阅读说明：本技术 一种炮天雄均一多糖及其制备方法及应用 (Radix aconiti carmichaeli uniform polysaccharide, and preparation method and application thereof ) 是由 覃军 邓广海 罗明超 龚又明 陈文良 林华 胡黎 郑显辉 陈艳红 于 2018-07-24 设计创作，主要内容包括：本发明申请公开了一种炮天雄均一多糖及其制备方法及应用,其分子量为1.41×10<Sup>5</Sup>Da,并由鼠李糖、甘露糖、岩藻糖和葡萄糖组成。炮天雄均一多糖的制备方法具体如下：取炮天雄饮片,Sevage法脱蛋白及XAD-16型树脂脱色素等方法去除粗多糖中的非糖杂质,并采用离子交换DEAE FAST FLOW层析柱和Superdex-200凝胶层析柱进行进一步的分离纯化得到炮天雄均一多糖。本发明方法制得的炮天雄多糖为均一多糖,得率高,具有抗氧化和神经保护活性,可以清除DPH自由基、ABST+,还原力测定强,可用于制备抗氧化剂和神经保护制剂。(The invention discloses a uniform polysaccharide of radix aconiti lateralis preparata, a preparation method and application thereof, wherein the molecular weight of the uniform polysaccharide is 1.41 multiplied by 10 5 Da and consists of rhamnose, mannose, fucose and glucose. The preparation method of the uniform polysaccharide of the radix aconiti lateralis preparata comprises the following steps: removing non-sugar impurities from crude polysaccharide by Sevage deproteinization and XAD-16 resin depigmentation, and further separating and purifying with ion exchange DEAE FAST FLOW chromatographic column and Superdex-200 gel chromatographic column to obtain radix Aconiti Preparata homogeneous polysaccharide. The prepared radix aconiti lateralis preparata polysaccharide is homogeneous polysaccharide, has high yield, antioxidant and neuroprotective activity, capacity of eliminating DPH free radical and ABST +, powerful reducing capacity measurement and other advantagesCan be used for preparing antioxidant and neuroprotective preparation.)

一种炮天雄均一多糖及其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及医药学的技术领域，尤其是一种炮天雄均一多糖及其制备方法及应用。

背景技术

中国中药杂志，1998，23(6)：348-350；国家药典委员会。(曹晖，王春燕，王孝涛.毒性中药天雄炮制历史沿革研究[J].天雄为毛茛科植物卡氏乌(Aconitum carmichaeliDebx.)的侧根，炮天雄为天雄经高温炮制的加工品，为附子饮片商品规格之一。

中国药典2015年版：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：192) 《神农本草经》记载炮天雄功效主要有温阳、止痛、祛风。

中国中药杂志，2001，26(6)：369-372；覃军、邓广海、陈艳红等.响应面法优化岭南炮天雄生物碱提取工艺[J].(曹晖，王时桃，吴连英等.香港市售天雄补肾助阳药效学研究[J].现代研究表明，炮天雄补阳补虚的功效比附子强，且毒性大大降低。炮天雄高效低毒的特性使其在岭南，港澳、东南亚地区广泛作为食疗药材以及保健品使用，用于治疗元阳素虚、肾亏阳虚证。

中国医药导报，2017，14(19)：31-34)(高静东，李湧健，陈嘉璐等.复方附子多糖对肿瘤细胞糖基化作用的影响[J].目前，对炮天雄化学成分的研究主要是生物碱，对其他成分的研究尚不深入。多糖是由醛糖或酮糖通过苷键连接在一起的多聚物，广泛存在于植物、动物和微生物中，是构成生命的四大基本物质之一，之前有报道附子多糖具有抗肿瘤、抗氧化作用。

中国中西医结合杂志，2016，36(9)：1103-1106；ZhangAQ，Li XQ，XingC，etal.Antioxidant activity of polysaccharide extracted from Pleurotus eryngiiusing response surface method[J].Im J Bio Macromol.2014，65(5)：28-32)这具有一定的研究价值。炮天雄为附子饮片的一种规格，但因炮天雄选材和炮制工艺的不同，导致炮天雄的功效和性质与附子有所不同，炮天雄选的是附子个大质量较好的，所以所含有效成分较高，炮制时不用切片，有效成分流失减少，因此炮天雄补阳补虚的功效比附子强，因此炮天雄多糖是否具有类似功能并不清楚，且这些数据都是关于粗多糖的，产业化价值有限。

