基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用
阅读说明：本技术 基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用 (Application of gene FoPDCD5 in regulation and control of pathogenicity of banana fusarium oxysporum ) 是由 李云锋 聂燕芳 蒙姑 李华平 王振中 于 2019-10-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用,属于植物基因工程领域。本发明利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除,获得敲除突变体ΔFopdcd5；通过构建基因回补载体,将其导入ΔFopdcd5原生质体；利用随机插入的方法将该基因回补到敲除突变体中,获得回补突变体ΔFopdcd5-com。致病性测定表明,敲除突变体ΔFopdcd5的致病性显著降低；回补突变体ΔFopdcd5-com的致病性则恢复到野生型水平。本发明证实FoPDCD5是香蕉枯萎病菌分生孢子产生、应对氧化胁迫和致病性所必需的。有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制,为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。(The invention discloses an application of a gene FoPDCD5 in regulation and control of pathogenicity of banana vascular wilt, and belongs to the field of plant genetic engineering. The gene is knocked out from banana fusarium oxysporum by using a homologous recombination method to obtain a knock-out mutant delta Fopdcd 5; introducing a gene complementation vector into a delta Fopdcd5 protoplast by constructing the vector; the gene was complemented back into the knockout mutant by random insertion to obtain the complementing mutant Δ Fopdcd 5-com. Pathogenicity assays indicate that the pathogenicity of the knockout mutant Δ Fopdcd5 is significantly reduced; the pathogenicity of the anaplerotic mutant Δ Fopdcd5-com was restored to wild-type levels. The invention proves that the FoPDCD5 is necessary for generating conidia of the fusarium oxysporum f.sp.cubense, and coping with oxidative stress and pathogenicity. Contributes to deeply clarifying the pathogenic molecular mechanism of the banana fusarium wilt and provides a target gene for developing an effective bactericide.)
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。
背景技术
香蕉枯萎病是我国香蕉生产上最重要的病害之一，严重威胁香蕉产业的可持续性发展。香蕉枯萎病的病原为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense，Foc)，依据其对寄主易感性的不同可分为3个生理小种，其中以4号生理小种(Foc4)危害最为严重，几乎能危害目前所有的栽培品种。目前对香蕉枯萎病的防治主要以选育抗性品种为主，但由于栽培蕉多为三倍体，高度不育且没有种子，导致香蕉的常规杂交育种非常困难。充分挖掘香蕉枯萎病菌致病相关基因并开展其功能研究，有助于全面了解香蕉枯萎病菌的致病分子机理，并为香蕉枯萎病的防控提供理论基础。
PDCD5(Program Cell Death Protein 5)是一种凋亡加速蛋白，含有1个DNA-binding domain，在进化上具有高度保守性。目前关于PDCD5蛋白的研究主要集中在人癌细胞中，主要作用为调控程序性细胞死亡和免疫调节。关于PDCD5在植物病原真菌中的具体功能未见报道。在香蕉枯萎病菌蛋白质组学研究中，我们鉴定到一种预测的蛋白质ProgramCell Death Protein 5，predicted，其在香蕉枯萎病菌中的功能未知。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。
