一种可完全降解的gsh/ros双敏感聚合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种可完全降解的gsh/ros双敏感聚合物及其制备方法和应用 (Completely degradable GSH/ROS double-sensitive polymer and preparation method and application thereof ) 是由 康洋 吴钧 李丹丹 张铷和 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种可完全降解的GSH/ROS双敏感聚合物及其制备方法和应用。本发明以天然含二硫键的胱氨酸酯和草酰氯为原料,成功合成了具有类草酸酯键和二硫键的新型载体材料聚合物Cys-0E；该聚合物材料能成功组装成高效负载各种亲疏水性药物的纳米靶向递送体系。通过纳米沉淀法构建的载药纳米粒具有显著的GSH/ROS双响应性,且其粒径小、载药量高、体内稳定性好、特异性靶向肿瘤；在肿瘤氧化还原环境作用下,实现载体的完全降解和包载药物的快速及大量释放,达到体内外对肿瘤高效抑制的结果。同时,本发明合成简单、应用便利、绿色环保,在生物医药领域前途无量。(The invention discloses a GSH/ROS double-sensitive polymer capable of being completely degraded, and a preparation method and application thereof. The invention successfully synthesizes a novel carrier material polymer Cys-0E with an oxalate-like ester bond and a disulfide bond by taking natural cystine ester containing a disulfide bond and oxalyl chloride as raw materials; the polymer material can be successfully assembled into a nano-targeting delivery system for efficiently loading various hydrophilic and hydrophobic drugs. The drug-loaded nanoparticles constructed by the nano precipitation method have obvious GSH/ROS dual responsiveness, small particle size, high drug loading capacity, good in-vivo stability and specific targeting on tumors; under the action of tumor redox environment, the carrier is completely degraded, and the entrapped drug is quickly and massively released, so that the effect of efficiently inhibiting tumors in vivo and in vitro is achieved. Meanwhile, the invention has the advantages of simple synthesis, convenient application, environmental protection and no way in the field of biological medicine.)
技术领域
本发明属于功能高分子材料和生物医药技术领域。更具体地，涉及一种可完全降解的GSH/ROS双敏感聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
