阅读说明：本技术 厚朴酚在制备抑制铁死亡药物中的应用 (Application of magnolol in preparation of medicine for inhibiting iron death ) 是由 谭克 樊玉梅 李丹雨 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开厚朴酚在制备抑制Erastin和RSL3诱导铁死亡信号通路表达的药物中的应用,深入研究了不同浓度的厚朴酚对Erastin和RSL3诱导的铁死亡的作用及分子机制,进一步挖掘厚朴酚的药理功能,拓宽了对厚朴酚的认识,并为铁死亡相关疾病的预防和治疗提供理论基础和新途径。(The invention discloses application of magnolol in preparation of a medicine for inhibiting Erastin and RSL 3-induced iron death signal pathway expression, deeply researches the action and molecular mechanism of magnolol with different concentrations on Erastin and RSL 3-induced iron death, further excavates the pharmacological functions of magnolol, widens the knowledge of magnolol, and provides a theoretical basis and a new way for prevention and treatment of iron death-related diseases.)

厚朴酚在制备抑制铁死亡药物中的应用

技术领域

本发明涉及化学医药技术领域，更具体地说是涉及厚朴酚在制备抑制Erastin和RSL3诱导铁死亡药物中的应用。

背景技术

铁死亡(ferroptosis)最初在2012年被定义为一种与细胞凋亡、坏死、自噬均不同的铁依赖性的细胞死亡方式。铁死亡过程中，细胞的自由铁池显著升高，线粒体缩小且线粒体嵴消失，同时其生化特征发生一系列变化，如细胞膜脂质过氧化物(lipidperoxidation)积累、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)耗竭等。大量研究表明，铁死亡与肿瘤、神经系统疾病、缺血再灌注损伤性及肾损伤等疾病密切相关。在神经退行性疾病的病理过程中，神经细胞损伤主要原因可能是细胞内铁的大量积累，同时与细胞内铁代谢、氨基酸代谢及脂质代谢有关。因此，深入研究铁死亡的分子机制和调节通路，探索抑制或加剧铁死亡的天然小分子化合物，可能为多种难治性疾病的临床治疗提供新思路和新靶标。

Erastin是铁死亡的典型诱导剂。Erastin主要抑制细胞内胱氨酸/谷氨酸反向转运体System Xc-(cystine/glutamate transporter)的功能，降低胞内Cys的摄取进而阻碍GSH的合成，而GSH含量减少会导致谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的酶活性低下，致使细胞内脂质过氧化反应加剧、脂质ROS增加，最终诱导细胞发生铁死亡。

小分子化合物RAS-selective lethal small molecule 3(RSL3)也可诱导细胞发生铁死亡，与Erastin不同，RLS3诱导的铁死亡似乎不需要通过线粒体VDAC2或VADC3和System Xc-的信号传导，早期的研究表明，RSL3可结合GPX4并抑制其酶活性，从而干扰其防止脂质过氧化的能力；然而，最近的研究表明，RSL3和Erastin均可以诱导GPX4蛋白降解从而导致ROS的积累，最终诱导细胞发生铁死亡。

厚朴酚(magnolol)是从我国传统中药厚朴Mangnolia officinalis中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗衰老等广泛的药理作用。厚朴酚(C₁₈H₁₈O₂)作用广泛，可以通过清除相关自由基、增强酶活性等方式起到抗氧化作用。厚朴酚不仅具有出色的抗真菌作用，对革兰氏阳性菌和耐酸菌也有明显的抗菌活性。另外，厚朴酚突出的抗肿瘤作用也越来越被关注与重视。厚朴酚在神经胶质瘤、膀胱癌、卵巢癌、***癌、甲状腺癌等多种恶性肿瘤细胞中，通过增加casepase-3、casepase-8和casepase-9的活性并下调抗凋亡蛋白Bcl-2，而展示出显著的促凋亡作用。在肺癌细胞中，厚朴酚还可阻断PI3K/PTEN/AKT信号通路，通过自噬诱导肿瘤细胞死亡。因此，厚朴酚抗肿瘤效应具有多靶点、多途径的特点。