本发明发现多糖是炮天雄主要成分之一，对其开展分离纯化、结构解析和生物活性评价具有十分重要的科学意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种炮天雄均一多糖及其制备方法及应用，通过对炮天雄多糖按分子量进行分级，然后进一步分离纯化，进行结构表征，提供一种由一种单糖分子缩合而成的多糖，有药用价值的炮天雄均一多糖，并对得到的炮天雄均一多糖进行抗氧化活性及神经保护活性的初步研究。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种炮天雄均一多糖，其分子量为1.41×10⁵Da，并由鼠李糖、甘露糖、岩藻糖和葡萄糖组成。

一种炮天雄均一多糖的制备方法，所述的包括如下步骤：

步骤1：将干燥的炮天雄饮片用5～8倍量的乙醇加热冷凝回流2～3次进行脱脂，脱脂后得到药渣；

步骤2：将药渣用5～8倍量的水提2～3次，温度为80～100℃，每次1.5～ 2h，将水提液减压浓缩后，加入无水乙醇至含醇量达80～85％，静置18～24h，弃去上清液，收集沉淀，得到炮天雄粗多糖；

步骤3：将炮天雄粗多糖复溶后加胃蛋白酶至其含量为0.1～0.4％，于32～ 37℃下恒温水浴10～12h，去除沉淀，重复2～3次，收集上层溶液，浓缩，加入Sevage试剂，剧烈振荡20～30min，静置8～12h，收集上层多糖溶液，重复至紫外扫描无蛋白特征吸收峰时止；

步骤4：对上层多糖溶液浓缩后加4～6倍量95～100％乙醇，静置18～24h，收集沉淀，重复2～3次后进行冷冻干燥，得炮天雄粗多糖粉末；

步骤5：将炮天雄粗多糖粉末用蒸馏水完全溶解后经DEAE FAST FLOW离子层析柱分离，洗脱条件：流速为2～2.5ml/min，依次以水、0.05mol/L的氯化钠、0.1mol/L的氯化钠、0.2mol/L的氯化钠、0.3mol/L的氯化钠以及0.1mol/L 的氢氧化钠进行洗脱；利用全自动收集器分梯度收集，每个溶液梯度洗脱2～3 倍柱体积，收集25～30管，每管3～5ml，采用硫酸-苯酚法进行隔管跟踪检测，将收集到的炮天雄多糖溶液浓缩至一定体积后，用3500Da分子量的透析带进行透析，透析带须进行预处理，装透析带的烧杯每天换水3～5次，透析一周后，将透析带内多糖液离心，并将其进行冷冻干燥，得到初步纯化的炮天雄苓多糖；

步骤6：将收集的洗脱液浓缩后用Superdex G-200凝胶柱再分离，以蒸馏水按照流速0.15～0.2ml/min进行洗脱，利用全自动收集器收集，每管3～5m1，苯酚一硫酸法检测后，收集洗脱曲线中的主峰部分；

步骤7：将收集的洗脱曲线中的主峰部分的溶液浓缩后用3500Da的透析袋透析2d脱盐，最后将透析袋内的溶液进行浓缩冷冻干燥，得到炮天雄均一多糖。

进一步地，所述的Sevage试剂中，氯仿与正丁醇的比例为5∶1。

炮天雄均一多糖在制备抗氧化产品或在制备神经保护活性产品的应用。

进一步地，取羟丙甲纤维素、羧甲淀粉钠、微晶纤维素、乳糖、药用淀粉、硬脂镁与炮天雄均一多糖混合搅拌制成片剂，该片剂为抗氧化产品或者神经保护活性产品。

进一步地，取微晶纤维素、药用淀粉与炮天雄均一多糖混合搅排制成片剂，该片为抗氧化产晶或者神经保护活性产品。

进一步地，取微晶纤维素、药用淀粉与炮天雄均一多糖混合搅拌，填入硬胶囊中，制成胶囊剂，该胶囊为抗氧化产品或者神经保护活性产品。

本发明的有益效果是：本发明通过水提醇沉法提取，并采用离子交换DEAE FASTFLOW层析柱和Superdex-200凝胶层析柱进行进一步的分离纯化等方案，得到了分子量为1.41×105Da并由鼠李糖、甘露糖、岩藻糖和葡萄糖组成的炮天雄均一多糖，得率高，得到的炮天雄均一多糖具有抗氧化活性和神经保护活性，可以清除DPH自由基、ABST+，还原力测定强，可用于制备抗氧化和神经保护活性产品，具有一定的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为炮天雄粗多糖组分过DEAE FAST FLOW离子层析柱的洗脱曲线图；

