阅读说明：本技术 一种硫烯醚化合物及其合成方法和在多肽环化中的应用 (Thioether compound, synthesis method thereof and application thereof in polypeptide cyclization ) 是由 吴川六 李卓儒 郑晓莉 于 2019-10-25 设计创作，主要内容包括：一种硫烯醚化合物及其合成方法和在多肽环化中的应用,属于生物化学技术领域,利用该硫烯醚化合物,可以在温和的条件下对含有一个氮端半胱氨酸及一个链内半胱氨酸的多肽进行快速地环化,从而构建环肽。利用该方法进行翻译后修饰可以构建展示环化多肽的噬菌体展示库,并在此基础上进一步构建可用于检测和治疗等应用的环肽。(A thioether compound, a synthetic method thereof and application thereof in polypeptide cyclization belong to the technical field of biochemistry, and the thioether compound can be utilized to rapidly cyclize a polypeptide containing a nitrogen-terminal cysteine and an intrachain cysteine under mild conditions so as to construct cyclic peptide. The method is utilized to carry out posttranslational modification to construct a phage display library for displaying cyclized polypeptides, and further construct cyclic peptides for detection, treatment and other applications on the basis.)

一种硫烯醚化合物及其合成方法和在多肽环化中的应用

技术领域

本发明涉及属于生物化学技术领域，尤其涉及一种硫烯醚化合物及其合成方法和在多肽环化中的应用。

背景技术

近年来，多肽在化学、生命科学及医药领域得到了广泛的应用。多肽是一种介于生物大分子和有机小分子的分子，其兼备两者的优点。多肽分子具备生物大分子的高多样性、高亲和性及高选择性的特点。而相较传统生物大分子，其又有有机小分子所具有的易于合成，易于衍生和改性的特点(参见European journal of medicinal chemistry 2015,94,459，Bioorganic&medicinal chemistry 2018,26,2759)。

一般的多肽特别是线性肽，由于缺少类似蛋白质中肽链间的相互作用，其表现得相对柔性并具有多种构象，这大大降低了其亲和性和选择性。而较为松散的结构也导致一些酶切位点和反应位点暴露，使其存在代谢稳定性的问题。通过一些环化方法将一般的线性多肽环化形成环肽，可一定程度上解决上述问题。环化将多肽的构象灵活性限制在非环化形式所具有的构象的子集内，使得多肽可通过有效地预组织更好地与目标作用。通过这种预组织，多肽可降低与目标结合时的熵。在某些情况下，由于环化减少了多肽靶外结合的构象，还可提升其亲和性及选择性。此外，环化后的多肽通常表现得更为刚性，结构上更为紧凑，使得多肽的代谢稳定性及膜透过性也进一步提升(参见ACS chemical biology2012,7,817，AngewandteChemie 2018,57,14414，ACS combinatorial science 2015,17,190，Molecules 2018,23)。

