阅读说明：本技术 一种适用于纳米孔测序的真菌高纯度长片段基因组dna提取方法 (Method for extracting fungus high-purity long-fragment genome DNA (deoxyribonucleic acid) suitable for nanopore sequencing ) 是由 郑洪坤 毕经德 骆晨 宋雅丽 王瑞 于 2019-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及高通量DNA测序技术领域,具体涉及一种适用于纳米孔测序的真菌高纯度长片段基因组DNA提取方法。本发明提供一种真菌长片段基因组DNA的提取方法,采用裂解液对真菌细胞进行裂解,依次加入RNA酶和蛋白酶进行消化处理后,采用离子交换柱吸附基因组DNA,经磁珠纯化得到基因组DNA。该方法提取得到的真菌基因组DNA的得率高、纯度高,片段长度长,可以满足纳米孔测序技术对于基因组DNA的质量要求,还具有成本低廉、操作步骤简单、提取耗时短等优势,适用于大量真菌样本的基因组测序。(The invention relates to the technical field of high-throughput DNA sequencing, in particular to a method for extracting fungal high-purity long-fragment genome DNA (deoxyribonucleic acid) suitable for nanopore sequencing. The invention provides a method for extracting fungus long-fragment genome DNA, which comprises the steps of cracking fungus cells by using a cracking solution, adding RNA enzyme and protease in sequence for digestion treatment, adsorbing the genome DNA by using an ion exchange column, and purifying by using magnetic beads to obtain the genome DNA. The fungal genome DNA extracted by the method has the advantages of high yield, high purity and long fragment length, can meet the quality requirement of nanopore sequencing technology on the genome DNA, has the advantages of low cost, simple operation steps, short extraction time and the like, and is suitable for genome sequencing of a large number of fungal samples.)

一种适用于纳米孔测序的真菌高纯度长片段基因组DNA提取 方法

技术领域

本发明涉及高通量DNA测序技术领域，具体涉及一种适用于纳米孔测序的真菌高纯度长片段基因组DNA提取方法。

背景技术

随着高通量测序技术的发展，Long-read(长读长)测序技术愈发受到科学界的青睐，纳米孔测序平台如Oxford nanopore公司的MinION、GridION和PromethION测序仪均在最前沿的基因测序领域如基因组de novo、变异检测、转录组、表观遗传、临床应用中均扮演着重要的角色。而这些纳米孔测序平台因为测序读长长的原因，也对基因组DNA提取提出了更高的要求。研究人员不仅要保证基因组DNA的得率和纯度，还需要获得更完整的高分子量的基因组DNA以满足下游纳米孔测序技术的需求，从而在基础科研及医学应用上获得更可靠的技术支持。

真菌细胞壁是真菌特有的一种细胞结构。真菌细胞壁干重的80％由碳水化合物组成，如：几丁质、脱乙酰壳多糖、葡聚糖、纤维素、半乳聚糖等。真菌细胞壁干重的大约10％由蛋白质及糖蛋白构成，蛋白质包括负责细胞壁生长的酶、特定胞外酶和将多糖交联起来的结构蛋白。此外，真菌细胞壁还有类脂、无机盐等小分子。在真菌细胞壁中不同的多糖链相互缠绕组成粗壮的链，这些链构成的网络系统嵌入在蛋白质及类脂和一些小分子多糖的基质中，这一复杂结构使得真菌细胞壁具有良好的机械硬度和强度。显微镜下观察真菌细胞壁，可看到4-8层明显的分层，如典型真菌白色念珠菌的细胞壁可大致分为4层。细胞壁的成分也会随真菌类群的不同而不同。真菌细胞壁的特殊结构对真菌基因组DNA的提取造成了很大的困难，目前现有技术中尚无适用真菌种类广泛，提取得率高、纯度高，片段长度长的高效的真菌基因组DNA的提取方法。

综上，如何在现有的工具酶、DNA提取技术和纯化手段的基础上，开发一套针对真菌样本的更加经济、快捷、高效且适用范围广的高得率、高纯度、长片段基因组DNA提取方法是目前高通量测序领域迫切需要解决的问题。

