一种聚卟啉类化合物的制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种聚卟啉类化合物的制备方法及应用 (Preparation method and application of polyporphyrin compound ) 是由 郑楠 张芷伊 谢丹 宋汪泽 郑玉斌 于 2019-11-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于高分子材料、生物医药材料及光动力治疗技术领域,涉及一种聚卟啉类化合物的制备方法及应用。将四羧酸修饰的四苯基卟啉溶解于有机溶剂中,浓度为0.1M-1M；随后在反应体系中加入末端双氨基的缩硫酮共聚单体,最后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐以及4-二甲氨基吡啶。将反应体系升温至50℃-100℃,反应24h-72h。反应结束后,冷却到室温后沉降离心,粗产物用去离子透析,冻干,得到聚卟啉类化合物pPS。(The invention belongs to the technical field of high polymer materials, biomedical materials and photodynamic therapy, and relates to a preparation method and application of a polyporphyrin compound. Dissolving tetraphenylporphyrin modified by tetracarboxylic acid in an organic solvent, wherein the concentration of the tetraphenylporphyrin is 0.1-1M; then the thioketal comonomer with terminal diamino group is added into the reaction system, and finally 1-ethyl- (3-dimethylaminopropyl) carbonyldiimine hydrochloride and 4-dimethylaminopyridine are added. Heating the reaction system to 50-100 ℃ and reacting for 24-72 h. After the reaction is finished, cooling to room temperature, settling and centrifuging, and performing deionized dialysis and freeze-drying on the crude product to obtain the polyporphyrin compound pPS.)
技术领域
本发明属于高分子材料、生物医药材料及光动力治疗技术领域，涉及一种聚卟啉类化合物的制备方法及应用。
背景技术
光动力疗法(PDT)是当前一种革命性的治疗恶性肿瘤的高科技生物治疗方法，在过去的十几年中，PDT在癌症治疗领域备受关注(Adv.Drug Deliv.Rev.2008,60,1627-1637；Chem.Soc.Rev.2011,40,340-362；Chem.Soc.Rev.2016,45,6597-6626)。与传统的三大癌症治疗手段如手术、放疗和化疗相比，PDT良好的实现了对肿瘤细胞的靶向选择性和组织特异性，同时具有创伤轻微、毒副作用小、可重复光照治疗等优点，因此具有极大的优越性。