本发明公开了一种香蕉枯萎病菌基因FoPDCD5及其编码蛋白PDCD5的新功能。基因FoPDCD5为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其所编码的蛋白PDCD5为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；PDCD5蛋白含有1个DNA-binding domain。本发明通过构建基因敲除载体，将其导入香蕉枯萎病菌原生质体；利用同源重组方法将该基因从香蕉枯萎病菌中敲除，获得敲除突变体ΔFopdcd5；通过构建基因回补载体，将其导入ΔFopdcd5原生质体；利用随机***的方法将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体ΔFopdcd5-com。该基因的敲除突变体在分生孢子产生和应对氧化胁迫方面存在缺陷。致病性测定表明，敲除突变体ΔFopdcd5的致病性显著降低；回补突变体ΔFopdcd5-com的致病性则恢复到野生型水平。上述试验证明，香蕉枯萎病菌FoPDCD5为香蕉枯萎病菌的致病相关基因。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用。
进一步的，所述的基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌产孢量中的应用。
进一步的，所述的基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌抗胁迫中的应用；
优选的，所述的胁迫为氧化胁迫。
本发明提供一种基因FoPDCD5在防治由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病中的应用。
本发明提供一种基因FoPDCD5作为用于植物病害防治药物的靶标的应用，所述的植物病害是由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。
本发明再提供一种治疗由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病的方法，包含阻断或抑制香蕉枯萎病菌中基因FoPDCD5的表达(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)。
阻断或抑制香蕉枯萎病菌中基因FoPDCD5表达的药剂(例如利用该基因的反义RNA或siRNA等)在制备药物中的应用，所述药物用于控制由香蕉枯萎病菌导致的香蕉枯萎病。
其中，所述的香蕉枯萎病菌基因FoPDCD5，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、***、缺失而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物；
所述的基因FoPDCD5，其核苷酸序列为下列A、B、C之一：
A、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA序列；
B、如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；
C、以上A和B通过碱基***、缺失、或替换而获得的仍具有控制香蕉枯萎病菌致病力功能的类似物；
进一步的，所述的香蕉枯萎病菌为香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)。
含有上述基因FoPDCD5的敲除载体、重组菌在上述方面的应用也属于本发明的保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供的香蕉枯萎病菌基因FoPDCD5含有1个DNA-binding domain，但其在香蕉枯萎病菌的生物学功能并不清楚。将潮霉素磷酸转移酶基因(hph)和荧光蛋白基因(SGFP)置换蛋白PDCD5的编码基因FoPDCD5，得到Foc4敲除突变体ΔFopdcd5；试验证明，相比Foc4野生型，ΔFopdcd5产孢量显著降低，对氧化胁迫更加敏感；致病性试验表明，FoPDCD5的缺失显著降低了香蕉枯萎病菌的致病力；将该基因回补后，其致病力得到恢复。本发明证实FoPDCD5是香蕉枯萎病菌分生孢子产生、应对氧化胁迫和致病性所必需的。我们的研究有助于深入阐明香蕉枯萎病菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。
附图说明
图1是香蕉枯萎病菌基因FoPDCD5敲除载体的构建示意图。
图2是香蕉枯萎病菌基因FoPDCD5回补载体的构建示意图。
图3是部分潮霉素抗性转化子A-hph基因的PCR扩增；M：Marker5000；泳道1：pCT74质粒；泳道2-6：转化子1、2、3、4、5。
图4是部分潮霉素抗性转化子目的基因FoPDCD5的PCR扩增；M：Marker5000；泳道wt：Foc4野生型；泳道1-3：转化子1、2、5。
图5是以FoPDCD5片段为探针的Foc4敲除转化子的Southern blot分析；
图6是以hph片段为探针的Foc4敲除转化子的Southern blot分析；
图7是敲除突变体△Fopdcd5对不同胁迫条件的分析。
图8是部分博来霉素抗性转化子的FoPDCD5基因的PCR分析；M：Marker5000；泳道1：Foc4野生型；泳道2-5：转化子1、2、5、7。
图9是敲除突变体ΔFopdcd5和回补突变体ΔFopdcd5-com的致病性分析。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1、实验材料
1.1供试菌株及植物
供试菌株为香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)，供试植物为具有4～5片叶的巴西蕉(Cavendish，AAA)。