癌症又称恶性肿瘤，是一种严重危害人类生命健康的疾病。鉴于癌症的高发病率和死亡率，人们越来越重视它。目前，癌症的常用治疗方法主要有手术、放疗、化疗和生物治疗，这几种方法在临床上通常联合使用进行肿瘤治疗。据统计，进行手术和放疗的癌症患者占1/3，化疗占2/3。因此，化疗作为外科或放疗的辅助治疗手段，在联合治疗中发挥着重要作用。然而，化疗的全身给药方式和常用抗癌药物的疏水性极大地限制了化疗的临床应用，往往会导致诸多问题，如对肿瘤细胞缺乏选择性、毒性和副作用高、生物利用度低、耐药等，因此，为了克服传统化疗的诸多不足，抗癌药物的新给药方式亟待研究。
随着纳米技术的出现和进步，已经开发出一批用于抗肿瘤药物递送的平台(DDSS)，解决了抗肿瘤药物在临床应用中遇到的诸多阻碍。这些递药体系能在肿瘤部位尽可能多地聚集抗肿瘤药物，延长药物的血液循环时间，提高疗效，避免药物的毒副作用。经过一代又一代研究人员的努力，纳米载体已经从脂质体发展到智能纳米颗粒。近几年来，为了保证药物控释体系在循环过程中的稳定性和抗癌药物的靶向释放，通过引入与肿瘤治疗相关刺激响应基团，以实现治疗目标。这些独特的肿瘤环境和一些外源性刺激包括温度、氧化还原物质、光、酶等。
众所周知，肿瘤微环境具有异常的氧化还原水平，包括肿瘤组织中谷胱甘肽(GSH)或活性氧(ROS)表达水平高于正常组织。根据近几十年的研究，已经发现ROS在癌症中过度表达。具体来说，正常组织中的H2O2浓度一般为20nM，而肿瘤组织中由于H2O2的过量产生和积累，其浓度高达50～100μM。基于这一异常的活性氧水平，研究人员探索了许多活性氧响应药物纳米载体。此外，谷胱甘肽作为一种含硫醇的三肽，是细胞内主要的还原物质。据报道，其在癌细胞(10～40mM)中的浓度比正常血液环境(2～20μM)高1000倍以上，比正常细胞高4倍以上，这种巨大的浓度差异为细胞内药物的靶向释放提供了新思路。目前基于肿瘤特异的微环境已开发了众多氧化还原响应型药物递送平台，但仍然存在诸如载体材料不能完全降解为无害物质、单一的氧化还原敏感能力对复杂的肿瘤微环境不能实现快速响应等问题，需要进一步完善。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种胱氨酸酯通过酰胺反应形成的谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)双敏感的聚(二硫酰胺)聚合物(Cys-0E)的合成及应用。该材料合成简单，具有很好的生物安全性和完全的生物降解性；以Cys-0E为载体材料负载化疗药的纳米递药体系粒径小、载药量高、体内稳定性好、能特异性靶向肿瘤且肿瘤抑制效果显著。
本发明的第一个目的是提供一种可完全降解的GSH/ROS双敏感聚合物Cys-0E。
本发明的第二个目的是提供一种可完全降解的GSH/ROS双敏感聚二硫酰胺聚合物Cys-0E的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述聚合物Cys-0E或使用上述方法制得的聚合物Cys-0E在作为或制备药物输送载体方面的应用。
本发明的第四个目的是提供一种可完全降解的GSH/ROS双敏感型药物输送载体及其制备方法。
本发明的第五个目的是提供一种可完全降解的GSH/ROS双敏感的纳米递药体系。
本发明的第六个目的是提供一种可完全降解的GSH/ROS双敏感的纳米递药体系的制备方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种可完全降解的GSH/ROS双敏感聚二硫酰胺聚合物Cys-0E，所述聚合物Cys-0E的结构式如下式(I)所示：
其中，n＝5～1000。在该聚合度范围内的产物可组装形成稳定纳米粒。
该聚合物Cys-0E能够在水中组装形成纳米粒，成为稳定的胶体体系，并且实验表明，聚合物Cys-0E纳米粒没有明显的生物毒性，可完全降解，且具有GSH/ROS双响应性，具备操作简单、反应步骤少且产物无污染等优点，其制备方法简单、高效、经济。
本发明还涉及了一种可完全降解的GSH/ROS双敏感聚二硫酰胺聚合物Cys-0E的制备方法：将胱氨酸酯用有机溶剂溶解后，在惰性气体保护下于-20～100℃与草酰氯溶液反应0.5～48h，即可得到所述GSH/ROS双敏感聚合物Cys-0E。
