阅读说明：本技术 一种弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体及其应用 (Epitope polyclonal antibody of toxoplasma gondii Actin protein and application thereof ) 是由 余莉 朱进进 沈继龙 罗庆礼 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体及其应用,其中弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体,是以弓形虫Actin氨基酸序列中C端227-237为特异性较好的抗原决定簇肽段,获得弓形虫抗原决定簇多肽,进而制备的弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体。本发明设计的多肽抗原表位成分简单,引发的免疫反应针对性强,能特异性检测识别弓形虫Actin蛋白,主要在检测弓形虫蛋白的表达水平方面作为内参对照,能较为准确地确定目的蛋白的相对表达量；也可以通过免疫荧光对入侵细胞中的弓形虫进行定位,对其分子作用机制的进一步研究提供很大的帮助。(The invention discloses an epitope polyclonal antibody of toxoplasma gondii Actin protein and application thereof, wherein the epitope polyclonal antibody of the toxoplasma gondii Actin protein takes C end 227-237 in a toxoplasma gondii Actin amino acid sequence as an antigenic determinant peptide segment with better specificity to obtain toxoplasma gondii antigenic determinant polypeptide, and then the epitope polyclonal antibody of the toxoplasma gondii Actin protein is prepared. The polypeptide epitope designed by the invention has simple components and strong pertinence of the initiated immunoreaction, can specifically detect and identify the toxoplasma gondii Actin protein, is mainly used as an internal reference in the aspect of detecting the expression level of the toxoplasma gondii protein, and can more accurately determine the relative expression quantity of the target protein; the toxoplasma in invading cells can also be localized by immunofluorescence, and further research on the molecular action mechanism of the toxoplasma also provides great help.)

一种弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体及其应用，属于免疫学领域。

背景技术

弓形虫是一种***间广为流行的胞内寄生原虫，其感染严重危害人类健康和畜牧业的发展。现有研究结果表明弓形虫的菱形体蛋白(rhomboids，ROMs)、肌动蛋白(Actin)和微线体蛋白(micronemeproteins，MICs)等多个分子参与入侵过程。

肌动蛋白Actin是一种重要的骨架蛋白，大致可分为六种，其中β-Actin广泛分布于各种组织中，大小在42kDa-43kDa之间，表达量丰富且相对恒定，是PCR的常用内参，其抗体是Western Blot很好的内参指数。

遗憾的是，由于Actin在不同物种之间高度保守，很难获得较好的针对特定物种的Actin抗血清，迄今尚没有商业化的弓形虫Actin抗体问世，在检测弓形虫蛋白的表达水平方面缺少内参对照，无法准确地确定目的蛋白的相对表达量，限制了对其分子作用机制的进一步研究。

发明内容

本发明旨在提供一种弓形虫肌动蛋白Actin的表位多克隆抗体及其应用，为弓形虫的入侵机制及入侵分子间的作用关系研究奠定基础。

本发明弓形虫肌动蛋白Actin的表位多克隆抗体，是以弓形虫Actin氨基酸序列中C端227-237为特异性较好的抗原决定簇肽段，获得弓形虫抗原决定簇多肽，进而制备弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体。具体包括如下步骤：

步骤1：通过分析弓形虫Actin氨基酸序列中的抗原表位，与人、小鼠、猴、鸡等物种的Actin氨基酸序列做同源性比对，确定C端227-237为特异性较好的抗原决定簇肽段，再在序列前加一个半胱氨酸C，偶联KLH，获得弓形虫抗原决定簇多肽；

步骤2：将1mg弓形虫抗原决定簇多肽溶于1ml无菌PBS缓冲液(pH值7.4)中，制备多肽溶液；取1ml多肽溶液加入2.5ml无菌注射针筒中，再加入1ml弗氏完全佐剂(第二次免疫和第三次免疫换为弗氏不完全佐剂)，于冰上反复推拉30min进行乳化，直至形成油包水滴(滴入水面不立即散开)；取两只新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次，免疫3-4次后，采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对多肽的效价，待效价大于1：50000进行最终采血制备抗血清；

步骤3：采用Protein G纯化，将步骤2所得抗血清与PBS缓冲液(pH值7.4)等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸缓冲液(pH值7.4)洗脱，即得到纯化抗体。

步骤1中，所述弓形虫抗原决定簇多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明弓形虫肌动蛋白Actin的表位多克隆抗体的应用，是在特异性检测识别弓形虫Actin蛋白的过程中作为检测试剂使用。