图2为炮天雄均一多糖的HPGPC凝胶色谱图；

图3为炮天雄均一多糖GC-MS.总离子流色谱图；注：(左→右)

图4为炮天雄均一多糖的1R图；

图5为炮天雄均一多糖的1H谱图；注：(左→右)

图6为炮天雄均一多糖的13C谱图。注：(左→右)

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

炮天雄均一多糖，其分子量为1.41×10⁵Da，并由鼠李糖、甘露糖、岩藻糖和葡萄糖组成。

实施例1

炮天雄均一多糖的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将干燥的炮天雄饮片用5倍量的乙醇加热冷凝回流2次进行脱脂，脱脂后得到药渣；步骤2：将药渣用5倍量的水提2次，温度为80℃，每次1.5h，将水提液减压浓缩后，加入无水乙醇至含醇量达80％，静置18h，弃去上清液，收集沉淀，得到炮天雄粗多糖；步骤3：将炮天雄粗多糖复溶后加胃蛋白酶至其含量为0.1％，于32℃下恒温水浴10h，去除沉淀，重复2次，收集上层溶液，浓缩，加入Sevage试剂，剧烈振荡20min，静置8h，收集上层多糖溶液，重复至紫外扫描无蛋白特征吸收峰时止；其中，Sevage试剂中，氯仿与正丁醇的比例为5∶1；步骤4：对上层多糖溶液浓缩后加4倍量95％乙醇，静置18h，收集沉淀，重复2次后进行冷冻干燥，得炮天雄粗多糖粉末；步骤5：将炮天雄粗多糖粉末用蒸馏水完全溶解后经DEAE FASTFLOW离子层析柱分离，洗脱条件：流速为2ml/min，依次以水、0.05mol/L的氯化钠、0.1mol/L的氯化钠、0.2mol/L 的氯化钠、0.3mol/L的氯化钠以及0.1mol/L的氢氧化钠进行洗脱；利用全自动收集器分梯度收集，每个溶液梯度洗脱2倍柱体积，收集25管，每管3ml，采用硫酸-苯酚法进行隔管跟踪检测，将收集到的炮天雄多糖溶液浓缩至一定体积后，用3500Da分子量的透析带进行透析；装透析带的烧杯每天换水3次，透析一周后，将透析带内多糖液离心，并将其进行冷冻干燥，得到初步纯化的炮天雄苓多糖；步骤6：将收集的洗脱液浓缩后用Superdex G-200凝胶柱再分离，以蒸馏水按照流速0.15ml/min进行洗脱，利用全自动收集器收集，每管3ml，苯酚一硫酸法检测后，收集洗脱曲线中的主峰部分；步骤7：将收集的洗脱曲线中的主峰部分的溶液浓缩后用3500Da的透析袋透析2d脱盐，最后将透析袋内的溶液进行浓缩冷冻干燥，得到炮天雄均一多糖。