但厚朴酚是否可以通过抑制铁死亡来达到治疗铁死亡相关疾病的作用机制尚不明确。

因此，如何对厚朴酚进行抑制铁死亡机制研究并将其应用于抑制铁死亡的药物中是本领域技术人员急需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种厚朴酚在制备抑制Erastin和RSL3诱导铁死亡信号通路表达的药物中的应用，并深入研究不同浓度的厚朴酚对Erastin和RSL3诱导的铁死亡的作用及分子机制，进一步挖掘厚朴酚的药理功能，拓宽了对厚朴酚的认识，并为铁死亡相关疾病的预防和治疗提供理论基础和新途径。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

厚朴酚在制备抑制Erastin诱导铁死亡信号通路表达的药物中的应用。

厚朴酚在制备抑制RSL3诱导铁死亡信号通路表达的药物中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种厚朴酚在制备抑制Erastin和RSL3诱导铁死亡信号通路表达的药物中的应用，发现，厚朴酚可以抑制Erastin和RSL3诱导的脂质过氧化物丙二醛MDA的生成和积累、可以抑制Erastin和RSL3诱导谷胱甘肽GSH耗竭的信号通路的表达，可以抑制Erastin和RSL3诱导GPX4信号通路的表达，从而抑制细胞内铁死亡，提高细胞的存活率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为加入不同浓度的厚朴酚对HEK293细胞活力影响的示意图；

图2附图为不同浓度的厚朴酚对Erastin诱导的铁死亡的抑制效果图；

图3附图为不同浓度的厚朴酚对RSL3诱导的铁死亡的抑制效果图；

图4附图为厚朴酚对Erastin诱导的MDA含量的影响图；

图5附图为厚朴酚对RSL3诱导的MDA含量的影响图；

图6附图为厚朴酚对Erastin诱导的GSH耗竭的影响图；

图7附图为厚朴酚对RSL3诱导的GSH耗竭的影响图；

图8附图为厚朴酚对Erastin诱导的HEK293细胞内ROS水平的分布影响示意图；

图9附图为厚朴酚对Erastin诱导的HEK293细胞内ROS水平的影响柱状示意图；

图10附图为厚朴酚对RSL3诱导的HEK293细胞内ROS水平的分布影响示意图；

图11附图为厚朴酚对RSL3诱导的HEK293细胞内ROS水平影响柱状示意图；

图12附图为厚朴酚对Erastin诱导的HEK293细胞内脂质ROS(lipidROS)水平的分布影响示意图；

图13附图为厚朴酚对Erastin诱导的HEK293细胞内脂质ROS水平(lipid ROS)影响柱状示意图；

图14附图为厚朴酚对RSL3诱导的HEK293细胞内脂质ROS(lipidROS)水平的分布影响示意图；

图15附图为厚朴酚对RSL3诱导的HEK293细胞内脂质ROS水平(lipid ROS)影响柱状示意图；

图16附图为附图为厚朴酚对Erastin诱导的HEK293细胞内LIP水平的分布影响示意图；

图17附图为厚朴酚对Erastin诱导的HEK293细胞内LIP水平影响柱状示意图；

图18附图为厚朴酚对Erastin诱导的铁死亡关键调节蛋白水平的影响图；

图19附图为厚朴酚对RSL3诱导的铁死亡关键调节蛋白水平的影响图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明用到的试验器材及材料：

胎牛血清(ExCell Bio)，DMEM培养基，CCK-8(MCE)，DMSO(Sigma)，细胞培养箱(Thermo Fisher)，ELX-800酶标仪(BioTek)，倒置显微镜(BIO-TEC)，厚朴酚(MCE)，RLS3(MCE)，Erastin(selleck)，96孔细胞培养板(JET)，人胚肾细胞(HEK293细胞，购自中科院上海细胞所)，MDA检测试剂盒(南京建成)，10cm细胞培养皿(JET)，GSH检测试剂盒(南京建成)，流式细胞仪FACS Calibur(BD)，基础电泳仪电源(Bio-rad)，电泳仪(JUNYI)，转印槽(Bio-rad)，PVDF膜(Roche Applied Science)，GPX4(ab125066，abcam)，ACSL4(K004812P，Solarbio)，GAPDH(WL01547，Wanleibio)，HRP*Goat Anit-Rabbit lgG(H+L)。