1.2宿主菌及质粒载体
克隆载体为pMD18-T vector，基因敲除载体为丝状真菌表达载体pCT74，基因回补载体为pCTZN(由本实验室在pCT74质粒基础上改造得来，即将pCT74上的SGFP和hph基因替换成博来霉素(Zeocin)基因)。
2、实验方法
2.1香蕉枯萎病菌FoPDCD5上下游同源片段的扩增
香蕉枯萎病菌FoPDCD5基因敲除载体的构建如图1所示。在FoPDCD5基因的上游和下游各选取长度大小约为1500bp左右的序列(分别命名为同源臂A片段和同源臂B片段)，并设计引物(表1)。
表1 FoPDCD5基因同源臂A片段和B片段的扩增引物
引物名称
引物序列5’-3’
酶切位点
FoPDCD5-AF
GG<u>GGTACC</u>GAACAGGGATTCTGTTAAGCAGTTC
Kpn I
FoPDCD5-AR
CC<u>GGGCCC</u>GATCTTGATACGTGACGTTCTTTAA
ApaI
FoPDCD5-BF
G<u>GAATTC</u>GAGGTGCTTGTGATACCATGGAATT
EcoR I
FoPDCD5BR
G<u>ACTAGT</u>CGTCATGTCGTTTTTCGATCCCTAT
SpeI
用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)，提取Foc4基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物FoPDCD5-AF和FoPDCD5-AR进行PCR扩增，获得FoPDCD5基因的同源臂A片段(FoPDCD5-A)；用引物FoPDCD5-BF和FoPDCD5-BR进行PCR扩增，获得FoPDCD5基因的同源臂B片段(FoPDCD5-B)。
具体的PCR反应体系为：
模板DNA
1.0μL
FoPDCD5-AF/BF(10μmol/L)
1.0μL
FoPDCD5-AR/BR(10μmol/L)
1.0μL
10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)
5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)
4.0μL
Taq(5U/μL)
0.5μL
ddH<sub>2</sub>O
37.5μL
Total
50.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，67℃反应1min，72℃反应1min，共35个循环；72℃反应10min。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。
2.2 FoPDCD5基因敲除载体的构建
参考pMD 18-T Vector Cloning Kit(TakaRa公司)试剂盒说明书，将FoPDCD5-A和FoPDCD5-B分别与T载体连接，获得重组质粒pMD18T-FoPDCD5-A和pMD18T-FoPDCD5-B。具体为：取1μL pMD 18-T载体，分别加入4μL上述PCR回收产物(同源臂A片段或同源臂B片段)和5μL solution I，于16℃连接过夜。取10μL连接产物加入到100μL大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，冰上放置30min；于42℃水浴热击90s，冰上冷却5min；加入800μL LB液体培养基，于37℃、150rpm振荡培养45min；再于4000rpm离心5min，弃上清，留100μL菌液与沉淀混匀，涂布于LB固体培养基(含50μg/mL Amp)；于37℃下培养8～12h。
挑取具有Amp抗性的阳性转化子，提取重组质粒DNA，并进行测序鉴定。用Kpn I、ApaI分别对pMD18T-FoPDCD5-A和pCT74载体进行双酶切，回收A片段和pCT74载体。用T4 DNA连接酶将A片段与pCT74连接，转化大肠杆菌DH5α；获得重组质粒pCT74-FoPDCD5-A。按同样程序，用EcoRI和SpeI双酶切pMD18T-FoPDCD5-B和重组质粒pCT74-FoPDCD5-A，回收B片段和重组质粒。用T4 DNA连接酶将B片段与pCT74-FoPDCD5-A连接，转化大肠杆菌DH5α；经酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-FoPDCD5-KO。
2.3 FoPDCD5回补片段的扩增
香蕉枯萎病菌FoPDCD5基因回补载体的构建如图2所示。在FoPDCD5基因的上游选取长度为1500bp的启动子序列，下游选取长度为500bp的终止子序列，并设计引物(表2)。
表2 FoPDCD5基因回补片段的扩增引物
引物名称
引物序列5’-3’
酶切位点
FoPDCD5-comF
G<u>GAATTC</u> GCGCCATCACGGCCA
EcoR I
FoPDCD5-comR
G<u>ACTAGT</u>TAGGCGTTCATTCATTATTTCCGT
SpeI
用真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)，提取香蕉枯萎病菌基因组DNA；以该基因组DNA为模板，用引物FoPDCD5-comF和FoPDCD5-comR进行PCR扩增，获得FoPDCD5基因的回补片段(FoPDCD5-com)。
具体的PCR反应体系为：
模板DNA
1.0μL
FoPDCD5-comF(10μmol/L)
1.0μL
FoPDCD5-comR(10μmol/L)
1.0μL
10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)