本发明以天然含二硫键的胱氨酸酯和草酰氯为原料，成功合成了具有类草酸酯键和二硫键的新型载体材料聚合物Cys-0E；该聚合物材料能成功组装成高效负载各种亲疏水性抗癌药物的纳米靶向递送体系。通过纳米沉淀法构建的载药纳米粒，其粒径小、载药量高、体内稳定性好、特异性靶向肿瘤；在肿瘤氧化还原环境作用下，实现载体的完全降解和包载药物的快速及大量释放，达到体内外对肿瘤高效抑制的结果。同时，本发明合成简单、应用便利、绿色环保，在生物医药领域前景广阔。
在本发明较佳的实施例中，所述胱氨酸酯与草酰氯的摩尔比为1～10：1～10；优选为1：1～5；更优选为1：1.2。在此比例下，能保证所制备的产物在合适的分子质量范围。若胱氨酸酯含量过低，则会较难形成聚合物；若胱氨酸酯含量过高，则形成的聚合物不能组装为稳定纳米粒。
在本发明较佳的实施例中，反应温度为0～20℃，反应时间为4～6h。低于0℃条件下反应的时间过长，而时间延长聚合度并不会有明显变化，浪费能源，提高生产成本；反应时间过短则不能保证反应充分进行，聚合物成分减少，从而得到的产品响应性能会下降，且聚合物产率较低。当在0～20℃温度条件下反应的时间为4～6h时，则反应能够充分并且快捷的进行。
在本发明较佳的实施例中，所述胱氨酸酯为胱氨酸酯盐酸盐；溶解胱氨酸酯盐酸盐前，先对所述胱氨酸酯盐酸盐进行脱盐酸，萃取，干燥处理。
在本发明较佳的实施例中，所述胱氨酸酯盐酸盐选自L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐、L-胱氨酸乙酯二盐酸盐、L-胱氨酸卞酯二盐酸盐或L-胱氨酸双(叔丁酯)二盐酸盐中的一种或几种；优选为L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐作为合成原料，能提供稳定的二硫键来源，能与草酰氯合成产率较高、在水中组装能形成纳米粒成为稳定的胶体体系的聚合物Cys-0E，且来源广泛，成本低。
在本发明中，所述脱盐酸剂可选择性很多，可选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠或三乙胺等中的一种或几种。本发明其中一个实施例中优选为碳酸钠，其廉价易得，且脱盐酸条件较为温和，脱盐酸副产物污染小。
在本发明中，有机溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿或四氢呋喃中的一种或几种。本发明其中一个实施例中，有机溶剂优选为氯仿，可以达到较高的萃取产率，且得到所合成的聚合物后较为容易与聚合物分离，容易去除。
在本发明中，所述惰性气体为氮气或氩气等惰性气体。本发明其中一个实施例中，所述惰性气体优选为氮气，由于氮气是大气中含量最多的一种气体，因而提取方便，成本低，同时氮气不容易与反应原料胱氨酸酯和草酰氯及合成的聚合物Cys-0E发生反应，可以起到隔绝氧气保护反应原料和反应产物的目的。
本发明还涉及了上述聚合物Cys-0E在作为或制备药物输送载体方面的应用。
上述聚合物Cys-0E可通过纳米沉淀法或者单乳液/双乳液法，制备得到粒径均一、稳定的装载不同亲、疏水药物的纳米粒。
本发明中，聚合物Cys-0E可以单独作为药物载体，也可以向聚合物Cys-0E中加入药学上可接受的辅料来制备药物载体。比如二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇类稳定剂(DSPE-PEG)、聚乙烯醇(PVA)或磷脂分子等稳定剂，维生素C衍生物等进一步提供活性氧含量。
在本发明其中一个实施例中，一种可完全降解的GSH/ROS双敏感的纳米递药载体的制备方法，包括以下步骤：将上述聚合物Cys-0E溶于有机溶剂中，得到Cys-0E溶液；再在搅拌条件下，将Cys-0E溶液滴加至含有稳定剂的水溶液中，使其组装成纳米粒；或者，将上述聚合物Cys-0E与稳定剂均溶解于有机溶剂中，将得到的混合溶液滴加至水中组装成纳米粒，即可。
作为改进，在本发明其中一个实施例中，一种可完全降解的GSH/ROS双敏感的纳米递药载体的制备方法，包括以下步骤：将聚合物Cys-0E、稳定剂、维生素C衍生物溶解于有机溶剂中作为油相；在搅拌速度为800～1200rpm的状态下，取上述混合油相溶液按5～10μL/s的速度滴加到水相中，超滤，冻干即得GSH/ROS双敏感的纳米药物载体。