利用上述试验器材，进行下述试验，以验证厚朴酚抑制铁死亡的作用机制：

实施例1厚朴酚毒性试验

试验方法：

将HEK293细胞以约8000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板内，向其中加入含10％胎牛血清的100μl的DMEM高糖培养液，并在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养，当细胞密度达到70-80％时，加入梯度终浓度为0、1.25、2.5、5、10、20μM的厚朴酚，以经等量DMSO处理的细胞为阴性对照组，每种细胞设三个复孔。处理之后24小时，每孔加入含有10％CCK-8试剂的100μl的培养液，孵育1小时后用酶标仪测定450nm处的吸光度，计算细胞活性，结果如图1所示。

细胞存活率按下式计算：细胞存活率＝实验组OD值/空白对照组OD值×100％；数据统计以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验。

试验原理：CCK-8试剂中含有WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)是一种类似于MTT的化合物，它在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在条件下，可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物Formazan，生成的Formazan数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。用酶标仪在450nm波长处测定其吸光值，Formazan形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。

由图1可知，随着厚朴酚浓度的增加，HEK293细胞的生存率并无显著变化，表明在检测剂量范围内，厚朴酚对HEK293细胞无毒害作用

实施例2不同浓度的厚朴酚对Erastin诱导铁死亡的信号通路表达的抑制试验

将HEK293细胞以8000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板内，向其中加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，在37℃，5％CO₂，含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到70-80％时，设置三组：分别为试验组1～6、对照组1；

分组如下：

试验组1：5μM的Erastin；

试验组2：5μM的Erastin+2.5μM的的厚朴酚；

试验组3：5μM的Erastin+5μM的的厚朴酚；

试验组4：5μM的Erastin+10μM的的厚朴酚；

试验组5：5μM的Erastin+20μM的的厚朴酚；

试验组6：5μM的Erastin+40μM的的厚朴酚；

对照组1：经DMSO处理的HEK293细胞；

每组设三个复孔。处理之后24小时，每孔加入含有10％CCK-8试剂的培养液，孵育1小时后用酶标仪测定450nm处的吸光度，计算细胞活性。检测厚朴酚和Erastin同时处理对HEK293细胞活力的影响结果如图2所示。

细胞存活率按下式计算：细胞存活率＝实验组OD值/空白对照组OD值×100％；数据统计以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验。

由图2可知，5μM的Erastin分别与2.5-40μM的厚朴酚同时处理HEK293细胞时，细胞死亡率呈厚朴酚浓度依赖性升高，表明，厚朴酚可以抑制Erastin诱导的细胞内铁死亡时信号通路的表达，以此来提高细胞的存活率。

实施例3不同浓度的厚朴酚对RLS3诱导铁死亡的信号通路表达的抑制试验

将HEK293细胞以8000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板内，向其中加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，在37℃，5％CO₂，含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到70-80％时，设置三组：分别为试验组1～6、对照组1；

分组如下：

试验组1：0.1μM的RSL3；

试验组2：0.1μM的RSL3+2.5μM的的厚朴酚；

试验组3：0.1μM的RSL3+5μM的的厚朴酚；

试验组4：0.1μM的RSL3+10μM的的厚朴酚；

试验组5：0.1μM的RSL3+20μM的的厚朴酚；

试验组6：0.1μM的RSL3+40μM的的厚朴酚；

对照组1：经DMSO处理的HEK293细胞；

每组设三个复孔。处理之后24小时，每孔加入含有10％CCK-8试剂的培养液，孵育1小时后用酶标仪测定450nm处的吸光度，计算细胞活性。检测厚朴酚和RLS3同时处理对HEK293细胞活力的影响结果如图3所示。

细胞存活率按下式计算：细胞存活率＝实验组OD值/空白对照组OD值×100％；数据统计以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验。

由图3可知，0.1μM的RLS3分别与2.5-40μM的厚朴酚同时处理HEK293细胞时，细胞死亡率呈厚朴酚浓度依赖性升高，表明，厚朴酚可以抑制RLS3诱导细胞内铁死亡时信号通路的表达，以此来提高细胞的存活率。