5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)
4.0μL
ExTaq(5U/μL)
0.5μL
ddH<sub>2</sub>O
37.5μL
Total
50.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，60℃反应1min，72℃反应4min，共30个循环；72℃反应10min。用OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒，对PCR扩增产物进行清洁回收。
2.4 FoPDCD5基因回补载体的构建
用EcoR I和SpeI分别对FoPDCD5-com和pCTZN载体进行双酶切，回收FoPDCD5-com片段和pCTZN载体。用T4 DNA连接酶将FoPDCD5-com片段与pCTZN连接，转化大肠杆菌DH5α；获得重组质粒pCTZN-FoPDCD5-com。经酶切鉴定，获得基因回补载体pCTZN-FoPDCD5-com。
2.5 Foc4原生质体的制备
将Foc4接种到查氏培养基(FeSO4.7H2O 0.018g，KCl 0.5g，K2HPO4.3H2O 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，NaNO3 3g，蔗糖30g，蒸馏水定容至1L)中，于28℃、150rpm振荡培养3d；将培养液用200目细胞筛过滤，于4℃下10000×g离心10min，弃上清。用NCM培养基(葡萄糖10g，天冬氨酸4g，20×硝酸盐50mL，1000×维生素1mL，1000×微量元素1mL，200×铁盐5mL，定容至1L，pH 6.5)重悬沉淀并进行稀释后，制得Foc4分生孢子悬浮液。将制备好的分生孢子悬浮液接种于NCM培养基中，使分生孢子终浓度为1×106个/mL；于28℃下120rpm震荡培养11～12h，用200目细胞筛过滤，并用0.8mol/L NaCl溶液(渗透压稳定剂)冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体。按酶液与菌丝比例(体积质量比10:1)，加入适量15g/L崩溃酶酶液，于30℃下120rpm条件下酶解3h，得到原生质体酶解液。于4℃下400×g离心10min，弃上清。加入1mL预冷的STC溶液(含10mmol/L Tris-Hcl(pH 7.5)，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl2)重悬沉淀；离心，弃上清。再加入10～20mL预冷的STC将沉淀重悬，得到Foc4原生质体悬液，使原生质体终浓度约为1×107个/mL。
香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体，参照上述香蕉枯萎病菌原生质体的制备步骤制备得到。
2.6 Foc4敲除突变体原生质体的转化
用Kpn I和SpeI对敲除载体pCT74-FoPDCD5-KO进行双酶切，获得A-hph-sgfp-B片段。将5μg的A-hph-sgfp-B片段与200μL原生质体混匀；或者，将pCTZN-FoPDCD5-com质粒与200μL香蕉枯萎病菌敲除突变体原生质体混匀；冰浴15min；逐滴加入1mL PSTC转化缓冲液(40％PEG4000，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris-HCl，pH7.5)，混匀后冰上放置15min；加入10mL预冷的STC，混匀；于4℃下4000rpm离心15min；去掉6mL上清，用3mLPSB再生培养基(马铃薯200.0g，蔗糖273.6g，蒸馏水定容至1L)重悬沉淀，于28℃、100rpm震荡培养12h～16h。于4℃下4000rpm离心15min，去掉5mL上清，加入12mL PSA再生培养基(PSB再生培养基中加入1.5％琼脂粉、150μg/mL潮霉素或200μg/mL博来霉素)，混匀倒板，于28℃黑暗培养2～3d；挑取潮霉素(或博来霉素)抗性转化子，转移到含有150μg/mL潮霉素(或200μg/mL博来霉素)的PDA培养基(含马铃薯200.0g，无水葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1L)，于28℃黑暗培养3～4d，挑取单菌落用于鉴定。
2.7 Foc4敲除突变体的PCR验证分析
按照真菌DNA提取试剂盒(OMEGA Fungal DNA Kit)说明书，提取上述潮霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。分别用引物A-hph-F/A-hph-R进行A-hph基因片段的PCR扩增；用引物FoPDCD5-F/FoPDCD5-R进行FoPDCD5基因片段的PCR扩增分析。
A-hph-F：5′-GCCTGAAGAAGTTCTGCTACCGCCG-3′，
A-hph-R：5′-TGGCAAACTGTGATGGACGACACCG-3′，
FoPDCD5-F：5′-ATGGATGACGCAGATTAGAACAGG-3′，
FoPDCD5-R：5′-TTACAGATCCAAATCGTCATCATCG-3′；
PCR反应体系如下：
模板DNA
0.5μL
FoPDCD5-F/A-hph-F(10μmol/L)
0.5μL
FoPDCD5-R/A-hph-R(10μmol/L)
0.5μL
10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)
2.5μL
dNTPs(2.5mmol/L)
2.0μL
Taq(5U/μL)
0.25μL
ddH<sub>2</sub>O
18.75μL