本发明还涉及了一种可完全降解的GSH/ROS双敏感的纳米递药体系，包括上述聚合物Cys-0E、以及所载药物。在其中一个实施例中，所负载药物包括疏水性药物或亲水性药物。本发明对所负载的药物种类没有特殊限定，可以为疏水性或亲水性的抗肿瘤药、抗炎症药物、心血管疾病类药物或免疫佐剂等。其中，所述抗肿瘤药包括但不限于化疗药、核酸类药物、蛋白多肽类药物等。所述抗炎症药物包括但不限于***等。所述心血管疾病类药物包括但不限于阿司匹林、双嘧达莫等。
本发明的递药载体\递药体系能够显著改善疏水药物的溶解性，极大的提高了疏水药物的可利用性，还可以大大提高纳米粒在血液中的循环时间，从而提高肿瘤部位的药物聚积，提高治疗效果。在本发明较佳的实施例中，所负载药物优选为抗肿瘤药物。其中，所述亲水性药物包括但不限于盐酸阿霉素、盐酸吉西他滨、盐酸伊立替康、氟尿嘧啶或香菇多糖等药物。所述疏水性药物包括但不限于多西紫杉醇(DTX)、紫杉醇(PTX)、甲氨蝶呤、喜树碱、阿霉素等药物。
在其中一个实施例中，所述纳米递药体系由所述聚合物Cys-0E、稳定剂、维生素C衍生物、以及所载药物制备而成，稳定剂与维生素C衍生物的加入可以进一步提高药物载体的稳定性及其应用效果。
在本发明较佳的实施例中，所述纳米递药体系由以下方法制备而成：将所述聚合物Cys-0E、稳定剂、维生素C衍生物、以及所载药物按比例共溶于油相溶剂，在搅拌状态下，将混合油相溶液分散到水相中，超滤，即得。所述纳米递药体系在人体肿瘤细胞内异常高的谷胱甘肽和活性氧的氧化还原作用下，二硫键和类草酸酯键会发生断裂，实现亲水性/疏水性抗癌药物的释放，使其具有氧化还原响应、控释缓释、毒副作用的特点。
在本发明较佳的实施例中，所述聚合物Cys-0E与所载药物的质量比为5：1～3；优选为5：2。如果聚合物Cys-0E的比例过大，则载药量较低，所成纳米粒粒子数较少；如果聚合物Cys-0E的比例过小，则包封率较小，造成药物的浪费，并且所得纳米粒不稳定，易沉淀。本发明将聚合物Cys-0E与所载药物的质量比控制在5：1～3能避免包封率较小，同时保证递药体系的稳定性和载药量，得到粒径均一、包封率和载药量适中，且稳定性好的产品。其中，当聚合物Cys-0E与所载药物的质量比为5：2时，所制备的纳米递药体系粒径小、载药量高达10％、体内稳定性好、能特异性靶向肿瘤(GSH及ROS响应性好)且肿瘤抑制效果显著。
在本发明较佳的实施例中，所述维生素C衍生物包括维生素C、抗坏血酸钠、抗坏血酸镁、抗坏血酸磷酸酯、抗坏血酸乙酸酯、抗坏血酸丙酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯或抗坏血酸二棕榈酸酯中的一种或多种。在本发明中，添加维生素C衍生物能够产生更多的活性氧，促进药物载体在细胞内尤其是肿瘤细胞内的瓦解，快速释放出大量药物，从而达到提高治疗效果的目的。
在本发明一些实施方案中，所述稳定剂选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇类稳定剂(DSPE-PEG)、聚乙烯醇(PVA)或磷脂分子中的一种或几种。本发明其中一个实施例中，所述稳定剂优选为DSPE-PEG2000，可以实现最优的纳米药物长循环效果，提高治疗指数。
在本发明较佳的实施例中，所述稳定剂与维生素C衍生物的质量比为1～5：1。在此比例下，能保证肿瘤细胞内足够量的过氧化氢产生，实现药物的有效释放。若维生素C衍生物含量过低，则会导致药物释放较为缓慢；若维生素C衍生物含量过高，则会影响纳米药物的载药量。
在本发明较佳的实施例中，油相溶液和水相的体积比为1：25～100；优选为1:100。在此比例下，能保证形成大量粒径较小且粒度均一的纳米粒子，提高比表面积，提高载药量和释药效果。若油相溶液含量过低，则会导致所成纳米粒较少；若油相溶液含量过高，则会形成粒径过大的纳米粒。
本发明中，上述油相溶剂为能与水互溶的有机试剂，优选为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环中的一种或多种。本发明其中一个实施例中，油相溶剂优选为二甲基亚砜，可以实现疏水性药物的大量溶解，有效提高载体的载药量。