炮天雄均一多糖在制备抗氧化产品或在制备神经保护活性产品的应用。

炮天雄均一多糖在制备抗氧化产品或在制备神经保护活性产品的应用，取羟丙甲纤维素、羧甲淀粉钠、微晶纤维素、乳糖、药用淀粉、硬脂镁与炮天雄均一多糖混合搅拌制成片剂。

炮天雄均一多糖在制备抗氧化产品或在制备神经保护活性产品的应用，取微晶纤维素、药用淀粉与炮天雄均一多糖混合搅排制成片剂。

炮天雄均一多糖在制备抗氧化产品或在制备神经保护活性产品的应用，取微晶纤维素、药用淀粉与炮天雄均一多糖混合搅拌，填入硬胶囊中，制成胶囊剂。

实施例2

炮天雄均一多糖的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将干燥的炮天雄饮片用6倍量的乙醇加热冷凝回流2次进行脱脂，脱脂后得到药渣；步骤2：将药渣用7倍量的水提2次，温度为90℃，每次1.5h，将水提液减压浓缩后，加入无水乙醇至含醇量达82％，静置20h，弃去上清液，收集沉淀，得到炮天雄粗多糖；步骤3：将炮天雄粗多糖复溶后加胃蛋白酶至其含量为0.2％，于35℃下恒温水浴11h，去除沉淀，重复2次，收集上层溶液，浓缩，加入Sevage试剂，剧烈振荡25min，静置10h，收集上层多糖溶液，重复至紫外扫描无蛋白特征吸收峰时止；其中，Sevage试剂中，氯仿与正丁醇的比例为5∶1；步骤4：对上层多糖溶液浓缩后加5倍量98％乙醇，静置20h，收集沉淀，重复2次后进行冷冻干燥，得炮天雄粗多糖粉末；步骤5：将炮天雄粗多糖粉末用蒸馏水完全溶解后经DEAEFAST FLOW离子层析柱分离，洗脱条件：流速为2ml/min，依次以水、0.05mol/L的氯化钠、0.1mol/L的氯化钠、0.2 mol/L的氯化钠、0.3mol/L的氯化钠以及0.1mol/L的氢氧化钠进行洗脱；利用全自动收集器分梯度收集，每个溶液梯度洗脱2倍柱体积，收集28管，每管4ml，采用硫酸-苯酚法进行隔管跟踪检测，将收集到的炮天雄多糖溶液浓缩至一定体积后，用3500Da分子量的透析带进行透析；装透析带的烧杯每天换水4次，透析一周后，将透析带内多糖液离心，并将其进行冷冻干燥，得到初步纯化的炮天雄苓多糖；步骤6：将收集的洗脱液浓缩后用Superdex G-200凝胶柱再分离，以蒸馏水按照流速0.18ml/min进行洗脱，利用全自动收集器收集，每管4ml，苯酚一硫酸法检测后，收集洗脱曲线中的主峰部分；步骤7：将收集的洗脱曲线中的主峰部分的溶液浓缩后用3500Da的透析袋透析2d脱盐，最后将透析袋内的溶液进行浓缩冷冻干燥，得到炮天雄均一多糖。