Total
25.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，56℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。
2.8 Foc4敲除突变体的Southern blot分析
按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche公司)说明书，进行Southern blot杂交。用引物FoPDCD5-F/FoPDCD5-R扩增目的基因探针，用hph-F/hph-R扩增hph基因探针。
FoPDCD5-F：5′-ATGGATGACGCAGATTAGAACAGG-3′，
FoPDCD5-R：5′-TTACAGATCCAAATCGTCATCATCG-3′，
hph-F：5′-TGCTGCTCCATACAAGCCAA-3′，
hph-R：5′-GACATTGGGGAGTTCAGCGA-3′；
DNA探针的PCR扩增体系如下：
模板DNA
1.0μL
FoPDCD5-F/hph-F(20μmol/L)
1.0μL
FoPDCD5-R/hph-R(20μmol/L)
1.0μL
10×Ex Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)
5.0μL
dNTPs(2.5mmol/L)
4.0μL
Ex Taq(5U/μL)
0.5μL
ddH<sub>2</sub>O
37.5μL
Total
50.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，56℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。
2.9 Foc4敲除突变体的表型观察
(1)菌落形态观察及生长速度测定。将Foc4野生型和敲除突变体ΔFopdcd5接种于PDA培养基上，于28℃黑暗条件下培养。分别在第1d、3d、5d、7d时测量菌落直径，并观察其菌落形态。
(2)分生孢子的产生与萌发观察。将香蕉枯萎病菌接种至查氏培养基，置于28℃、120rpm震荡培养，7d后统计产孢量。将分生孢子悬浮液接种于NCM培养基，于28℃、120rpm震荡培养，11h时取样，观察分生孢子的萌发情况。
2.10敲除突变体ΔFopdcd5抗胁迫分析
(1)高渗透压胁迫分析
将Foc4野生型和ΔFopdcd5分别接种在含有1mol/L NaCl和1mol/L山梨醇的PDA培养基上，于28℃培养箱倒置培养7d后，观察ΔFopdcd5和野生型菌株的菌落生长情况。
(2)氧化胁迫分析
将香蕉枯萎病菌野生型和敲除突变体ΔFopdcd5接种在含有50mmol/L H2O2的PDA培养基上，于28℃培养箱倒置培养7d后，观察ΔFoPdcd5和野生型菌株的菌落生长情况。
(3)细胞壁完整性分析
将香蕉枯萎病菌野生型和敲除突变体ΔFopdcd5分别接种在含有0.02％SDS的PDA培养基上，于28℃培养箱倒置培养7d后，观察ΔFopdcd5和野生型菌株的菌落生长情况。
2.11 FoPDCD5回补突变体的PCR鉴定与表型分析
(1)FoPDCD5回补突变体的PCR鉴定
按照真菌DNA提取试剂盒法(OMEGA Fungal DNA Kit)说明书，提取上述博来霉素阳性转化子的基因组DNA，进行PCR验证分析。用引物FoPDCD5-F/FoPDCD5-R进行基因片段FoPDCD5的PCR扩增。
PCR反应体系如下：
模板DNA
0.5μL
FoPDCD5-F(10μmol/L)
0.5μL
FoPDCD5-R(10μmol/L)
0.5μL
10×Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)
2.5μL
dNTPs(2.5mmol/L)
2.0μL
Taq(5U/μL)
0.25μL
ddH<sub>2</sub>O
18.75μL
Total
25.0μL
PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，56℃反应1min，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应10min，得到扩增产物。
(2)FoPDCD5回补突变体的表型分析
1)菌落形态观察。将Foc4野生型、敲除突变体和回补突变体接种于PDA培养基上，于28℃黑暗条件下培养。7d时测量菌落直径，并观察其菌落形态。
2)产孢量分析。将香蕉枯萎病菌野生型、敲除突变体和回补突变体接种至查氏培养基，置于28℃、120rpm震荡培养，7d后统计产孢量。
2.12敲除突变体ΔFopdcd5和回补突变体ΔFopdcd5-com的致病性分析
取4叶期的巴西蕉，用Foc4野生型、敲除突变体ΔFopdcd5和回补突变体ΔFopdcd5-com的分生孢子(2×105个/mL)悬浮液进行浸根30min，再移栽于营养土中；置于25±1℃的植物培养室内培养，于光/暗12h/12h交替培养，25d后观察香蕉苗叶片和球茎的发病情况。
3结果与分析
3.1香蕉枯萎病菌FoPDCD5基因敲除载体的构建
采用PCR扩增方法，分别克隆获得FoPDCD5基因同源臂A片段和同源臂B片段；分别将其与T载体连接，经转化大肠杆菌、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pMD18T-FoPDCD5-A和pMD18T-FoPDCD5-B。将pMD18T-FoPDCD5-A与pCT74质粒连接，获得重组质粒pCT74-FoPDCD5-A；将其与pMD18T-FoPDCD5-B进行双酶切，经DNA连接、大肠杆菌转化、酶切鉴定，获得基因敲除载体pCT74-FoPDCD5-KO(图1)。