实施例4厚朴酚抑制Erastin诱导的脂质过氧化物丙二醛MDA形成的信号通路表达的试验

试验方法

将HEK293细胞以约1.8×10⁶个/皿的密度接种于10cm细胞培养皿，向其中加入含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱。在接种后24小时，当细胞密度达到70％左右，加入5μM的Erastin单独处理，15μM的厚朴酚单独处理，5μM的Erastin与15μM的厚朴酚联合处理，以经DMSO处理的细胞为阴性对照。

加药24小时之后，收集HEK293细胞进行匀浆，向匀浆液中加入MDA试剂盒中的试剂，涡旋混匀，95℃沸水浴40min，取出后流水冷却，然后3500rpm，离心10min。取上清，532nm处，1cm光径，测各管吸光度值，并按照下列公式进行计算，结果如图4。

组织/细胞中MDA含量(nmol/mgprot)＝(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(10nmol/ml)÷待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)

由图4可知，厚朴酚与Erastin联合处理之后，MDA百分比为100左右，而Erastin单独处理时，MDA百分比在300-400左右，可知，加入厚朴酚后，MDA含量显著降低；即，厚朴酚能够抑制Erastin诱导脂质过氧化物丙二醛MDA形成的信号通路的表达。

试验原理：

生物体组织和细胞内，自由基与脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛(MDA)。MDA导致蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，具有较大的细胞毒性。生物体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化酸。脂质氧化终产物MDA不仅影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶得活性，它的产生还可加剧细胞膜的损伤，因而测试丙二醛的量可反映机体脂质过氧化的程度，间接地反应出细胞损伤的程度。丙二醛是在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮)，其最大吸收波长在532nm。

实施例5厚朴酚抑制RSL3诱导的脂质过氧化物丙二醛MDA形成的信号通路表达的试验

试验方法

将HEK293细胞以约1.8×10⁶个/皿的密度接种于10cm细胞培养皿，向其中加入含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱。在接种后24小时，当细胞密度达到70％左右，加入0.1μM的RSL3单独处理，15μM的厚朴酚单独处理，0.1μM的RSL3与15μM的厚朴酚联合处理，以经DMSO处理的细胞为阴性对照。

加药24小时之后，收集HEK293细胞进行匀浆，向匀浆液中加入MDA试剂盒中的试剂，涡旋混匀，95℃沸水浴40min，取出后流水冷却，然后3500rpm，离心10min。取上清，532nm处，1cm光径，测各管吸光度值，并按照下列公式进行计算，结果如图4。

组织/细胞中MDA含量(nmol/mgprot)＝(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(10nmol/ml)÷待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)

由图5可知，厚朴酚与RSL3联合处理之后，MDA百分比为100左右，而RSL3单独处理时，MDA百分比在150-200左右，可知，加入厚朴酚后，MDA含量显著降低；即，厚朴酚能够抑制RSL3诱导脂质过氧化物丙二醛MDA形成的信号通路的表达。

试验原理：

生物体组织和细胞内，自由基与脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛(MDA)。MDA导致蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，具有较大的细胞毒性。生物体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化酸。脂质氧化终产物MDA不仅影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶得活性，它的产生还可加剧细胞膜的损伤，因而测试丙二醛的量可反映机体脂质过氧化的程度，间接地反应出细胞损伤的程度。丙二醛是在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮)，其最大吸收波长在532nm。

实施例6厚朴酚抑制Erastin诱导GSH耗竭的信号通路表达的试验

试验步骤

将HEK293细胞以约1.8×10⁶个/培养皿的密度接种于10cm细胞培养皿，向其中加入含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱。在接种后24小时，当细胞密度达到70％左右，加入5μM的Erastin单独处理，15μM的厚朴酚单独处理，5μM的Erastin与15μM的厚朴酚联合处理，以经DMSO处理的细胞为阴性对照。

加药24小时之后，收集HEK293细胞进行匀浆，将匀浆液与GSH试剂盒中的试剂一，混匀，3500rpm，离心10min，取上清，加入试剂二、试剂三，静置4min，405nm处测定吸光度值，并按照下列公式进行计算，结果如图5。

细胞及组织GSH含量(μmol/gprot)＝(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准管浓度(20μmol/L)×样本前处理稀释倍数(2倍)÷待测匀浆蛋白浓度(gprot/L)