目前最常见的环化方法是通过二硫键实现多肽的环化，这也是生物体中多肽环化的主要形式。二硫键是通过多肽或蛋白质上的两个半胱氨酸残基的巯基氧化形成的。但是在体外合成中，由于缺乏合适的氧化环境，二硫键容易发生错误的配对，形成错误的构象或多聚体。此外二硫键的稳定性较其他共价键低，当处于还原环境时会发生断裂。以上两点使得基于二硫键的环化方法并不适于实际应用。人们发展了一系列方法以改进二硫键环化的缺陷。使用硫醚键替换二硫键进行环化是一种已经被广泛使用的方法。硫醚键的稳定性好，克服二硫键不稳定的缺点。而硫醚键的形成是基于巯基和卤素的取代的反应，这使得硫醚键的方法可以直接应用于适用二硫键的体系。但是，基于硫醚键的环化方法通常使用具有高反应活性的卤素或类卤素，如溴、碘等。在反应过程中这些卤素容易发生水解、消去等副反应。此外多肽中的其他活性较高的基团，如氨基、羟基等也会与卤素反应产生副产物。Suga等人通过使用低反应活性的氯解决副反应的问题(Organic&biomolecular chemistry2012,10,5783)。但是其使用过程中需要***含氯的非天然氨基酸以满足分子内反应的反应条件，限制了应用范围。在利用半胱氨酸的巯基进行环化的方法外，还有利用赖氨酸、精氨酸或色氨酸等氨基酸残基的方法，其中基于赖氨酸的酰胺化方法是比较常见的方法，但是该方法中使用的琥珀酰亚胺活性酯不稳定，易产生副反应造成产率较低。此外，还有利于非天然氨基酸的方法，如***含烯烃的非天然氨基酸并利用烯烃复分解反应进行环化。***分别含叠氮及含炔烃的非天然氨基酸并利用叠氮-炔环加成反应进行环化。此类方法都需要引入非天然氨基酸，限制了应用的范围。且反应中通常需要金属催化剂，金属催化剂可能引入金属残留的问题，也可能导致多肽的变性，进一步制约了方法的应用(多肽环化方法参见Chemical reviews 2014,114,901)。

除了对现有的多肽序列进行修饰或环化外，近年来，将环化方法与生物分子定向进化技术结合正成为研究及应用的新趋势。相较于低通量的合理设计，从已有的结构设计符合需求的多肽，定向进化技术是一种高通量的方法。其利用随机突变和重组构建出极其丰富的文库，再按照特定的需求和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的生物分子，并重复以实现分子水平的模拟进化。目前，定向进化技术已经极大地促进了酶工程、代谢工程以及医药等很多领域的发展(参见J Drug Target,2017,25(3),216，Chem Rev,1997,97(2),391)。Henis等人使用溴代物对噬菌体库进行环化，构建了具有丰富结构的展示环肽的噬菌体库，并基于该库对血清释放激酶进行筛选，得到了具有高亲和性的抑制剂环肽(参见Nat.Chem.Biol.,2009,5(7),502)。除了噬菌体表面展示技术外，定向进化技术还包括以下几类：SICLOPPS、细菌表面展示技术、酵母细胞表面展示技术、mRNA展示技术、哺乳动物细胞表面展示技术等。以上定向进化技术都需要在接近生理条件的环境中进行，这要求环化方法需要有良好的生物相容性。由于反应体系的浓度极低，这进一步要求环化方法必须高效且选择性好。这些要求使得许多化学合成常用的环化方法并不适用于定向进化技术中。

综上，本领域仍需要开发更多的温和、高效的多肽环化方法，特别是能够具有良好生物相容性的环化方法，以进一步发展更多基于多肽的检测和治疗等应用。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中环肽合成复杂的技术问题，提供一种硫烯醚化合物及其合成方法和在多肽环化中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种硫烯醚化合物，结构通式如下：