炮天雄均一多糖在制备抗氧化产品或在制备神经保护活性产品的应用。

炮天雄均一多糖在制备抗氧化产品或在制备神经保护活性产品的应用，取羟丙甲纤维素、羧甲淀粉钠、微晶纤维素、乳糖、药用淀粉、硬脂镁与炮天雄均一多糖混合搅拌制成片剂。

炮天雄均一多糖在制备抗氧化产品或在制备神经保护活性产品的应用，取微晶纤维素、药用淀粉与炮天雄均一多糖混合搅排制成片剂。

炮天雄均一多糖在制备抗氧化产品或在制备神经保护活性产品的应用，取微晶纤维素、药用淀粉与炮天雄均一多糖混合搅拌，填入硬胶囊中，制成胶囊剂。

实施例3

炮天雄均一多糖的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将干燥的炮天雄饮片用8倍量的乙醇加热冷凝回流3次进行脱脂，脱脂后得到药渣；步骤2：将药渣用8倍量的水提3次，温度为100℃，每次2h，将水提液减压浓缩后，加入无水乙醇至含醇量达85％，静置24h，弃去上清液，收集沉淀，得到炮天雄粗多糖；步骤3：将炮天雄粗多糖复溶后加胃蛋白酶至其含量为0.4％，于37℃下恒温水浴12h，去除沉淀，重复3次，收集上层溶液，浓缩，加入Sevage试剂，剧烈振荡30min，静置12h，收集上层多糖溶液，重复至紫外扫描无蛋白特征吸收峰时止；其中，Sevage试剂中，氯仿与正丁醇的比例为5∶1；步骤4：对上层多糖溶液浓缩后加6倍量100％乙醇，静置24h，收集沉淀，重复3次后进行冷冻干燥，得炮天雄粗多糖粉末；步骤5：将炮天雄粗多糖粉末用蒸馏水完全溶解后经DEAEFAST FLOW离子层析柱分离，洗脱条件：流速为2.5ml/min，依次以水、0.05mol/L的氯化钠、0.1mol/L的氯化钠、 0.2mol/L的氯化钠、0.3mol/L的氯化钠以及0.1mol/L的氢氧化钠进行洗脱；利用全自动收集器分梯度收集，每个溶液梯度洗脱3倍柱体积，收集30管，每管 5ml，采用硫酸-苯酚法进行隔管跟踪检测，将收集到的炮天雄多糖溶液浓缩至一定体积后，用3500Da分子量的透析带进行透析；装透析带的烧杯每天换水5 次，透析一周后，将透析带内多糖液离心，并将其进行冷冻干燥，得到初步纯化的炮天雄苓多糖；步骤6：将收集的洗脱液浓缩后用Superdex G-200凝胶柱再分离，以蒸馏水按照流速0.2ml/min进行洗脱，利用全自动收集器收集，每管 5ml，苯酚一硫酸法检测后，收集洗脱曲线中的主峰部分；步骤7：将收集的洗脱曲线中的主峰部分的溶液浓缩后用3500Da的透析袋透析2d脱盐，最后将透析袋内的溶液进行浓缩冷冻干燥，得到炮天雄均一多糖。

炮天雄均一多糖在制备抗氧化产品或在制备神经保护活性产品的应用。

炮天雄均一多糖在制备抗氧化产品或在制备神经保护活性产品的应用，取羟丙甲纤维素、羧甲淀粉钠、微晶纤维素、乳糖、药用淀粉、硬脂镁与炮天雄均一多糖混合搅拌制成片剂。

炮天雄均一多糖在制备抗氧化产品或在制备神经保护活性产品的应用，取微晶纤维素、药用淀粉与炮天雄均一多糖混合搅排制成片剂。

炮天雄均一多糖在制备抗氧化产品或在制备神经保护活性产品的应用，取微晶纤维素、药用淀粉与炮天雄均一多糖混合搅拌，填入硬胶囊中，制成胶囊剂。

实施例4

一、炮天雄均一多糖的制备

1、炮天雄粗多糖的提取：

取炮天雄药材于圆底烧瓶中，按1∶10(g∶mL)的料液比加入乙醇，加热冷凝回流2h，进行第二次脱脂时料液比为1∶8(g∶mL)，回流2h。将脱脂后的药渣晾晒，挥发掉残留的乙醇，按1∶10(g∶mL)的料液比向炮天雄药渣中加蒸馏水，提取3次，2h/次，温度为90℃，提取结束后抽滤，合并3次的水提液。对提取液进行减压浓缩，加入4倍量的乙醇，边加边搅拌，于4℃下静置24h后抽滤，弃去上清液，收集沉淀，得到粗多糖。

2、炮天雄均一多糖的纯化：

称取炮天雄粗多糖用蒸馏水溶解，经DEAE FAST FLOW离子层析柱分离，洗脱条件：流速为2.5ml/min，依次以水、0.05mol/L的氯化钠、0.1mol/L的氯化钠、0.2mol/L的氯化钠、0.3mol/L的氯化钠以及0.1mol/L的氢氧化钠进行洗脱；利用全自动收集器分梯度收集，每个溶液梯度洗脱3倍柱体积，收集30管，每管5ml，采用硫酸-苯酚法进行隔管跟踪检测；将收集到的炮天雄多糖溶液浓缩至一定体积后，用3500Da分子量的透析带进行透析，透析带须进行预处理；装透析带的烧杯每天换水5次，透析一周后，将透析带内多糖液，离心，并将其进行冷冻干燥，得到初步纯化的炮天雄苓多糖，然后再用蒸馏水充分溶解，采用SuperdexG-200凝胶柱再分离，以蒸馏水按照流速0.2ml/min进行洗脱，利用全自动收集器收集，每管5ml，苯酚一硫酸法检测后，收集洗脱曲线中的主峰部分；收集到的溶液浓缩后用截留分子量为3500Da的透析袋透析2d来脱盐，收集袋内溶液进行浓缩，之后冷冻干燥，得到炮天雄均一多糖。