由图6可知，以Erastin处理后，GSH百分比由正常的100至75左右，而厚朴酚与Erastin联合处理之后，GSH含量依然保持在正常水平，因此，可知，厚朴酚能够抑制Erastin诱导GSH耗竭的信号通路的表达。

试验原理：

还原型谷胱甘肽(GSH)是一种低分子自由基清除剂，它可清除O₂ ^-、H₂O₂、LOOH；还原型谷胱甘肽是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种小分子肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，并且是GPX和GST两种酶类的底物，为这二种酶分解氢过氧化物所必需，并且能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤。

二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物反应时能产生一种黄色化合物,可进行测定。

实施例7厚朴酚抑制RSL3诱导GSH耗竭的信号通路表达的试验

试验步骤

将HEK293细胞以约1.8×10⁶个/培养皿的密度接种于10cm细胞培养皿，向其中加入含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱。在接种后24小时，当细胞密度达到70％左右，加入0.1μM的RSL3单独处理，15μM的厚朴酚单独处理，0.1μM的RSL3与15μM的厚朴酚联合处理，以经DMSO处理的细胞为阴性对照。

加药24小时之后，收集HEK293细胞进行匀浆，将匀浆液与GSH试剂盒中的试剂一，混匀，3500rpm，离心10min，取上清，加入试剂二、试剂三，静置4min，405nm处测定吸光度值，并按照下列公式进行计算，结果如图7。

细胞及组织GSH含量(μmol/gprot)＝(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准管浓度(20μmol/L)×样本前处理稀释倍数(2倍)÷待测匀浆蛋白浓度(gprot/L)

由图7可知，以RSL3处理后，GSH百分比由正常的100降至25左右，而厚朴酚与RSL3联合处理之后，GSH含量显著恢复，因此，可知，厚朴酚能够抑制RSL3诱导GSH耗竭的信号通路的表达。

试验原理：

还原型谷胱甘肽(GSH)是一种低分子自由基清除剂，它可清除O₂ ^-、H₂O₂、LOOH；还原型谷胱甘肽是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种小分子肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，并且是GPX和GST两种酶类的底物，为这二种酶分解氢过氧化物所必需，并且能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤。

二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物反应时能产生一种黄色化合物,可进行测定。

实施例8厚朴酚抑制Erastin诱导ROS水平积累信号通路表达的试验

试验步骤

将HEK293细胞以约1.8×10⁶个/板的密度接种于10cm细胞培养皿，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。在接种后24小时，当细胞密度达到70％左右，加入5μM的Erastin单独处理，5μM的Erastin与15μM的厚朴酚联合处理，以经DMSO处理的细胞为阴性对照。处理24小时后，用胰酶消化细胞，4℃800rpm离心3min，之后用1×PBS轻柔洗涤2次。弃去PBS，加入适量的终浓度为10μM的ROS探针稀释液。将细胞放回37℃，5％CO₂培养箱避光孵育30min。然后用1×PBS轻柔洗涤1次，洗去多余的探针。然后每个离心管加入500ul的1×PBS，用移液器重悬细胞后转移到BD Calibur流式上样管后，用流式细胞仪FL1通道检测DCFH-DA染色阳性细胞。每例样本至少要检测10000个细胞，获得数据后结合流式细胞仪分析软件FlowJo计算分析细胞内ROS水平变化，并绘制ROS分布图，结果如图8和图9所示。

由图8和图9可知，厚朴酚与Erastin联合处理之后能够抑制Erastin诱导细胞内ROS形成的信号通路表达。

试验原理：活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit，也称ROSAssay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

实施例9厚朴酚抑制RSL3诱导ROS水平积累信号通路表达的试验

试验步骤

将HEK293细胞以约1.8×10⁶个/板的密度接种于10cm细胞培养皿，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。在接种后24小时，当细胞密度达到70％左右，加入0.1μM的RSL3单独处理，0.1μM的RSL3与15μM的厚朴酚联合处理，以经DMSO处理的细胞为阴性对照。处理24小时后，用胰酶消化细胞，4℃800rpm离心3min，之后用1×PBS轻柔洗涤2次。弃去PBS，加入适量的终浓度为10μM的ROS探针稀释液。将细胞放回37℃，5％CO₂培养箱避光孵育30min。然后用1×PBS轻柔洗涤1次，洗去多余的探针。然后每个离心管加入500ul的1×PBS，用移液器重悬细胞后转移到BDCalibur流式上样管后，用流式细胞仪FL1通道检测DCFH-DA染色阳性细胞。每例样本至少要检测10000个细胞，获得数据后结合流式细胞仪分析软件FlowJo计算分析细胞内ROS水平变化，并绘制ROS分布图，结果如图10和图11所示。

