验室保藏。

（2）培养基：

斜面培养基含有：葡萄糖2%，酵母粉1%，胰蛋白胨2%，琼脂2%，斜面培养基pH 5.5-6.5；

液体种子培养基含有：蔗糖 5%，酵母粉2%，磷酸二氢钾 0.1%，硫酸镁 0.1%，斜面培养基pH 6.0-6.5；

（3）种子扩大培养：

斜面种子活化40-48小时后接入装入种子培养基的三角瓶中培养，装液量250mL/300mL，20-24小时即得高活性酿酒酵母细胞；

实施例 2 50L发酵罐上采用流加发酵合成谷胱甘肽

（1）菌株：同实施例1。

（2）培养基：

斜面培养基同实施例1；

液体种子培养基同实施例1；

所述发酵罐水平上发酵中底水含有：水13 L，酵母粉180g；硫酸镁15g；硫酸锌3g，pH自然，另加5mL的消泡剂。

流加碳源：流加碳源的体积为8.0L ，包括预处理糖蜜6L，糖含量27%；葡萄糖2L，浓度290 g/L，115℃灭菌30分钟。

流加氮源：流加氮源的体积为3L，配方为：羽毛水解粉64 g/L、硫酸铵69 g/L；

流加磷源：流加磷源的体积为1L，配方为：磷酸氢二铵28 g/L。

流加前体氨基酸：流加前体氨基酸的体积为1.0L，配方为：谷氨酸4-6mmol/L、半胱氨酸4-6mmol/L、甘氨酸2-5mol/L。

（3）发酵培养

多级流加发酵：将实例1中制得的高活性酿酒酵母细胞按10%（V/V）的接种量接入装有13 L底水的50L全自动发酵罐中，发酵温度32℃，发酵周期34-36 h。发酵前期0-7小时，糖蜜的流加速度为：60mL/h，通风1.0 m3/h，转速150 rpm;发酵中期8-26小时，糖蜜的流加速度为：180 mL/h，通风3.0 m3/h，转速500 rpm;发酵后期27-34小时，糖蜜的流加速度为250mL/h，同时流加葡萄糖，其流加速度为250mL/h，溶氧量控制在10-20%，发酵最后阶段，34-36小时，停止流加碳源。

发酵0-24小时，氮、磷源的流加速度为100mL/h，发酵后期24-34小时，停止流加磷源，只流加氮源：80 mL/h。

生物量干重达到50g/L～90g/L，开始流加谷氨酸5mmol/L、半胱氨酸4mmol/L、甘氨酸4mol/L，控制流加速度，在5小时内流加完毕。整个发酵过程中发酵液中酒精的含量控制在0.2%（W/V）。

（4）细胞干重的测定

取1L发酵液离心后用蒸馏水洗涤3次，得到的新鲜细胞在105℃烘干至恒重。

（5）谷胱甘肽含量的测定采用高效液相色谱法，其方法为：准确称取2-3g发酵液离心后用蒸馏水洗涤3次的酵母样品，将其悬浮在50mL的去离子水中，冷冻结冰，然后在90℃温差下迅速融化，保温20分钟，反复进行两次，测定破壁率，然后定容至100mL，离心取上清液5mL稀释3倍体积，然后进高效液相色谱检测。高效液相色谱检测条件：柱子：C18，15cm×4.6mm，5μm；波长：200nm流动相：称取0.05mol磷酸二氢钾和2.2g的庚烷磺酸钠，用纯化水配制成1L，用磷酸调至pH=3.0。流速：1.0mL/min）。

（6）结果：

发酵时间：36小时；细胞干重：70g/L；

胞内谷胱甘肽含量：150mg/g；

发酵液中谷胱甘肽的产量为：10.5g/L。

实施例3 200m3发酵罐上采用流加发酵合成谷胱甘肽

（1）菌株：同实施例1。

（2）培养基

斜面培养基含有：同实施例1；

液体种子培养基含有：同实施例1；

所述发酵罐水平上发酵中底水含有：水65000 L，酵母浸膏200 kg；硫酸镁50 kg，自然pH。

流加碳源：预处理糖蜜50000 L，糖含量24 %。

流加氮源：流加氮源的体积为15000L，配方为：羽毛水解粉64 g/L、硫酸铵69 g/L;

流加磷源：流加磷源的体积为10000L，配方为：磷酸氢二铵28 g/L;

流加前体氨基酸：流加前体氨基酸的体积为3000L，配方为：谷氨酸4-6mmol/L、半胱氨酸4-6mmol/L、甘氨酸2-5mol/L。

（3）发酵培养

多级流加发酵：发酵温度28-32 ℃，发酵周期23 h。发酵前期0-13小时，糖蜜的流加速度为：800L/h～4000L/h，通风3500-10000 m3/h，发酵后期13-22小时，糖蜜的流加速度为：2000L/h～4000L/h，通风2000-5000 m3/h，发酵最后1小时停止流加，空耗1小时。

发酵0-13小时，氮、磷源的流加速度为120mL/h，发酵后期14-23小时，停止流加磷源，只流加氮源：80mL/h。

生物量干重达到50g/L～90g/L，开始流加谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸，控制流加速度，在4-6小时内流加完毕。整个发酵过程中发酵液中酒精的含量控制在0.1%～0.3%（W/V）。

（5）细胞干重的测定

取1L的发酵液离心后用蒸馏水洗涤3次，得到的新鲜细胞在105℃烘干至恒重。

（6）谷胱甘肽含量的测定

采用高效液相色谱法，同实施例2。

（7）结果：

发酵时间：23小时；细胞干重：68g/L；

胞内谷胱甘肽含量：155mg/g；

发酵液中谷胱甘肽的产量为：10.54g/L。

对比实施例1 不流加羽毛水解粉

（1）菌株

酿酒酵母：同实施例1。

（2）培养基及流加碳源、氮源、磷源配置：不流加羽毛水解粉，其他均与实施例1相同。

（3）发酵培养方法：同实施例1。

（4）细胞干重的测定：方法同实施例1，同实施例1。

（5）谷胱甘肽含量的测定采用高效液相色谱法，同实施例1。

（6）结果：

发酵时间：36小时；细胞干重：42g/L；

胞内谷胱甘肽含量：66mg/g；

发酵液中谷胱甘肽的产量为：2.772g/L。

对比实施例2 流加碳源为290g/L葡萄糖溶液

（1）菌株

酿酒酵母：同实施例1。

（2）培养基及流加碳源、氮源、磷源配置：除流加碳源为290g/L葡萄糖溶液外，其他均与实施例1相同。

（3）发酵培养方法：同实施例1，流加碳源不含糖蜜，仅为290g/L葡萄糖溶液。

（4）细胞干重的测定：方法同实施例1，同实施例1。

（5）谷胱甘肽含量的测定采用高效液相色谱法，同实施例1。

（6）结果：

发酵时间：36小时；细胞干重：32g/L；

胞内谷胱甘肽含量：53mg/g；

发酵液中谷胱甘肽的产量为：1.696g/L。