发明内容

为解决现有技术中的技术问题，本发明的目的在于提供一种真菌基因组DNA的提取方法，该方法提取基因组DNA的得率高、纯度高、片段长度长，可满足纳米孔测序平台对于基因组DNA的质量要求。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明针对真菌样本，通过大量的基因组提取研究和实践，发现在利用溶壁酶充***解真菌细胞后，依次进行RNA酶消化处理和蛋白酶K消化处理，相比于同时进行RNA酶消化处理和蛋白酶K消化处理或在其它阶段进行消化处理能够更有效地提高基因组DNA的纯度，并且能够避免破坏基因组DNA的完整性，配合特定的离子交换柱吸附长片段基因组DNA的作用，能够显著提高长片段基因组DNA的得率，最后采用磁珠纯化，则能够有效去除盐分等小分子杂质，在提高基因组DNA纯度的同时避免破坏基因组DNA的完整性。利用上述各步骤之间的配合作用，能够在有效去除杂质，提高基因组DNA纯度的同时，降低了基因组DNA的破坏程度，有效保证了长片段基因组DNA的得率。

具体地，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种真菌长片段基因组DNA的提取方法，其为采用裂解液对真菌细胞进行裂解后，依次进行RNA酶消化处理和蛋白酶消化处理后，采用离子交换柱吸附基因组DNA，经磁珠纯化得到基因组DNA。

优选地，所述离子交换柱为以DEAE作为功能基团的阴离子交换树脂纯化柱。本发明发现，采用上述离子交换柱能够更有效地吸附长片段基因组DNA，而对于杂质的吸附作用则较小。

优选地，所述离子交换柱是QIAGEN公司的Genomic-tip柱或MN公司的NucleoBondCB柱。

优选地，所述采用离子交换柱吸附基因组DNA包括：分离经蛋白酶K消化处理后的上清，加入所述离子交换柱中，使所述上清中的液体依靠重力作用自然流出，加入洗涤液进行洗涤后，再加入洗脱液洗脱。

优选地，所述裂解液包含溶壁酶(Lyticase)，所述裂解液中，所述溶壁酶的浓度为90U/mL～110U/mL。

优选地，所述裂解液还包含如下组分：盐酸胍0.6～1M、乙二胺四乙酸二钠二水合物20～40mM、三羟甲基氨基甲烷20～40mM、Tween-20体积百分含量3～6％、Triton X-100体积百分含量0.3～0.6％。本发明发现在上述配方的裂解液中加入溶壁酶能够更有效地促进不同种真菌细胞的裂解。

优选地，所述裂解液pH为8.0。可采用氢氧化钠调节所述裂解液的pH为8.0。

优选地，所述裂解为在37℃处理1～1.5h。

优选地，所述RNA酶消化处理中，RNA酶的添加量为至浓度为0.5～0.8mg/mL。所述RNA酶的消化处理为在37℃处理30～45min。

优选地，所述蛋白酶K消化处理中，蛋白酶K的添加量为至浓度为1～1.5mg/mL。所述蛋白酶K的消化处理为在50℃处理1.5～2.5h。

在利用所述裂解液充***解真菌细胞后，依次先后进行RNA酶消化处理和蛋白酶K消化处理能够在更好地发挥去除RNA和蛋白质杂质作用的同时保证基因组DNA的完整性，更有利于长片段基因组DNA的获得。

优选地，在将所述离子交换柱吸附的基因组DNA洗脱后，进行基因组DNA的沉淀。

更优选地，采用异丙醇沉淀基因组DNA，用乙醇洗涤沉淀后进行溶解。

所述溶解可采用TE缓冲液进行溶解。

优选地，所述磁珠纯化为经沉淀、洗涤、溶解得到的基因组DNA溶液中加入磁珠，采用乙醇洗涤磁珠，纯化基因组DNA。

所述磁珠纯化中，磁珠加入量优选为0.4～0.6倍基因组DNA溶液的体积。

所述磁珠纯化可采用贝克曼Agencourt AMPure XP磁珠。

本发明还提供所述真菌长片段基因组DNA的提取方法在基因组测序文库构建中的应用。

优选地，所述文库为用于纳米孔测序的文库。

作为本发明的优选方案，所述真菌长片段基因组DNA的提取方法包括如下步骤：

(1)将真菌样品在液氮中研磨成细粉状；

(2)每100mg研磨后的真菌样品中加入1.5ml裂解液，颠倒混匀，37℃水浴1h，期间颠倒混匀2～4次；所述裂解液包含如下组分：盐酸胍0.7～0.8M、乙二胺四乙酸二钠二水合物25～30mM、三羟甲基氨基甲烷25～30mM、Tween-20体积百分含量4～5％、Triton X-100体积百分含量0.4～0.5％、溶壁酶90U/ml～110U/ml；