其中，n为2～5，更优选地n为2，X为氯或溴。

制备所述硫烯醚化合物的合成方法，包括以下步骤：

1)以对氯甲酰基苯甲酸甲酯、间氯甲酰基苯甲酸甲酯或邻氯甲酰基苯甲酸甲酯为原料，在氢化钠作用下与丙二腈缩合，形成烯醇；

2)在氢氧化钠作用下，发生水解反应，得到羧酸中间体；

3)在五氯化磷作用下，发生氯代反应，形成氯代烯烃；

4)在碳酸氢钠作用下，以乙硫醇取代得到硫烯醚化合物；

5)使用碳二亚胺及N-羟基琥珀酰亚胺活化，得到活性酯中间体；

6)活性酯中间体与直链烷烃二胺和卤代乙酰卤反应得到的酰胺缩合，并在碳酸氢钠作用下，以N-乙酰半胱氨酸取代得到目标产物；

合成路线如下：

本发明，所述硫烯醚化合物的合成步骤具体如下：

(1)将氢化钠于四氢呋喃中分散，氮气氛围保护下于0℃冰浴剧烈搅拌。将丙二腈溶于四氢呋喃中，缓慢滴加入以上体系中。反应体系保持0℃冰浴，滴加结束后于冰浴搅拌反应1h。将溶于四氢呋喃的式(1)化合物缓慢滴加入体系中并保持反应体系0℃。在滴加结束后，将反应体系转移到室温，室温下搅拌反应1h。以减压蒸馏除去体系中的四氢呋喃。边搅拌边缓慢地向残余物中加入冰水，加入浓盐酸，调节pH为1～2。以乙酸乙酯进行萃取，有机相经饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到式(2)化合物粗品直接用于后续反应。其中，式(1)选自对氯甲酰基苯甲酸甲酯、间氯甲酰基苯甲酸甲酯或邻氯甲酰基苯甲酸甲酯中的一种；式(1)化合物与丙二腈的摩尔比为1:1；式(1)化合物与氢化钠的摩尔比为1:2。

(2)将上步产物式(2)化合物溶于四氢呋喃中，0℃冰浴下缓慢滴加入溶于水的氢氧化钠，去除冰浴升至室温，搅拌反应2～4h。以减压蒸馏除去体系中的四氢呋喃，加入水，并以乙酸乙酯洗涤。加入盐酸调节pH为1～2，以乙酸乙酯进行萃取，有机相经饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到式(3)化合物粗品，直接用于后续反应。其中，式(2)化合物与氢氧化钠的摩尔比为1:(2～4)；反应体系中四氢呋喃与水的体积比为1:(0.5～2)。

(3)将式(3)化合物溶于乙腈，加入五氯化磷。在氮气氛围中，于50℃搅拌反应2～6h。冷却至室温，减压蒸馏浓缩。残余物溶于二氯甲烷，先后经水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到浅黄色固体。将黄色固体溶于乙腈与水的混合液中，于室温搅拌反应20～60min。之后，依次加入乙硫醇及碳酸氢钠。于室温搅拌反应1～4h，使用盐酸调节pH为4～5，以减压蒸馏除去体系中的乙腈，之后加入饱和食盐水。以乙酸乙酯进行萃取，有机相经饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到式(4)硫烯醚化合物。其中，式(3)化合物与五氯化磷的摩尔比为1:(2～4)；式(3)化合物与乙硫醇及碳酸氢钠的摩尔比为1:(1.2～2.4):(2～6)；乙腈与水的混合液的其组分体积比为1:1。

(4)将式(4)化合物溶于乙腈，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺，于室温搅拌反应1～2h。减压蒸馏浓缩，得到式(5)化合物粗品，直接用于后续反应。其中，式(4)化合物与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1～2):(1～2)。

(5)将直链烷烃二胺的卤化酰胺溶于磷酸缓冲液(pH＝7.0～8.0)，将溶于乙腈的式(5)化合物加入，于室温搅拌反应1～2h。之后，加入N-乙酰-L-半胱氨酸及碳酸氢钠，于室温搅拌反应1～2h。之后，使用盐酸调节pH为4～5，以减压蒸馏除去体系中的乙腈，之后加入饱和食盐水。以乙酸乙酯进行萃取，有机相经饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到式(6)硫烯醚化合物。其中，式(5)化合物与直链烷烃二胺的卤化酰胺的摩尔比为1:(1～2)；反应体系中磷酸缓冲液与乙腈的体积比为1:(0.1～1)；式(5)化合物与N-乙酰-L-半胱氨酸及碳酸氢钠的摩尔比为1:(1～2.5):(1.2～5)。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中的反应时间为2h；式(2)化合物与氢氧化钠的摩尔比为1:2；体系中四氢呋喃与水的体积比为1:1。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中，50℃搅拌反应的反应时间为4h，室温搅拌反应时间为30min，加入乙硫醇及碳酸氢钠后的室温搅拌反应时间为2h；式(3)化合物与五氯化磷的摩尔比为1:3；式(3)化合物与乙硫醇及碳酸氢钠的摩尔比为1:1.2:3。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)中的反应时间为1h；式(4)化合物与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.2:1.2。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(5)中的室温搅拌反应时间均为1h；式(5)化合物与直链烷烃二胺的卤化酰胺的摩尔比为1:1.2；反应体系中磷酸缓冲液与乙腈的体积比为1:1，磷酸缓冲液pH＝7.4；式(5)化合物与N-乙酰-L-半胱氨酸及碳酸氢钠的摩尔比为1:2:3。