3.2香蕉枯萎病菌FoPDCD5基因回补载体的构建
采用PCR扩增方法，克隆获得FoPDCD5基因回补片段；将其与pCTZN载体连接，经大肠杆菌转化、Amp抗性筛选、质粒提取与测序鉴定，获得重组质粒pCTZN-FoPDCD5-com(图2)。
3.3敲除突变体ΔFopdcd5的筛选
3.3.1基因片段A-hph的PCR验证
利用同源重组方法，将基因敲除载体转化香蕉枯萎病菌原生质体，获得了36个潮霉素阳性转化子。经DNA的提取，利用A-hph基因特异性引物，对36个潮霉素阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，上述36个转化子均扩增到了A-hph基因(图3)。
3.3.2基因片段FoPDCD5的PCR验证
进一步利用FoPDCD5基因特异性引物，对上述PCR扩增到A-hph基因的36个阳性转化子进行FoPDCD5的PCR验证分析。结果表明，在36个转化子中，有2个转化子没有扩增到FoPDCD5基因，进一步说明这2个转化子为阳性转化子(图4)。
3.3.3敲除突变体的Southern blot验证
对扩增到A-hph基因、同时没有扩增到FoPDCD5基因的2个阳性转化子进行了Southern blot分析。结果表明，以目的基因作为探针进行杂交，2个转化子均未有杂交条带(图5)。以hph为探针进行杂交，2个转化子均有单拷贝条带出现(图6)。上述试验进一步证明这2个转化子为阳性转化子。
3.4敲除突变体△Fopdcd5的菌落形态和生长速率测定
将敲除突变体△Fopdcd5接种于PDA培养基中，分别在不同时间对其生长情况进行了观察。结果表明，与香蕉枯萎病菌野生型相比，△Fopdcd5的菌落形态和生长速率没有明显区别。
3.5敲除突变体△Fopdcd5的产孢量分析
将敲除突变体△Fopdcd5接种于查氏培养基，培养7d后进行产孢量分析。结果表明，突变体△Fopdcd5的产孢量显著低于其野生型。
3.6敲除突变体△Fopdcd5分生孢子的萌发观察
将分生孢子接种NCM培养基，置于28℃，120rpm震荡培养；11h后进行观察。结果表明，Foc4野生型分生孢子的萌发与敲除突变体△Fopdcd5无明显差异，说明敲除FoPDCD5后，不影响香蕉枯萎病菌分生孢子的萌发。
3.7敲除突变体△Fopdcd5对不同胁迫条件的分析
将敲除突变体(△Fopdcd5-2和△Fopdcd5-5)分别接种于含1mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、50mmol/L H2O2或0.02％SDS的PDA培养基中，对其菌落形态和直径进行了测定(图7)。结果表明，(1)在含NaCl和山梨醇的PDA培养基中，△Fopdcd5与野生型无明显差异，说明FoPDCD5对Foc4抗高渗透压的能力没有影响。(2)在含0.02％SDS的PDA培养基中，与野生型相比，突变体△Fopdcd5的生长与野生型无明显差异，说明敲除FoPDCD5对Foc4的细胞壁完整性没有影响。(3)在氧化胁迫条件下，与野生型相比，△Fopdcd5突变体的菌落生长缓慢，说明FoPDCD5在Foc4应对氧化胁迫反应中具有重要作用。
3.8回补突变体ΔFopdcd5-com的鉴定与表型分析
利用随机***的方法，将基因回补载体pCTZN-FoPDCD5-com转化香蕉枯萎病菌△Fopdcd5原生质体，获得了9个博来霉素阳性转化子。经基因组DNA的提取，利用FoPDCD5基因特异性引物，对这些阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，有4个阳性转化子可扩增到目的基因片段，说明这4个转化含有FoPDCD5基因；证实这4个转化子为阳性转化子(图8)。对回补突变体ΔFopdcd5-com进行菌落形态观察和产孢量分析，结果表明，回补突变体的菌落形态和产孢量均恢复至野生型水平。
3.9敲除突变体ΔFopdcd5和回补突变体ΔFopdcd5-com的致病性分析
利用伤根接种法，用Foc4野生型、△Fopdcd5和回补突变体△Fopdcd5-com分生孢子分别接种巴西蕉，于25d后进行观察。结果表明，清水对照组的巴西蕉苗均未出现叶片黄化现象，且球茎没变色；Foc4野生型接种后，香蕉整株上下部的叶片上都出现了明显黄化，而且球茎区域的50％以上出现褐变；△Fopdcd5接种后，仅香蕉植株的下部叶片出现黄化，球茎变色区域不超过20％。回补突变体ΔFopdcd5-com接种后，香蕉植株的上下部叶片也均出现大面积黄化，球茎区域的50％以上发生褐变(图9)。进一步对病情指数进行了统计，结果表明△Fopdcd5-com与Foc4野生型的病情指数相似，说明△Fopdcd5-com致病力恢复到野生型水平；同时，△Fopdcd5的病情指数显著低于野生型和回补突变体，说明敲除FoPDCD5基因后，香蕉枯萎病菌致病力明显下降。
因此，本发明提供的基因可以用于植物病害防治，特别是由香蕉枯萎病菌所导致的香蕉枯萎病。另，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是香蕉枯萎病的药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 基因FoPDCD5在调控香蕉枯萎病菌致病力中的应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 基因FoPDCD5的核苷酸序列
<220>
<222> (25)..(77)
<223> 非编码区1
<220>
<222> (167)..(218)
<223> 非编码区2
<400> 1
atggatgacg cagagttaga acaggtagct cacttttgtg gattttatcg ggagtccatc 60