在其中一个实施例中，将混合油相溶液通过滴加的方式分散到水相中，滴加速度为5～10μL/s。该速度下可以使油相液滴在水相中完全分散。
在其中一个实施例中，超滤速度为1000～4000rpm，优选为3000rpm。超滤速度过大容易使得纳米粒团聚，降低载药纳米粒的比表面积，影响载药纳米粒的作用效果；而超滤速度过小的话则不易去除有机溶剂，影响载药纳米粒的响应性。
本发明的纳米递药体系可快速崩解，同时所包载药物可迅速释放，在抑制相关肿瘤细胞增殖方面具有很好的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中的GSH/ROS双敏感聚合物Cys-0E具有很好的生物安全性和完全的生物降解性，且合成工艺简单。本发明通过优化改进的纳米沉淀法，所述双敏感聚合物在适量稳定剂的参与下，可以在水相中组装为粒度较小、且尺寸均一的纳米颗粒。
(2)本发明还将该双敏感聚合物开发为一种新型的智能纳米药物载体，该药物载体以疏水性抗癌药物为模型药物，通过纳米沉淀法构建了具有疏水性内核和亲水性外壳的纳米粒，所得的载药纳米粒粒径小、载药量高、体内稳定性好、能特异性响应肿瘤；通过肿瘤组织的高通透性和高保留性(EPR效应)，实现纳米粒在肿瘤的大量截留，从而具有被动靶向功能；利用肿瘤氧化还原微环境的作用，实现肿瘤组织内部载体的完全降解和包载药物的快速及大量释放(如附图1)，实现载药纳米粒在肿瘤细胞的特异性释放，达到体内外对肿瘤高效抑制的结果，在医药领域具有良好的应用前景和广阔的发展空间。
附图说明
图1是本发明的合成方案示意图；其中A)为氧化还原双敏感共聚物(Cys-0E)的合成方案；B)为该聚合物组装成负载DTX的纳米颗粒和纳米颗粒体内抑瘤作用的示意图。
图2是本发明合成的聚合物Cys-0E的核磁氢谱图。
图3是本发明合成的聚合物Cys-0E及原料L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐((H-Cys-OMe)2·2HCl)的红外光谱图。
图4是本发明负载多西紫杉醇(DTX)的[email protected]纳米颗粒的动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)测试数据图。
图5是本发明负载多西紫杉醇(DTX)的[email protected]纳米颗粒37℃时在不同浓度谷胱甘肽(GSH)和过氧化氢(H2O2)作用下的DTX释放结果图。
图6是本发明制备的[email protected]纳米颗粒、Cys-0E载体材料和游离的DTX以不同浓度作用于小鼠结肠癌细胞(CT-26cells)48h后的细胞毒性结果图。
图7是本发明制备的[email protected]纳米颗粒、Cys-0E载体材料和游离的DTX以不同浓度对荷瘤小鼠的抗肿瘤实验结果图(异种移植小鼠结肠癌)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1可完全降解的GSH/ROS双敏感聚二硫酰胺聚合物Cys-0E的合成
GSH/ROS双敏感聚合物Cys-0E的合成，包括以下步骤：
(1)L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐((L-Cys-OMe)2·2HCl)脱盐酸处理：将L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐(5g，14.66mmol)置入锥形瓶中，加入20mL饱和碳酸钠溶液溶解并在室温搅拌20min；反应结束后，用二氯甲烷萃取上述溶液并重复3次；将萃取液用一定量的无水硫酸钠干燥3h，最后旋转蒸发得到黄色油状脱盐酸产物，其产率为54.96％；
(2)Cys-0E的合成：将脱盐酸产物(5.33g，19.88mmol)置入100mL圆底烧瓶中并加入一定量的氯仿溶解，在氮气保护下和冰浴中缓慢滴入溶于氯仿的草酰氯(2mL，23.86mmol)溶液，控制胱氨酸酯脱盐酸产物与草酰氯的摩尔比为1：1.2；溶液滴加完毕，反应液在室温下搅拌4h；反应结束后将溶液旋蒸以去除氯仿；将所得产物重结晶3次，最终冷冻干燥得到白色粉末状的聚合物Cys-0E 3.13g(产率为58.66％)。