本发明中，所述硫烯醚化合物在多肽环化中的应用，所述硫烯醚化合物对含有一个氮端半胱氨酸及一个链内半胱氨酸的多肽进行环化，从而构建环肽；

具体地，将所述多肽、硫烯醚化合物、N-乙酰-L-半胱氨酸及三(2-羧乙基)膦(TCEP)加入至磷酸缓冲液中反应，从而将多肽环化。

所述多肽、硫烯醚化合物、N-乙酰-L-半胱氨酸及三(2-羧乙基)膦的摩尔比为1:(1～10):(1～20):(1～20)；反应温度为20～40℃，反应时间为60～720min；磷酸缓冲液的pH为6.0～9.0。

所述多肽、硫烯醚化合物、N-乙酰-L-半胱氨酸及三(2-羧乙基)膦的摩尔比为1:2:4:4；反应时间为60～120min；磷酸缓冲液的pH为7.4。

所述多肽的氮端为氨基。

所述多肽表示为C(Xaa)aC(Xaa)b，C为半胱氨酸(Cys)，Xaa选自氨基酸甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、苯丙氨酸(Phe，P)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬氨酸(Asp，D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu，E)、赖氨酸(Lys，K)、谷氨酰胺(Gln，Q)、甲硫氨酸(Met，M)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、脯氨酸(Pro，P)、组氨酸(His，H)、精氨酸(Arg，R)；a取自1～30，b取自0～29，且a与b之和为30。

利用基于该硫烯醚化合物的环化方法在磷酸缓冲液中对噬菌体表面展示的多肽进行翻译后修饰，从而构建展示环肽的噬菌体库；

具体地，向磷酸缓冲液(pH＝6.0～9.0)中滴度为10¹³pfu/ml于氮端展示多肽的噬菌体库，加入三(2-羧乙基)膦于20～40℃下孵育15～60min钟，之后加入N-乙酰-L-半胱氨酸及所述硫烯醚化合物，均匀混合后，于20～40℃孵育60～720min，然后加入冰的PEG/NaCl水溶液沉淀噬菌体，并置于冰中120min，最后通过离心得到噬菌体沉淀并以1×磷酸盐缓冲液重悬，得到环化的噬菌体库；其中，TCEP的浓度为0.1～10mmol/L；硫烯醚化合物和N-乙酰-L-半胱氨酸的摩尔比为(1～20):(1～20)，硫烯醚化合物的浓度为0.1～10mmol；上述PEG/NaCl水溶液组成如下：PEG-8000(20％,w/w)及氯化钠(15％,w/w)。

在本发明的一个优选实施方案中，所述构建展示环肽的噬菌体库的步骤中，磷酸缓冲液的pH＝7.4；加入TCEP后的孵育温度为37℃，孵育时间为30min，TCEP的浓度为1mmol/L；硫烯醚化合物和N-乙酰-L-半胱氨酸的摩尔比为1:4，硫烯醚化合物的浓度为1mmol/L；加入硫烯醚化合物后的孵育温度为25℃，孵育时间为120min。