目前为止，已投入大量实验研究与临床应用的光敏剂大部分为卟啉类化合物。卟啉是一类由四个吡咯环的α-碳原子通过次甲基(＝CH-)桥联形成的大分子杂环化合物，具有大共轭体系的π电子结构。血卟啉衍生物(HPD)是第一个被批准上市的光敏剂，但是，由于其在红光区吸收弱，不能有效的穿透靶组织，因此只能局部消灭表层的原发和复发肿瘤。此外，HPD的组织选择性较差，为达到治疗效果需要较大剂量，毒副作用强，易产生皮肤光过敏，影响临床治疗效果(Biomaterials research 2018,22,25-25；Anticancer AgentsMed.Chem.2001,1,175-194)。第二代光敏剂在设计上克服了第一代光敏剂吸收波长短，组织穿透力差，单线态氧产率低等缺点，四苯基卟啉(TPP)是典型的第二代光敏剂，在光动力治疗中已被广泛应用。TPP的最大吸收波长为630nm，并能高效地产生单线态氧。但是，由于TPP作为一种强疏水性药物，具有平面、刚性的结构并存在较强的π-π相互作用，使其在生物体内极易形成团聚体，聚集的光敏剂容易发生自猝灭现象，导致了单线态氧产率下降，显著地削弱了光动力治疗的效果(Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,2558-2569；Chem.Rev.2015,115,1990-2042)。除此之外，在使用两亲性聚合物包载光敏剂制备纳米药物的时候，往往需要设计较长的疏水链段，用于增强与光敏剂之间的包载力，极大地降低了纳米药物的载药量。
基于上述背景，我们设计发明了一种新型聚光敏剂，通过柔性、响应肿瘤微环境的可降解弱键作为共聚单体，与四羧酸四苯基卟啉(TPP-4COOH)进行共聚合研究，制备高分子量的聚卟啉类光敏药物。共聚单体中可降解的柔性链，能够有效地将刚性平面的卟啉单体推开，使其在空间呈现扭曲的非平面结构，极大地破坏了其分子间的π-π相互作用，从而抑制了卟啉分子间的团聚效应，同时也抑制了团聚效应导致的包封率低，自淬灭等现象，由于聚合物表面存在的氨基与羧基，使得聚合物呈现两性离子的特征，通过调控共聚单体的比例，使得聚卟啉表面的电势可以在负电与正电间得以调控。由于聚卟啉具有两性离子的特征，其可在水中溶解成紫色液体，并且通过静电作用自组装成粒径在100-200nm的粒子，其单线态氧产率与单体相比提高约1.5倍。通过表面聚乙二醇(PEG)或者透明质酸(HA)的修饰，粒子在不同pH值的PBS的缓冲液中的稳定性得以显著提高。此项发明同时解决了疏水性卟啉类药物团聚诱导淬灭以及其纳米药物载药量低等诸多问题，为新型无载体光敏剂药物设计提供理论依据，也可为光动力***提供了新的思路。
发明内容
本发明主要解决了疏水性卟啉类药物的团聚导致自淬灭效应，同时克服了光敏剂纳米药物载药量低的问题。提供了一种新型的具有空间扭曲平面结构的聚卟啉类化合物的制备方法。
本发明的技术方案：
一种聚卟啉类化合物的制备方法，步骤如下：
将四羧酸修饰的四苯基卟啉溶解于有机溶剂中，浓度为0.1M-1M；随后在反应体系中加入末端双氨基的缩硫酮共聚单体，最后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐以及4-二甲氨基吡啶，其中，四羧酸修饰的四苯基卟啉、末端双氨基的缩硫酮共聚单体、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐以及4-二甲氨基吡啶四者的摩尔比为1：2.5～1.6：4.8～8：0.8～8，其中共聚单体中羧酸与氨基的比例为0.8-1.2；将反应体系升温至50℃-100℃，反应24h-72h；反应结束后，冷却到室温后用沉降剂进行沉降离心3-10次，粗产物在截留分子量为100-1000的透析袋中，用去离子透析3-5天，冻干，得到聚卟啉类化合物pPS，反应式如下：
四羧酸修饰的四苯基卟啉末端双氨基的缩硫酮共聚单体pPS
所述的聚卟啉类化合物pPS的特征如下：
数均分子量为7000～12000；
Zeta电位：7.2mV～-3.5mV；
分子量分布PDI:1.36-1.87。
所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃。
所述的沉降剂为***或正己烷。
所述的聚卟啉类化合物用于肿瘤光动力治疗。
本发明的有益效果：本发明中通过逐步聚合制备水溶性的聚卟啉，和单体卟啉相比，聚卟啉在水中可通过静电作用自组装成纳米粒。通过与聚乙二醇或透明质酸混合，可以制备具有稳定纳米结构的材料，该材料具有提高的单线态氧产率以及光毒性，可用于后续的光动力治疗恶性肿瘤。
附图说明
图1是聚合物(pPS)的核磁表征(d-DMSO)。
图2是聚合物(pPS)的光降解核磁表征(d-DMSO)。
图3是聚卟啉类光敏剂(PEG-pPS和HA-pPS)自组装后的扫描电镜图。其中，a为PEG-pPS材料，b为HA-pPS材料。