实施例2可完全降解的GSH/ROS双敏感聚二硫酰胺聚合物Cys-0E的合成
1、GSH/ROS双敏感聚合物Cys-0E的合成，包括以下步骤：
(1)L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐((L-Cys-OMe)2·2HCl)脱盐酸处理：将L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐(5g，14.66mmol)置入锥形瓶中，加入30mL饱和碳酸钠溶液溶解并在室温搅拌30min；反应结束后，用二氯甲烷萃取上述溶液并重复3次；将萃取液用一定量的无水硫酸钠干燥5h，最后旋转蒸发得到黄色油状脱盐酸产物，其产率为56.86％；
(2)Cys-0E的合成：将脱盐酸产物(5.33g，19.88mmol)置入100mL圆底烧瓶中并加入一定量的氯仿溶解，在氮气保护下和冰浴中缓慢滴入溶于氯仿的草酰氯溶液中，控制胱氨酸酯脱盐酸产物与草酰氯的摩尔比为1：10；溶液滴加完毕，反应液在室温下搅拌6h；反应结束后将溶液旋蒸以去除氯仿；将所得产物重结晶3次，最终冷冻干燥得到白色粉末状的聚合物Cys-0E(产率为57.84％)。
实施例3可完全降解的GSH/ROS双敏感聚二硫酰胺聚合物Cys-0E的合成
1、GSH/ROS双敏感聚合物Cys-0E的合成，包括以下步骤：
(1)L-胱氨酸乙酯二盐酸盐脱盐酸处理：将L-胱氨酸乙酯二盐酸盐(14.66mmol)置入锥形瓶中，加入30mL饱和碳酸氢钠溶液溶解并在室温搅拌30min；反应结束后，用二氯甲烷萃取上述溶液并重复3次；将萃取液用一定量的无水硫酸钠干燥4h，最后旋转蒸发得到黄色油状脱盐酸产物，其产率为53.69％；
(2)Cys-0E的合成：将脱盐酸产物(5.33g，19.88mmol)置入100mL圆底烧瓶中并加入一定量的二氯甲烷溶解，在氮气保护下和冰浴中缓慢滴入溶于二氯甲烷的草酰氯溶液中，控制胱氨酸酯脱盐酸产物与草酰氯的摩尔比为10：1；溶液滴加完毕，反应液在室温下搅拌8h；反应结束后将溶液旋蒸以去除二氯甲烷；将所得产物重结晶3次，最终冷冻干燥得到白色粉末状的聚合物Cys-0E(产率为57.63％)。
2、结果
将实施例1～3所制得的聚合物Cys-0E通过核磁氢谱进行确定其化学结构。如图2所示，9.22～9.34ppm处的信号对应有别于原料(L-Cys-OMe)2·2HCl的新生成的酰胺基团的质子吸收峰，4.58～4.77ppm代表次亚甲基上的质子吸收峰，3.66～3.69ppm代表甲基的质子吸收峰，2.83～3.24ppm代表亚甲基的质子吸收峰。以上分析结果表明Cys-0E被成功合成。
此外，利用傅立叶红外光谱分析方法进一步确认实施例1～3成功制备了聚合物Cys-0E的。结果如图3所示，实施例1～3新合成的聚合物Cys-0E出现了有别于原料(L-Cys-OMe)2·2HCl的特征峰，分别是新生成的酰胺基团中属于胺基的特征峰(3287cm-1)和属于羰基的特征峰(1664cm-1)。
实施例4氧化还原GSH/ROS双响应药物载体(即空白纳米粒(Cys-0E-NPs))的制备
通过以下纳米沉淀法制备药物载体Cys-0E-NPs，包括以下步骤：
(1)将5mg载体材料Cys-0E、5mg稳定剂二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)、1mg L-抗坏血酸棕榈酸酯(PA)溶解于1.1mL DMSO中作为油相；在搅拌速度为1000rpm的状态下，取100μL上述混合溶液按10μL/s的速度滴加到9mL去离子水中，加入1mL10×PBS得到稳定的空白纳米粒溶液；
(2)将上述纳米粒溶液，用Millipore超滤离心管(15mL/10000D)超滤浓缩并定容到1mL，得到空白纳米粒浓缩液，冻干即得氧化还原GSH/ROS双响应药物载体Cys-0E-NPs。
实施例5氧化还原GSH/ROS双响应负载DTX的载药纳米粒([email protected] NPs)的制备及表征
1、通过纳米沉淀法制备载药纳米粒[email protected] NPs，具体步骤如下：