3、炮天雄均多糖的纯度鉴定：

高效液相色谱条件：Agilent 1200高效液相色谐仪，色谱柱为G-5000PWXL 和TSKG-3000PWXL串联，流动相为0.02mol/L KH₂PO₄溶液，流速为0.6ml/min，流动相为0.2mol/L的NaNO₃溶液，流速为0.6ml/min，柱温35℃，检测器为 Waters2414示差折光检测器。将步骤3获得的炮天雄多糖用适量水溶解，进样为20μl，结果色谱图中呈单一对称峰，说明该组分为均一多糖。

4、炮天雄均一多糖分子量的确定：

取1mg分子量为50K、80K、150K、270K、410K和670K Da的普鲁兰多糖分别溶于1mL水中，色谱条件同上，用Agilent 1200高效液相色谱仪分析，记录保留时间，以分子的对数(logM)为纵坐标，保留时间(t)为横坐标，得标准曲线y＝8.33-0.240X，将炮天雄均一多糖出峰时间代入曲线方程，得炮天雄均一多糖的分子量为1.41×10⁵Da。

二、炮天雄均一多糖的结构表征

1、多糖组分分析：

先进行酸水解，然后乙酰化进行衍生，再进行气相GC分析。酸水解的方法是：称取10mg炮天雄均一多糖样品，分别置于安培瓶中，加入浓度为2mol/L 的4ml三氟乙酸，氮气吹跑瓶内空气，用酒精喷灯封管。110℃水解6小时后，旋蒸干样品，加入2ml的甲醇溶解，蒸干，反复3次，尽量去除样品中的三氟乙酸。加入1ml的甲醇将样品转移至血清瓶内，氮气吹干，然后按照上述方法衍生化后，进行GC分析，其结果根据单糖标准品的保留时间进行分析，并通过出峰的面积比计算出单糖摩尔百分比。结果显示，同单糖标准品的GC图谱中的保留时间对照，结果表明炮天雄均一多糖由鼠李糖、甘露糖、岩藻糖和葡萄糖组成，根据内标法计算出四种单糖的摩尔比是5.61∶1.00∶3.09∶39.41。

甲基化研究方法：称取土茯苓多糖SGRP1样品20mg(样品保持充分的干燥)置于带塞试管中，用6ml的二甲基亚砜DMSO试剂，并用氮气封口，进行加热，磁力搅拌混匀，加入氢氧化钠(6ml的DMSO含有240mg的氢氧化钠) 形成氢氧化钠悬浊液，过夜。隔日向试管中加入3.6ml的碘甲烷CH₃I，搅拌8min，用氮气吹走CH₃I，再次甲基化，如此重复3次后，加入6ml的蒸馏水中止反应。流水和去离子水各透析24h后，用氯仿CHCl3萃取3次后，用无水亚硫酸钠干燥24h，然后氮气吹干，溶液剩下约1ml。采用三氟乙酸水解的方法对其进行水解，再加入70mg的硼氢化钠NaBH4搅拌24h，再加强酸性阳离子交换树脂搅拌混匀10min，抽滤，收集滤液加甲醇，氮气吹干，乙酰化方式进行衍生化，再进行GC-MS分析。

2、炮天雄均一多糖IR分析：

样品采用KBr压片法进行1R扫描，从IR图中可以看出，炮天雄均一多糖呈现典型的多糖吸收特征，其中3392.1cm^-1为O-H键的伸缩振动峰，2929.3cm ^-1为CH₂中C-H的伸缩振动峰；1630.71cm^-1为CO₂或共生水引起的伸缩振动峰， 1134.25cm^-1为C-H键的变角振动峰，1244.54cm^-1是伯醇β-OH引起的伸缩振动峰；1079.9and 1020.1^-1处的吸收峰说明炮天雄均均一多糖中含吡喃环，而在 910.40cm^-1处出现的吸收峰又说明炮天雄均多糖中存在呋喃的结构：574.6cm^-1为吡喃环的对称伸缩振动动峰。