(3)加入RNaseA至浓度为0.6～0.8mg/mL，颠倒混匀，37℃水浴30min；

(4)加入蛋白酶K至浓度为1.2～1.5mg/mL，颠倒混匀，50℃水浴2h，期间轻轻颠倒混匀2-4次；

(5)15000×g，4℃离心20min，收集上清再于15000×g离心5min，收集上清；

(6)用柱平衡液(QBT)平衡离子交换柱，将步骤(5)收集的上清转入离子交换柱中，使其依靠重力自热流出柱子；用洗涤液(QC)洗涤离子交换柱；用洗脱液(QF)洗脱DNA；所述离子交换柱的填料为以DEAE作为功能基团的阴离子交换树脂纯化柱；

(7)在洗脱得到的DNA溶液中加入0.8～1倍体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀10-20次；15000×g，4℃离心30min，弃上清液；用70％～75％乙醇洗涤沉淀2次并晾干；用TE缓冲液溶解DNA；

(8)在步骤(7)得到的DNA溶液中加入0.4～0.5倍DNA溶液体积的磁珠，混匀后室温静置5min；将样品管置于磁力架上，静置5min使磁珠被完全吸附到磁铁一侧，移弃上清液；将样品管置于磁力架上，用70％乙醇吹吸清洗磁珠，将样品管置于磁力架上静置30s，移弃上清液；重复清洗一次，在第二次清洗移弃上清液后瞬时离心，将样品管置于磁力架上，将上清液去除干净；将样品管置于磁力架上，打开管盖，使残留乙醇挥发干净；加入Nuclease-free水，混匀，室温静置5min，再置于磁力架上静置10min，吸取洗脱液即得基因组DNA。

本发明的有益效果在于：

利用本发明提供的真菌基因组DNA的提取方法所提取的真菌基因组DNA的得率高，无RNA和蛋白污染、纯度高；并且提取的真菌基因组DNA片段长，主带在48.5k以上，可满足纳米孔测序等Long-read基因组测序技术的要求。此外，本发明提供的真菌基因组DNA提取方法还具有成本低廉、操作步骤简单、提取耗时短等优势，适用于对大量真菌样本基因组测序时基因组DNA的提取。

附图说明

图1为本发明实施例1中的真菌基因组DNA的提取方法的流程示意图。

图2为本发明实验例1中利用琼脂糖凝胶电泳检测真菌基因组DNA的完整性；其中，A为实施例1的方法提取得到的真菌基因组样品的电泳检测图；B为DNA marker M的各条带大小示意图；C为DNA marker K的各条带大小示意图；D为对比例1的方法提取得到的真菌基因组样品的电泳检测图；E为对比例2的方法提取得到的真菌基因组样品的电泳检测图；1：利用实施例1、对比例1或对比例2的方法提取得到的真菌基因组DNA样品，M和K分别为不同的DNA marker，M为λDNA采用Hind III消化得到的DNA Marker。

图3为本发明实验例2中利用实施例1的方法分别提取酵母菌、黄瓜白粉菌、杨盘二孢菌、白灵菇的基因组DNA的电泳检测结果图；其中，1、2、3、4分别为酵母菌、黄瓜白粉菌、杨盘二孢菌、白灵菇的基因组DNA样品，M和K分别为不同的DNA marker，M为λDNA采用Hind III消化得到的DNA Marker。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1一种真菌基因组DNA的提取方法

本实施例提供一种真菌基因组DNA的提取方法，具体如下(流程图如图1所示)：

(1)用100％酒精棉擦拭台面、研钵内部及药匙，酒精灼烧研钵、研磨棒及药匙，失活RNase；温度降低后用新的PE手套盖住所有研钵，防止研磨产生的组织飞沫造成交叉污染；研磨前取出一个研钵和研磨棒，液氮彻底冷却后放入真菌样品(冷冻样品不能解冻)，立即将液氮注入研钵中，用研钵棒将组织充分研磨成粉末状，期间样品不能融化，须一直保持在低温状态；

研磨充分后用液氮预冷的药匙将100mg真菌样品粉末立即装入提前预冷好已标记样品名称的2.0ml进口离心管中，盖紧管盖后放入液氮中保存备用(装管前需将离心管中液氮挥发充分以防止炸管)；

(2)每100mg研磨后的样品中加入1.5ml不含溶壁酶的裂解液(配方如下：盐酸胍0.8M、乙二胺四乙酸二钠二水合物30mM、三羟甲基氨基甲烷30mM、Tween-20 5.0％(体积百分含量)、Triton X-100 0.5％(体积百分含量)，并用氢氧化钠调节pH至8.0)，涡旋混匀；加入15μl浓度为10U/μl的溶壁酶，颠倒混匀，37℃水浴1h，期间颠倒混匀2次；