(1)将5mg实施例1的聚合物Cys-0E、5mg稳定剂DSPE-PEG2000、1mg L-抗坏血酸棕榈酸酯(PA)和2mg多西紫杉醇(DTX)溶解于1.2mL DMSO中作为油相；在搅拌速度为3000rpm的状态下，取100μL上述混合溶液按10μL/s的速度滴加到9mL去离子水中，加入1mL 10×PBS，得到稳定的载药纳米粒溶液；
(2)将上述载药纳米粒溶液，用Millipore超滤离心管(15mL/10000D)超滤浓缩并定容到1mL，得到载药纳米粒浓缩液，冻干即得载药纳米粒[email protected] NPs。
2、所制备载药纳米粒[email protected] NPs的性能表征，测试结果如下：
本发明中载药纳米粒[email protected] NPs的性能表征包括，粒径和粒径分布由动态光散射粒度分析仪测量，DLS结果如图4中a图所示，得到了直径140nm且粒径分布均一的载药纳米粒；[email protected] NPs的表观形态采用透射电子显微镜来观察，图4中b图显示了载药纳米粒[email protected] NPs的TEM结果，可以观察到载药纳米粒[email protected] NPs呈球形且粒度与DLS结果相一致。
3、氧化还原双响应[email protected] NPs的氧化还原响应性评价
(1)方法
本发明中使用透析法来分析载药纳米粒中抗癌药的体外释放。将本发明中制备的载药纳米粒分别置于不同浓度谷胱甘肽(0、1μM、10μM、1mM、10mM)和不同浓度过氧化氢((0、1μM、10μM、1mM、10mM)的透析液中，并放置在摇床上于37℃孵育一段时间，并于预设时间点取样，HPLC检测对应透析液中载药纳米粒包载DTX的量以计算累积释放量。
(2)结果
图5中的a和b图即为上述实验结果，分析实验数据发现在低浓度GSH或H2O2水平下，载药纳米粒表现出良好的稳定性，随着GSH或H2O2浓度提高，载药纳米粒的释药速率和累积释放量都变化显著，证明该体系具有显著的氧化还原GSH/ROS双敏感性和优秀的缓释控释作用。
4、氧化还原双响应[email protected] NPs的体外细胞毒性实验
(1)方法
通过四唑盐(MTT)比色法在小鼠结肠癌(CT26)细胞上探究了本发明中制得的载体材料聚合物Cys-0E、和载药纳米粒[email protected] NPs的体外细胞毒性实验。
步骤如下：将悬浮于培养基的CT 26细胞以5000细胞/孔的密度接种于96孔板中，在二氧化碳培养箱中孵育12h使其贴。随后，用200μL含不同浓度Cys-0E、游离DTX和[email protected] NPs的新鲜培养基更换原培养基，每个浓度设置5个平行孔，继续共孵育48h。孵育结束后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，溶解在PBS中)，将细胞在37℃下再孵育4h。最后用200μL DMSO代替培养基以溶解蓝紫色结晶物。将96孔板振荡15min，并在490nm处用酶标仪测量各孔的吸光度值。
(2)结果
图6是各组制剂与CT26肿瘤细胞作用48h后的实验结果图。图6中显示载体材料聚合物Cys-0E对CT26肿瘤细胞无明显毒性作用，各浓度组细胞均达>90％的存活量，表明聚合物Cys-0E具有良好的生物安全性和生物相容性；同时，图6中游离DTX组和载药纳米粒[email protected] NPs组表现出浓度依赖的细胞毒性；且与游离DTX组相比，载药纳米粒[email protected]具有更强的肿瘤细胞抑制作用。
5、氧化还原双响应[email protected] NPs的体内抗肿瘤活性实验
(1)方法
使用异种移植瘤小鼠验证了本发明中载药纳米粒[email protected] NPs的体内抑瘤作用，具体为选用CT26细胞在雄性BALB/c小鼠的右下肢大腿部进行接种，每只小鼠接种105～106个细胞，待肿瘤体积达到50～100cm3时进行给药。荷瘤小鼠随机分配，每组5只，给药及分组方式如下：
①PBS，②载体材料Cys-0E(5mg/kg)，③游离DTX(5mg/kg)，④[email protected] NPs(5mg/kg)，⑤[email protected] NPs(10mg/kg)。