由图10和图11可知，厚朴酚与RSL3联合处理之后能够抑制RSL3诱导细胞内ROS形成的信号通路表达。

试验原理：活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit，也称ROSAssay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

实施例10厚朴酚抑制Erastin诱导脂质ROS(lipid ROS)积累的信号通路表达的试验

实验步骤

将HEK293细胞以约1.8×10⁶个/板的密度接种于10cm细胞培养皿，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液在37℃，5％CO2，的细胞培养箱中培养。在接种后24小时，当细胞密度达到70％左右，加入5μM的Erastin单独处理，5μM的Erastin与15μM的厚朴酚联合处理，以经DMSO处理的细胞为阴性对照。处理24小时，用胰酶消化细胞，4℃800rpm离心3min，之后用1×PBS轻柔洗涤2次。弃去PBS，加入适量的终浓度为10μM的脂质ROS探针稀释液。将细胞放回37℃，5％CO2培养箱避光孵育30min。然后用1×PBS轻柔洗涤1次，洗去多余的探针。然后每个离心管加入500μL的1×PBS，用移液器重悬细胞后转移到BD Calibur流式上样管后，用流式细胞仪FL1通道检测BODIPY 581/591 C11染色阳性细胞。每例样本至少要检测10,000个细胞，获得数据后结合流式细胞仪分析软件FlowJo计算分析细胞内脂质ROS水平变化，并绘制脂质ROS分布图，结果如图12和图13所示。

由图12和图13可知，厚朴酚与Erastin联合处理之后能够抑制Erastin诱导的细胞内脂质ROS形成的信号通路的表达。

试验原理：

脂质过氧化通常是指活性氧物质对细胞脂质的氧化降解。不饱和脂质的过氧化作用影响细胞膜特性，信号转导途径，细胞凋亡以及食物和其他生物化合物的恶化。脂质过氧化可能在衰老以及药物诱导的光毒性和动脉粥样硬化等病理过程中发挥作用，并且它通常是细胞中自由基介导的损伤的原因。

581/591 C11试剂可用于检测细胞和细胞膜中的活性氧(ROS)。在活细胞中氧化后，荧光团的苯基丁二烯片段的荧光从红色变为绿色，通过荧光显微镜以及流式细胞术检测脂质过氧化的水平。

实施例11厚朴酚抑制RSL3诱导脂质ROS(lipid ROS)积累的信号通路表达的试验

实验步骤

将HEK293细胞以约1.8×10⁶个/板的密度接种于10cm细胞培养皿，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液在37℃，5％CO2，的细胞培养箱中培养。在接种后24小时，当细胞密度达到70％左右，加入0.1μM的RSL3单独处理，0.1μM的RSL3与15μM的厚朴酚联合处理，以经DMSO处理的细胞为阴性对照。处理24小时，用胰酶消化细胞，4℃800rpm离心3min，之后用1×PBS轻柔洗涤2次。弃去PBS，加入适量的终浓度为10μM的脂质ROS探针稀释液。将细胞放回37℃，5％CO2培养箱避光孵育30min。然后用1×PBS轻柔洗涤1次，洗去多余的探针。然后每个离心管加入500μL的1×PBS，用移液器重悬细胞后转移到BD Calibur流式上样管后，用流式细胞仪FL1通道检测BODIPY 581/591 C11染色阳性细胞。每例样本至少要检测10,000个细胞，获得数据后结合流式细胞仪分析软件FlowJo计算分析细胞内脂质ROS水平变化，并绘制脂质ROS分布图，结果如图14和图15所示。

由图14和图15可知，厚朴酚与Erastin联合处理之后能够抑制Erastin诱导的细胞内脂质ROS形成的信号通路的表达。

试验原理：

脂质过氧化通常是指活性氧物质对细胞脂质的氧化降解。不饱和脂质的过氧化作用影响细胞膜特性，信号转导途径，细胞凋亡以及食物和其他生物化合物的恶化。脂质过氧化可能在衰老以及药物诱导的光毒性和动脉粥样硬化等病理过程中发挥作用，并且它通常是细胞中自由基介导的损伤的原因。