本发明的有益效果体现在：

本发明采用生物信息软件，通过推断弓形虫Actin蛋白的序列，根据其亲水性、可塑性及抗原性等多参数预测的结果，设计的多肽抗原表位成分简单，引发的免疫反应针对性强，能特异性检测识别弓形虫Actin蛋白。主要在检测弓形虫蛋白的表达水平方面作为内参对照，能较为准确地确定目的蛋白的相对表达量；也可以通过免疫荧光对入侵细胞中的弓形虫进行定位，对其分子作用机制的进一步研究提供很大的帮助。

附图说明

图1为抗原表位同源性比对。从图1中可以看出该段抗原表位与人Actin同源性较低。

图2为抗体效价测定。从图2中可以看出获得了高效价单克隆抗体。

图3为抗体SDS-PAGE分析。从图3可见抗体纯化后纯度在85％以上。

图4为抗体Western Blot鉴定。左图为弓形虫Actin多抗，右图为小鼠Actin单抗。从图4中可以看出弓形虫Actin表位多克隆抗体能特异性识别弓形虫Actin蛋白，与人、小鼠、猴、鸡等物种的Actin无交叉反应。

图5为抗体Immunofluorescence鉴定。从图5中可以看出弓形虫Actin多克隆抗体能特异性识别弓形虫。

具体实施方式

1、利用在线软件BepiPred 1.0 Server分析Actin氨基酸序列中的抗原表位，确定C端227-237抗原决定簇肽段，再在序列前加一个半胱氨酸C，偶联KLH，公司合成。

2、动物免疫

将1mg弓形虫ROP18抗原决定簇多肽(连接KLH)溶于1ml无菌PBS缓冲液中，制备多肽溶液。取2.5ml无菌注射器两支，拔去针头，用输液管连接下端出口，然后将准备好的多肽溶液1ml加入针筒中，再加入1ml弗氏完全佐剂(第二次免疫和第三次免疫换为弗氏不完全佐剂)，于冰上反复推拉30min进行乳化，直至形成油包水滴(滴入水面不立即散开)。取两只新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次。免疫3-4次后，采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对多肽的效价，待效价大于1：50000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。

3、抗体纯化

采用Protein G纯化，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。

4、抗体鉴定

4.1纯化抗体间接ELISA效价检测

(1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。

(2)用PBS包被液将多肽稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100μl，4℃冰箱过夜。

包被抗原；多肽

包被浓度；5μg/ml，100μl/孔

包被缓冲液；磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)

(3)包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μl封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。

(4)纯化抗体按1：500，2倍稀释，每孔加入200μl封闭液，37℃恒温箱1h。

(5)取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μl稀释好的酶标二抗，酶标二抗：山羊抗兔-HRP，1:5000。37℃恒温箱1h。

(6)取出酶标板，弃去内液，洗板4次，向每孔先加入100μl TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。

(7)每孔加入100μl 1M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。可见抗体效价在1:12800。

4.2利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定

抗体浓度：3.20mg/ml

体积：10ml

缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.4)

4.3抗体纯度鉴定

纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。可见抗体纯化后纯度在85％以上。

4.4抗体特异性鉴定

提取弓形虫(TgWH6)、人(HFF)、猴(Vero)、鸡(DF-1)、小鼠(RAW)细胞蛋白进行Western Blot，分别使用弓形虫Actin多抗和小鼠Actin单抗作为一抗孵育，通过对比鉴定弓形虫Actin多抗特异性。

5、抗体在免疫荧光中的应用

(1)取HFF细胞计数铺板，每孔约1x10⁴个。

(2)4h后镜下观察发现细胞贴壁约70％，将新鲜取得的GFP-RH速殖子计数，每孔加速殖子约1x10⁴个。

(3)24h后镜下观察到速殖子进入细胞内并形成纳虫泡，吸弃孔内培养液，PBS洗涤3次，每孔加200μl 4％多聚甲醛，4℃固定30min后，PBS洗涤三次，每次3min。

(4)每孔加400μl 0.2％TritonX-100，透膜后PBS洗涤3次，每次3min。

(5)每孔加200μl 5％山羊血清，37℃封闭1h后PBS洗涤3次，每次5min。

(6)用1％BSA将一抗稀释为1:200，每孔加200μl，4℃过夜孵育后PBS洗涤5次，每次3min。

(7)用1％BSA将二抗稀释为1:100，每孔加200μl，37℃孵育1h，PBS洗涤5次，每次3min。

(8)每孔加100μl DAPI染核5min，PBS洗涤5次，每次3min。

(9)制片观察。

由图5免疫荧光结果可以看出，弓形虫虫体被染成红色，抗体能与弓形虫Actin蛋白发生特异性反应，且与宿主细胞无明显交叉反应。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽医科大学

<120> 一种弓形虫Actin蛋白的表位多克隆抗体及其应用

<130> 2019.09.04

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> Toxoplasma gondii

<400> 1

Glu Met Lys Ala Ala Glu Asp Ser Ser Asp Ile

1 5 10