(3)加入10μl浓度为100mg/ml RNaseA，颠倒混匀，37℃水浴30min；

(4)加入100μl浓度为20mg/ml的蛋白酶K，颠倒混匀，50℃水浴2h，期间轻轻颠倒混匀3-4次；

(5)15000×g，4℃离心20min，上清转入新的离心管中；15000×g离心5min，收集上清；

(6)用柱平衡液(QBT)平衡离子交换柱(QIAGEN Genomic-tip20G)，将步骤(5)收集的上清转入离子交换柱中，使其依靠重力自热流出柱子(如上清体积较大，可分多次重复上柱)；用4×1ml洗涤液(QC)洗涤离子交换柱；用1ml洗脱液(QF)洗脱基因组DNA；

(7)将步骤(6)洗脱得到的基因组DNA溶液转入2.0ml的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀10-20次，15000×g，4℃离心30min，弃上清液；用70％乙醇洗涤沉淀2次并晾干；用100μl TE缓冲液溶解DNA，轻轻震荡离心管促进溶解；

(8)在步骤(7)得到的DNA溶液中加入45μl贝克曼Agencourt AMPure XP磁珠(0.45倍DNA溶液体积)，轻弹混匀后室温静置5min；将样品管置于磁力架上，静置5min使磁珠被完全吸附到磁铁一侧，移弃上清液；将样品管置于磁力架上，用200μl的70％乙醇吹吸六次清洗磁珠(将移液器垂直于孔中央吹吸，不要对着磁珠吹吸)，将样品管置于磁力架上静置30s，移弃上清液；重复清洗一次，在第二次清洗移弃上清液后瞬时离心，将样品管置于磁力架上，将上清液去除干净；将样品管置于磁力架上，打开管盖，干燥至残留乙醇挥发干净，加入51μl的Nuclease-free水，轻弹混匀，室温静置5min；再置于磁力架上静置10min，吸取50μl洗脱洗脱液即得基因组DNA。

实施例2

本实施例提供一种基因组DNA的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(6)中用MN公司的NucleoBond CB柱替代QIAGEN Genomic-tip 20G，相应的平衡液(QBT)、洗涤液(QC)和洗脱液(QF)替换为MN公司的NucleoBond CB柱配套的平衡液(H2)、洗涤液(H4)和洗脱液(H5)。

对比例1

本对比例提供一种基因组DNA的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)和步骤(4)中RNA酶和蛋白酶K的加入改成在同一步骤中同时加入RNA酶和蛋白酶K，颠倒混匀，50℃水浴2h，期间轻轻颠倒混匀3-4次，其他步骤均与实施例1相同。

对比例2

本对比例提供一种基因组DNA的提取方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中的裂解过程中不加入溶壁酶。

实验例1

分别利用实施例1和2以及对比例1和2的方法提取木霉菌的基因组DNA，并利用Nanodrop、Qubit和琼脂糖凝胶电泳对提取得到的基因组DNA进行浓度、纯度和完整性分析。

其中，实施例1、对比例1和2的基因组DNA的得率、纯度和完整性的检测结果如表1和图2所示，结果显示，采用本发明实施例1的方法提取真菌基因组DNA的得率高，纯度高(表1)；电泳胶孔无明显杂质污染，主条带清晰并在48.5Kb以上，无明显降解无拖尾降解现象，完整性非常好(图2)，能够满足Long-read测序技术对于基因组DNA样品的纯度、总量和片段长度的要求。利用实施例2的方法得到的基因组DNA的质量检测结果与实施例1相当。

表1木霉菌基因组DNA的质量检测

实验例2其他真菌基因组DNA的提取和质量分析

利用实施例1的方法分别提取酵母菌、黄瓜白粉菌、杨盘二孢菌、白灵菇的基因组DNA，并利用Nanodrop、Qubit和琼脂糖凝胶电泳对提取得到的基因组DNA进行浓度、纯度和完整性分析。

基因组DNA的浓度、纯度和完整性的检测结果如表2和图3所示，结果显示，使用本方法提取上述四种真菌的基因组DNA的得率高，纯度好(表2)；电泳胶孔无明显杂质污染，主条带清晰并在48.5Kb以上，无明显降解无拖尾降解现象，完整性非常好(图3)，能够满足Long-read测序技术对于基因组DNA样品的纯度、总量和片段长度的要求。利用实施例2的方法得到的基因组DNA的质量检测结果与实施例1相当。

表2酵母菌、黄瓜白粉菌、杨盘二孢菌、白灵菇基因组DNA的质量检测

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。