3、炮天雄均一多糖甲基化分析：

甲基化反应：分别取10mg干燥的炮天雄均一多糖和炮天雄均一多糖糖酸还原产物加入到25mL的圆底烧瓶中，加2mL无水DMSO溶液超声30min溶解，加30mg干燥的NaOH粉末超声反应3h，冰浴下沿壁级慢滴加1ml CH₃I，避光超声反应2h，加3ml水结束反应，按1∶1加CHCI₃萃取，收集有机相，重复3 次，干燥后重复甲基化至IR扫描图谱中没有羟基峰。整个反应过均在20℃，N₂保护下进行。后续反应：向甲基化后的样品中加4mL 2mol/L的TFA，于110℃下水解5h，水解后4mL甲醇旋干除去多余的TFA，重复3次，再加0.5ml.水溶解；取0.2ml.水解液，加30mg NaBH₄室温下反应3h，反应过程中间歇振摇，结束后滴加25％冰乙酸酸至无气泡产生，加2mL甲醇旋干，重复3次；向还原产物中加1.5ml乙酸，于100℃下反应1h后，加2mL甲苯旋干，重复3次以除去多余的乙酸酐；向乙酰化产物中各加2mL氯仿和水，振荡，静置，收集下层有机相，用1mL水洗涤3次，再加少量无水硫酸钠除水，待GC-MS分析。

GC-MS色谱条件：Agilent6890-5973N型型气相色谱-质谱联用仪，色谱柱： HP-5MS毛细管柱(30m×250pm×0.25umD)；载气：He；加热器温度：250℃：程程序升温：初始温度140℃/min升至200℃，保持5min，再以8℃/min升至240℃：分流比：50∶1；进样量：5μl。

炮天雄均一多糖甲基化的结果表明，炮天雄均一多糖糖链的糖残基共有8 种连接方式，而炮天雄均一多糖糖醛酸还原产物的糖残基共有9种连接方式，说明多出的端基Galp是GalA的存在方式，1，3，4-linked Galp的比例明显增大，说明GalA的存在方式还包括1，3，4-linked Galap；炮天雄均一多糖甲基化反应后的非还原末端残基(端基GalAp、端基Glap、端基Araf和Rhap)与分枝糖残基 (1，3，4-linked Galp)的摩尔比为5.2∶5.4，表明其甲基化完全。因此，在炮天雄均一多糖中，Rha以1→和1→4连接，Ara以1→和1→5连接，Galp主要以1→连接，Galp以1→4、1→3，4和1→6连接，而GalAp主要是以1→和1→3，4连接的。

表1炮天雄均一多糖甲基化分析数据

4、炮天雄均一多糖NMR分析：

取30mg干燥的炮天雄均一多糖，溶于0.5ml D₂O中，进行NMR分析。从谱图可以看出，炮天雄均一多糖氢谱的信号分布范围窄，主要集中在δ3.0-6.0ppm (5.97，5.70，5.32，5.15，5.14，4.89，4.70，4.57，4.56，4.55，3.90，3.88， 3.87，3.79，3.77，3.75，3.73，3.70，3.62，3.58，3.56，3.52和3.27ppm)范围内。而其C谱信号范围为δ 60-100ppm(99.76，99.64，98.69，95.91，95.77， 92.09，76.78，76.22，75.94，75.76，74.57，74.13，74.03，73.34，72.88，72.71， 71.74，71.54，71.19，70.33，69.60，69.33，67.78，60.75和60.44ppm)。在C谱图中，出现了糖醛酸的碳信号6170.7，说明炮天雄均一多糖中含有糖醛酸，是种酸性糖，与组分分析和IR的结果相同。炮天雄均一多糖中各个糖残基的异头碳领化学位移归属见表2。

表2炮天雄均一多碳氢化学位移归属

5、炮天雄均一多糖的抗氧化活性实验：

5-1、清除DPPH自由基活性测定：

参照Golluecke等的方法测定，取2ml不同质量浓度的样品溶液(12.5，25， 50，100μg·ml^-1)，加入2ml DPPH溶液(100μg·ml^-1)，充分混匀后，避光反应30min。于517nm处测定反应体系的吸光度值(Am)。同时设定溶剂空白组(An，DPPH溶液用等体积甲醇代替)和样品空白组(Ao，样品溶液用等体积甲醇代替)。VC作为阳性对照组。实验平行操作3次，根据下列公式计算提取液对DPPH的清除率。