相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：

1、本发明所述硫烯醚化合物可对含有一个氮端半胱氨酸及一个链内半胱氨酸的多肽进行温和、高效地环化，构建环肽，所构建环肽可以用于检测及治疗等应用。此外，利用该硫烯醚化合物可以对展示含有一个氮端半胱氨酸及一个链内半胱氨酸的多肽的噬菌体库进行温和、高效地环化，构建环化的噬菌体库，利用环化多肽库可以针对不同的目标蛋白筛选用于检测及治疗等应用的多肽。通过本发明，可更好地合成和开发新的具有应用价值的环肽。

2、本发明的环化方法操作简便，具有良好的生物相容性，可以在体内及体外环境进行环化，所用原料绿色、经济，不涉及金属催化剂，对环境友好，符合绿色化学的理念。

附图说明

图1为环化分子环化多肽及噬菌体库示意图；

图2为噬菌体库环化效率测试流程图；

图3为噬菌体库环化效率比较图；

图4为噬菌体库对Mdm2筛选结果的序列比对图；

图5为噬菌体库对Mdm2筛选结果的ELISA测试图。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。

实施例1

所述硫烯醚化合物的合成包括以下步骤：

步骤1、化合物methyl 4-(2,2-dicyano-1-hydroxyvinyl)benzoate的合成

具体步骤如下：

(1)将氢化钠(1.8g,75.0mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水四氢呋喃(30mL)分散，氮气氛围保护下于0℃冰浴剧烈搅拌。将丙二腈(2.5g,37.5mmol)溶于无水四氢呋喃(30mL)中，缓慢滴加入以上体系中。反应体系保持0℃冰浴，滴加结束后于冰浴搅拌反应1h。

(2)将4-氯甲酰基苯甲酸甲酯(7.5g,37.5mmol)溶于无水四氢呋喃中(30mL)。保持0℃冰浴的同时，将该溶液缓慢滴加入体系中。在滴加结束后，将反应体系转移到室温，让其缓慢升温至室温，室温下搅拌反应1h。

(3)以减压蒸馏除去体系中的四氢呋喃。边搅拌边缓慢地向残余物中加入冰水，待残余物分散后，加入浓盐酸，调节pH为1至2。加入乙酸乙酯(3×100mL)进行萃取，合并有机相后使用饱和食盐水(3×50mL)进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到浅黄色固体(6.9g)，收率为81％。

1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.98–7.91(m,2H),7.69–7.64(m,2H),3.87(s,3H).

13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ186.90,166.34,145.21,130.67,129.14,127.81,122.76,121.28,52.68,47.91.

ESI-MS(m/z):calculated for C12H8N2O3[M-H]-:229.1；found,228.6.

步骤2、化合物4-(2,2-dicyano-1-hydroxyvinyl)benzoic acid的合成

将步骤1反应所得化合物(0.5g,2.2mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，冰浴下缓慢滴加入溶于水(10mL)的氢氧化钠(0.18g,4.4mmol)，去除冰浴升至室温，搅拌反应4h。以减压蒸馏除去体系中的四氢呋喃，加入水(20mL)，并以乙酸乙酯(3×10mL)洗涤。加入盐酸(1mol/L)调节pH为1至2，加入乙酸乙酯(3×20mL)进行萃取，合并有机相后使用饱和食盐水(20mL)进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到浅黄色固体(395.4mg)，收率为84％。

1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.04(br s,1H),7.92(d,J＝8.3Hz,2H),7.63(d,J＝8.4Hz,2H).

13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ187.10,167.37,144.83,131.89,129.24,127.63,122.83,121.34,47.84.

ESI-MS(m/z):calculated for C11H6N2O3[M-H]-:213.0；found,213.1.