每隔1天给1次药，连续给药5次，每天观察小鼠状态，测量肿瘤体积，至肿瘤体积达到2500cm3时结束实验。
(2)结果
抑瘤实验中各组荷瘤小鼠的肿瘤体积变化如图7所示。载体材料聚合物Cys-0E未展现出任何抑瘤作用，而与对照组相比，各组DTX制剂组均表现出明显的肿瘤抑制作用，其中载药纳米粒[email protected] NPs的抑瘤效果最佳且随剂量加大而效果更显著。
实施例6氧化还原GSH/ROS双响应性载药纳米粒的制备
该制备方法其他条件与实施例5相同，不同之处在于：负载药物为盐酸阿霉素(亲水性药物)；稳定剂为磷脂分子、维生素C衍生物为抗坏血酸磷酸酯；聚合物Cys-0E与抗肿瘤药物的摩尔比为5：1。具体步骤如下：
(1)将5mg实施例1的聚合物Cys-0E、5mg稳定剂磷脂分子、1mg抗坏血酸磷酸酯和1mg盐酸阿霉素溶解于1.2mL DMSO中作为油相；在搅拌速度为4000rpm的状态下，取100μL上述混合溶液按10μL/s的速度滴加到9mL去离子水中，加入1mL 10×PBS，得到稳定的载药纳米粒溶液；
(2)将上述载药纳米粒溶液，用Millipore超滤离心管(15mL/10000D)超滤浓缩并定容到1mL，得到载药纳米粒浓缩液，冻干即得可负载亲水性药物的载药纳米粒。
实施例7氧化还原GSH/ROS双响应性载药纳米粒的制备
具体步骤如下：
(1)将5mg实施例1的聚合物Cys-0E、5mg稳定剂聚乙烯醇、1mg L-抗坏血酸棕榈酸酯和3mg喜树碱溶解于1.2mL N,N-二甲基甲酰胺中作为油相；在搅拌速度为1000rpm的状态下，取100μL上述混合溶液按5μL/s的速度滴加到2mL去离子水中，加入0.5mL 10×PBS，得到稳定的载药纳米粒溶液；
(2)将上述载药纳米粒溶液，用Millipore超滤离心管(15mL/10000D)超滤浓缩并定容到1mL，得到载药纳米粒浓缩液，冻干即得载药纳米粒。
实施例8氧化还原GSH/ROS双响应性载药纳米粒的其他制备方法
1、通过单乳液法制备载药纳米粒，用于负载疏水性药物，包括以下步骤：
(1)将聚合物Cys-0E和疏水性药物共同溶解于二氯甲烷中，按照一定的仪器参数在冰水混合物中进行乳化，形成油相；
(2)向上述油相中加入一定量的聚乙烯醇(PVA)水溶液(浓度为0.5％)，按照一定的仪器参数在冰水混合物中进行乳化；
(3)加入少量的异丙醇溶液，在室温下隔夜搅拌，以挥发二氯甲烷和固化纳米粒表面；
(4)加入去离子水，多次洗涤、离心、收集、冻干，即可得到稳定均一的氧化还原双响应性载药纳米粒。
2、通过双乳液法也可以制备氧化还原双响应性载药纳米粒，用于负载亲/疏水性药物，载亲/疏水性药物纳米粒的制备步骤一致；其中载疏水性药物纳米粒是将疏水性药物溶于油相中，而载亲水性药物纳米粒是将亲水性药物溶于水相中。载亲水性药物纳米粒的具体制备步骤如下：
(1)将聚合物Cys-0E溶解于二氯甲烷中，按照一定的仪器参数在冰水混合物中进行乳化，形成油相；
(2)将溶解有水溶性药物的水相加入到上述油相中，按照一定的仪器参数在冰水混合物中进行乳化，形成油包水型乳液
(3)向上述油相中加入一定量的聚乙烯醇(PVA)水溶液(浓度为0.5％)，按照一定的仪器参数在低温下进行乳化，形成水包油包水型乳液；
(4)加入少量的异丙醇溶液，在室温下隔夜搅拌，以挥发二氯甲烷和固化纳米粒表面；
(5)加入去离子水，多次洗涤、离心、收集、冻干，也可得到稳定均一的氧化还原双响应性的载药纳米粒。
本发明上述实施例中对所负载的药物种类没有特殊限定，可以为疏水性或亲水性的抗肿瘤药、抗炎症药物、心血管疾病类药物或免疫佐剂等药物。其中，所负载的抗肿瘤药可以是化疗药、核酸类药物、蛋白多肽类药物等药物。所负载的抗炎药物可以是***、罗非昔布、塞来昔布等甾体或非甾体抗炎药。所负载的心血管疾病类药物可以是阿司匹林、双嘧达莫等药物。所负载的亲水性抗肿瘤药物可以是盐酸阿霉素、盐酸吉西他滨、盐酸伊立替康、氟尿嘧啶或香菇多糖等。所负载的疏水性抗肿瘤药物可以是多西紫杉醇(DTX)、紫杉醇(PTX)、甲氨蝶呤、喜树碱、阿霉素等。
以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。