actgattttc ttcgcagtta cgaaaagctc gtctggagca actgaaggcc gaagctggtg 120
gcagtggagg cggttcttct ggtcaggaac aacaacagca gcgccagtca gttgtctcga 180
tccataccgt acgacattat cttactgacc ttgaataggc aacagcaaaa tgatgctcgc 240
caacacatcc tcaaccagat cctccatccc gaagccgccg accgtctagg ccgtatccga 300
cttgtgaaag aggagcgtgc cgccgatatc gagaaccgac ttatcacgct tgcacaaacc 360
ggtcaacttc gacagaaggt cactgaagcg caactcaagg agcttctgaa cgctatgtcg 420
gagagcaagg aggaggagaa gattgttgtg agcagacgca aggcgtggga cgatgatgac 480
gatttggatc tgtaa 495
<210> 2
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 基因FoCWM的氨基酸序列
<400> 2
Met Asp Asp Ala Glu Leu Glu Gln Leu Arg Lys Ala Arg Leu Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ala Glu Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gln Glu
20 25 30
Gln Gln Gln Gln Arg Gln Gln Gln Gln Asn Asp Ala Arg Gln His Ile
35 40 45
Leu Asn Gln Ile Leu His Pro Glu Ala Ala Asp Arg Leu Gly Arg Ile
50 55 60
Arg Leu Val Lys Glu Glu Arg Ala Ala Asp Ile Glu Asn Arg Leu Ile
65 70 75 80
Thr Leu Ala Gln Thr Gly Gln Leu Arg Gln Lys Val Thr Glu Ala Gln
85 90 95
Leu Lys Glu Leu Leu Asn Ala Met Ser Glu Ser Lys Glu Glu Glu Lys
100 105 110
Ile Val Val Ser Arg Arg Lys Ala Trp Asp Asp Asp Asp Asp Leu Asp
115 120 125
Leu
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoPDCD5-AF
<400> 3
ggggtaccga acagggattc tgttaagcag ttc 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoPDCD5-AR
<400> 4
ccgggcccga tcttgatacg tgacgttctt taa 33
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoPDCD5-BF
<400> 5
ggaattcgag gtgcttgtga taccatggaa tt 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoPDCD5-BR
<400> 6
gactagtcgt catgtcgttt ttcgatccct at 32
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoPDCD5-comF
<400> 7
ggaattcgcg ccatcacggc ca 22
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoPDCD5-comR
<400> 8
gactagttag gcgttcattc attatttccg t 31
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> A-hph-F
<400> 9
gcctgaagaa gttctgctac cgccg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> A-hph-R
<400> 10
tggcaaactg tgatggacga caccg 25
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoPDCD5-F
<400> 11
atggatgacg cagattagaa cagg 24
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoPDCD5-R
<400> 12
ttacagatcc aaatcgtcat catcg 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hph-F
<400> 13
tgctgctcca tacaagccaa 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hph-R
<400> 14
gacattgggg agttcagcga 20