步骤3、化合物4-(2,2-dicyano-1-(ethylthio)vinyl)benzoic acid的合成

具体包括以下步骤：

(1)将步骤2反应所得化合物(0.21g,1.0mmol)溶于乙腈(30mL)，加入五氯化磷(0.6g,3.0mmol)。在氮气氛围中，于50℃搅拌反应6h。冷却至室温，减压蒸馏浓缩。残余物溶于二氯甲烷(60mL)，先后以水(3×20mL)及饱和食盐水(20mL)进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到浅黄色固体粉末。

(2)将步骤(1)得到的浅黄色固体粉末溶于乙腈与水的混合液中(乙腈:水＝1:1,10mL)，于室温搅拌30min。之后，依次加入乙硫醇(86μL,1.2mmol)及碳酸氢钠(0.26g,3.0mmol)。于室温搅拌反应2h，使用盐酸(1mol/L)调节pH为4至5，以减压蒸馏除去体系中的乙腈，之后加入饱和食盐水(15mL)。加入乙酸乙酯(3×20mL)进行萃取，合并有机相后使用饱和食盐水(20mL)进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到粗产品。经过高效液相色谱分析，纯度大于90％。粗产品经柱层析(硅胶,甲醇:二氯甲烷＝1:10)纯化得到黄色固体粉末(118.1mg)，收率为45％。

1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.54–13.33(br s,1H),8.13(d,J＝8.5Hz,2H),7.69(d,J＝8.5Hz,2H),2.74(q,J＝7.4Hz,2H),1.05(t,J＝7.4Hz,3H).

13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ182.19,167.01,136.58,134.59,130.44,129.08,113.26,112.94,79.25,29.17,14.83.

ESI-MS(m/z):calculated for C13H10N2O2S[M-H]-:257.0；found,256.8.

步骤4、化合物(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-(2,2-dicyano-1-(ethylthio)vinyl)benzoate)的合成

将步骤3得到的化合物(65.0mg,0.25mmol)溶于乙腈(2mL)，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺(34.5mg,0.3mmol)及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(58.0mg,0.3mmol)。室温下搅拌反应1h，高效液相色谱跟踪原料消耗完毕后，减压蒸馏浓缩得到淡黄色固体粉末粗产物。

1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.31(d,J＝8.4Hz,2H),7.85(d,J＝8.4Hz,2H),2.92(s,4H),2.75(q,J＝7.4Hz,2H),1.07(t,J＝7.4Hz,3H).

13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ181.23,170.63,161.50,139.27,131.30,129.95,127.48,113.09,112.77,79.88,29.20,26.05,14.86.

ESI-MS(m/z):calculated for C17H13N3O4S[M+H]+:356.1；found,355.4.

步骤5、直链烷烃二胺的卤化酰胺的合成

具体包括以下步骤：

(1)将tert-butyl(2-(2-chloroacetamido)ethyl)carbamate(0.64g,4.0mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，加入三乙胺(1.7mL,12.0mmol)，于冰浴冷却至0℃。冰浴下缓慢滴入溶于二氯甲烷(10mL)的氯乙酰氯(380μL,2.4mmol)。缓慢升至室温，室温下搅拌反应6h。加入二氯甲烷(20mL)稀释，之后依次使用水(2×20mL)、饱和碳酸氢钠溶液(2×20mL)及饱和食盐水(20mL)进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩，得到白色固体粉末(0.82g)，收率87％。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ4.95(s,1H),4.05(s,2H),3.46–3.41(m,2H),3.37–3.25(m,2H),1.46(s,9H).

¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ166.76,156.77,79.90,42.49,41.20,39.77,28.34.

ESI-MS(m/z):calculated for C₉H₁₇ClN₂O₃[M+H]⁺:237.1；found,236.9.

(2)将步骤(1)的产物(0.82g,3.5mmol)溶于少量乙酸乙酯(5mL)，加入氯化氢乙酸乙酯溶液(4mol/L,10mL,40mmol)，室温搅拌反应1h。以减压蒸馏浓缩，反复加入乙酸乙酯(3×5mL)并浓缩，以共沸除去体系中的氯化氢。向残余物加入***(10mL)并超声，得到棕灰白色沉淀。使用离心沉降沉淀，并去除***。将沉淀重新分散于***中，并反复分散及离心3次以洗涤沉淀。经过真空干燥后，得到棕灰色固体(0.57g)，收率96％。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ8.61(br s,1H),8.13(br s,2H),4.11(s,2H),3.36(q,J＝6.1Hz,2H),2.88(h,J＝5.8Hz,2H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ167.03,43.15,38.68,37.22.