581/591 C11试剂可用于检测细胞和细胞膜中的活性氧(ROS)。在活细胞中氧化后，荧光团的苯基丁二烯片段的荧光从红色变为绿色，通过荧光显微镜以及流式细胞术检测脂质过氧化的水平。

实施例12厚朴酚抑制Erastin诱导LIP含量升高的信号通路表达的试验

试验步骤

将HEK293细胞以约1.8×10⁶个/板的密度接种于10cm细胞培养皿，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。在接种后24小时，当细胞密度达到70％左右，加入5μM的Erastin单独处理，5μM的Erastin与15μM的厚朴酚联合处理，以经DMSO处理的细胞为阴性对照。处理24小时，用胰酶消化细胞，4℃800rpm离心3min，之后用1×PBS轻柔洗涤2次。弃去PBS，加入适量的终浓度为10μM的LIP探针稀释液。将细胞放回37℃，5％CO₂培养箱避光孵育30min。然后用1×PBS轻柔洗涤1次，洗去多余的探针。然后每个离心管加入500ul的1×PBS，用移液器重悬细胞后转移到BD Calibur流式上样管后，用流式细胞仪FL1通道检测Calcein阴性细胞。每例样本至少要检测10,000个细胞，获得数据后结合流式细胞仪分析软件FlowJo计算分析细胞内LIP水平变化，并绘制LIP分布图，结果如图16和图17所示。

由图16和图17可知，厚朴酚与Erastin联合处理之后能够抑制Erastin诱导细胞内LIP的形成。

试验原理：

Calcein-AM能够穿过细胞膜，当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内，发出绿色荧光。细胞内的铁离子能与Calcein结合，使荧光淬灭。检测荧光就可测出细胞内LIP水平。

实施例12厚朴酚抑制Erastin诱导铁死亡蛋白含量降低的信号通路表达的试验

实验步骤

将HEK293细胞以约1.8×10⁶个/皿的密度接种于10cm细胞培养皿，在含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，置于37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱。在接种后24小时，当细胞密度达到70％左右，加入5μM的Erastin单独处理，15μM的厚朴酚单独处理，5μM的Erastin与15μM的厚朴酚联合处理，以经DMSO处理的细胞为阴性对照。

在加药处理24小时之后，收集HEK293细胞提取总蛋白，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳分离，然后转印蛋白至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5％脱脂奶粉封闭1h后，4℃孵育一抗过夜，检测铁死亡关键调节蛋白ACSL4、GPX4的变化情况，采用GAPDH作为内参，以TBST漂洗后加入二抗常温孵育1h后，再经TBST洗涤3次，最后使用化学发光剂ECL发光液显色，在化学发光成像系统中显影，结果如图18。

由图18可知，Erastin与厚朴酚联合处理之后可显著抑制Erastin单独处理诱导的GPX4、ACSL4表达量的降低。

试验原理：Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实施例13厚朴酚抑制RSL3诱导铁死亡蛋白含量降低的信号通路表达的试验

实验步骤

将HEK293细胞以约1.8×10⁶个/皿的密度接种于10cm细胞培养皿，在含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，置于37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱。在接种后24小时，当细胞密度达到70％左右，加入0.1μM的RSL3单独处理，15μM的厚朴酚单独处理，0.1μM的RSL3与15μM的厚朴酚联合处理，以经DMSO处理的细胞为阴性对照。

在加药处理24小时之后，收集HEK293细胞提取总蛋白，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳分离，然后转印蛋白至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5％脱脂奶粉封闭1h后，4℃孵育一抗过夜，检测铁死亡关键调节蛋白GPX4的变化情况，采用GAPDH作为内参，以TBST漂洗后加入二抗常温孵育1h后，再经TBST洗涤3次，最后使用化学发光剂ECL发光液显色，在化学发光成像系统中显影，结果如图19。

由图19可知，RSL3与厚朴酚联合处理之后可显著抑制RSL3单独处理诱导的GPX4表达量的降低。

试验原理：Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。