表3炮天雄均一多糖清除DPPH自由基活性

与维生素C组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

5-2、清除ABTS⁺活性测定：

参照Roberta Re等的方法测定，取0.4ml不同质量浓度的样品溶液(12.5， 25，50，100μg·ml^-1)，加入ABTS⁺溶液4ml，反应6min，于734nm处测定其吸光度Ai。同时设定溶剂空白组(Aj，ABTS⁺溶液用等体积甲醇代替)，样品空白组(Ah，样品溶液用等体积甲醇代替)和阳性对照组。实验平行操作3 次，根据下列公式计算提取液对ABTS⁺的清除率：

表4炮天雄均一多糖清除ABST⁺活性

与维生素C组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

5-3、还原力测定：

参照Mazor D等的方法测定，取0.8ml不同质量浓度的样品溶液(12.5，25， 50，100μg·ml^-1)，加入2ml磷酸盐缓冲液(PH＝6.6)和2ml 1％铁氢化钾，50 ℃水浴20min，加2ml10％三氯乙酸，3000rpm，离心10min，取2ml上清加 2ml去离子水，0.4ml 0.1％三氯化铁，反应5min，于700nm处测吸光度值，以VC为阳性对照，实验平行操作3次，测得的吸光度值越大表示还原能力越强。

结果：炮天雄均一多糖清除DPPH自由基和ABTS⁺的IC₅₀值分别为 6.15±0.83μg·mL^-1和28.05±4.08μg·mL^-1，还原力EC50值为为72.07±19.04μg·mL^-1，和阳性药维生素C相当，这说明炮天雄均一多糖具有较强的抗氧化活性。

表5炮天雄均一多糖还原力测定

与维生素C组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

6、炮天雄均一多糖的神经保护活性实验：

采用干燥的炮天雄均一多糖，将SH-SY5Y细胞分为6组，每组6份，1组为空白对照组，2组为低氧模型组，具体方法培养条件为DMEM培养基(葡萄糖2.78mmol/L)，2％O₂条件下培养24h，3、4、5组分别为低氧模型+炮天雄均一多糖处理组，炮天雄均一多糖的浓度分别为低剂量、中剂量和高剂量，实验重复6次。空白对照组不加药，3个给药组培养皿加入炮天雄均一多糖作用 24h。采用MTT实验检测细胞的增殖能力，JC-1法测定细胞膜线粒体膜电位，Real time PCR检测Bcl-2、Bax mRNA表达。结果：炮天雄均一多糖可以显著提高低氧环境下SH-SY5Y细胞的存活率(P＜0.01)，逆转线粒体跨膜电位的下降，并显著降低细胞中BaxmRNA表达(P＜0.01)。其神经保护的机制可能与线粒体保护，减少细胞凋亡相关。

表6炮天雄均一多糖对LPS诱导SH-SY5Y细胞存活率的影响

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与低氧模型组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

表7炮天雄均一多糖对低氧作用下SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与低氧模型组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

表8炮天雄均一多糖对低氧作用下SH-SY5Y细胞Bc1-2、Bax mRNA表达的影响

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与低氧模型组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

三、炮天雄均一多糖片剂的制备

取实施例4中获得的炮天雄均一多糖2g、羟丙甲纤维素4g、羧甲淀粉钠10g，微晶纤维素10g、乳糖115g、药用淀粉50g、硬脂酸铁1g，将主药与辅料充分混匀后投入速搅拌机中，喷雾加水适量，整粒，水分控制在3～4％，然后月压片，制成1000片，包薄膜衣。每片含主药成分0.2mg。该片剂为抗氧化产品或者神经保护产品。

四、炮天雄均一多糖又一片剂的制备

取实施例4中获得的炮天雄均一多糖3g、羧甲淀粉钠15g、微晶纤维素15g、药用淀50g、硬脂酸镁2g，将主药与辅料充分混匀后投入高速搅拌机中，喷雾加水适量，整粒，水控制在3～4％，然后压片，制成1000片。每片含主药成分 0.3mg。该片剂为抗化产品或者神经保护产品。

五、炮天雄均一多糖胶囊剂的制备

取实施例4中获得的炮天雄均一多糖2g、微晶纤维素25g、药用淀粉70g，将药用淀先干燥，过120目筛，再与炮天雄均一多糖、微晶纤维素混合，过两次120日筛，填入硬胶囊制成1000粒本发明胶囊。每粒硬胶囊含主药成分0.2mg，该胶囊为抗氧化产品或者神经保护产品。

以上所述的，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。