图4是聚卟啉类光敏剂(PEG-pPS和HA-pPS)自组装后的粒子稳定性表征。其中，a为粒子在不同pH下的粒径，b为粒子在不同稀释倍数下的粒径。
图5是材料在MCF-7细胞中的内吞水平。
图6是材料的毒性评价。其中，a为聚卟啉和单体卟啉的单线态氧产率，b为材料在MCF-7细胞及H22细胞中的光毒性评价。
具体实施方式
以下结合技术方案和附图，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1：聚卟啉类光敏剂(pPS)的合成
将四官能团修饰的四苯基卟啉溶解在四氢呋喃中(0.5M,1.0eq)，将原料2末端双官能团的含缩硫酮的共聚单体加入反应体系中(2.0eq)，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(4.8eq)以及4-二甲氨基吡啶(0.8eq),升温至50℃，反应24h,待反应瓶冷却到室温后用***进行沉降离心3次，粗产物在透析袋中(截留分子量500)用去离子透析，冻干，得到的聚合产物pPS，组1，2，3分别为羧酸/氨基的摩尔比为0.8，1，以及1.2，分子量及分布如表1所示，核磁表征如图1所示。
表1.聚卟啉(pPS)分子量及zeta电势
实施例2：聚卟啉类光敏剂(pPS)的光降解实验：
将聚合物pPS(20mg)溶于d-DMSO，使用650nm的激光(140mW/cm2)光照20分钟，通过核磁中在2.1ppm出现的丙酮峰判断出pPS已经发生光降解，如图2所示。
实施例3：聚卟啉类光敏剂纳米材料(PEG-pPS和HA-pPS)的制备：
将聚合物pPS溶于去离子水中(1mg/mL)，将PEG-COOH(1mg/mL)和HA(1mg/mL)以各种比例(10/1-1/5)分别加入到pPS的水溶液中。混合物在37℃下混合1小时，通过扫描电镜观测其粒径及形貌，如图3所示，两种粒子粒径均为100-200nm，形貌表现为球形。随后，通过动态光散射测量其在不同pH值的PBS缓冲液中(pH为5.8，6.8和8.0)的粒径变化，如图4a所示，粒子具有良好的稳定性，粒径变化较小。随后，将粒子稀释不同倍数(1-10倍)，测量其粒径变化，如图4b所示，结果显示粒子稳定性较好，稀释十倍下无明显粒径变化。
实施例4：聚卟啉类光敏剂(PEG-pPS和HA-pPS)的细胞内吞水平评价：
人乳腺癌MCF-7细胞以1×104细胞/板被种植在96孔板上。PEG-pPS和HA-pPS以光敏剂的浓度为20μM被加入到细胞中。4小时后，细胞用冷的PBS润洗3次，使用裂解液裂解细胞。如图5所示。结果显示，与pPS相比，PEG-pPS与HA-pPS均表现出增强的细胞内吞水平，这主要是由于其增强的稳定性决定的。与PEG-pPS相比，HA-pPS材料显示出增强细胞内吞作用。这主要是因为HA靶向CD44靶点，该靶点在MCF-7肿瘤细胞中均为过量表达。
实施例5：水溶性靶向聚卟啉类光敏剂(PEG-pPS和HA-pPS)的单线态氧产率及光毒性评价：
聚合物pPS的单线态氧产率通过使用1,3-二苯基苯并异呋喃(DPBF)进行评价。原理是DPBF能够含有活性双烯，能够与单线态氧发生环加成反应，是优异的单线态氧捕获剂。这种环加成产物不稳定，迅速分解，导致DPBF的紫外吸收下降。我们使用紫外-可见分光光度计来测量单线态氧产率。DPBF(2×10-5M)被加入到聚合物pPS中(光敏剂单体浓度为1×10-6M)。在不同的时间间隔照光，记录在412nm处的吸收情况，如图6a所示。结果显示，聚光敏剂(pPS)与单体相比在有更高的单线态氧产率。
MCF-7细胞或H22细胞以1×104细胞/板被种植在96孔板上。使用DMEM(含有10％FBS)培养细胞直到密度达到70％。然后加入光敏剂，光敏剂浓度为20μM，pPS：PEG(或HA)＝2:1(w/w)。细胞培养4小时后使用650nm的激光(140mW/cm2)光照5分钟，然后在37℃下继续培养20小时。使用MTT法判断细胞活性。正常培养的细胞作为阴性对照组。如图6b所示。结果显示，加入PEG或HA的材料，光毒性显著增强，且HA-pPS的光毒性高于PEG-pPs，这与细胞内吞实验结果相一致，证明该材料具有良好的光毒性，可用于后续的光动力治疗。