ESI-MS(m/z):calculated for C₄H₉ClN₂O[M+H]⁺:137.0；found,137.0.

步骤6、本发明环化反应硫烯醚化合物的合成

首先将步骤5得到的化合物直链烷烃二胺的卤化酰胺(24.0mg,0.14mmol)溶于磷酸缓冲液(pH＝7.4,100mmol/L,4mL)中，然后将溶于乙腈(4mL)的2,5-dioxopyrrolidin-1-yl-4-(2,2–dicyano-1-(ethylthio)vinyl)benzoate(40.0mg,0.12mmol)加入体系，于室温搅拌1h。高效液相色谱跟踪原料消耗完毕后，向体系依次加入N-乙酰-L-半胱氨酸(36.9mg,0.22mmol)及碳酸氢钠(28.0g,0.33mmol)。于室温搅拌1h。高效液相色谱跟踪原料消耗完毕后，加入盐酸(1mol/L)调节pH至酸性，以减压蒸馏除去体系中的乙腈，加入饱和食盐水(10mL)稀释。加入乙酸乙酯(3×10mL)进行萃取，合并有机相后使用饱和食盐水(10mL)进行洗涤，经无水硫酸钠干燥后进行浓缩，残余物使用半制备型高效液相色谱纯化，得到黄色固体粉末。

ESI-MS(m/z):calculated for C₂₀H₂₀ClN₅O₅S[M+H]⁺:478.1；found,478.1.

如图1所示，将合成的硫烯醚化合物对多肽进行环化、或结合翻译后修饰的噬菌体库进行多肽展示及筛选可以得到或发现新的用于检测及治疗等应用的功能环肽。

实施例2

多肽的环化

将环化反应分子母液(500μmol/L,20μL)、多肽母液(500μmol/L,10μL)、N-乙酰-L-半胱氨酸(5mmol/L,4μL)与TCEP(5mmol/L,4μL)加入至磷酸缓冲液(pH＝7.4,200mmol/L,50μL)中，并补充水(12μL)。最终体系中各组分浓度为：硫烯醚(100μmol/L)、多肽(50μmol/L)、TCEP(200μmol/L)、N-乙酰-L-半胱氨酸(200μmol/L)及磷酸缓冲液(pH＝7.4,100mmol/L)。将体系置于室温下反应90min。使用高效液相色谱监测反应情况。反应结束后，使用紫外可见吸收光谱及质谱表征反应产物。根据高效液相色谱定量，如表1为环化反应的表征数据，多肽的转化率为100％。

表1

实施例3

多肽环化的选择性测试

将环化反应分子母液(500μmol/L,20μL)、多肽H-CGGGKGW-NH₂母液(500μmol/L,10μL)、N-乙酰-L-半胱氨酸(5mmol/L,4μL)与TCEP(5mmol/L,4μL)加入至磷酸缓冲液(pH＝7.4,200mmol/L,50μL)中，并补充水(12μL)。最终体系中各组分浓度为：硫烯醚(100μmol/L)、多肽(50μmol/L)、TCEP(200μmol/L)、N-乙酰-L-半胱氨酸(200μmol/L)及磷酸缓冲液(pH＝7.4,100mmol/L)。将体系置于室温下反应90min。使用高效液相色谱监测反应情况。反应结束后，使用紫外可见吸收光谱及质谱表征反应产物。根据表征结果，多肽氮端的半胱氨酸与环化分子发生了反应，多肽发生了100％的转化，但是环化分子的氯没有进一步与多肽内的其他基团发生反应并导致多肽环化。以上结果说明，环化分子的反应具有选择性。

实施例4

1、生物素标记靶蛋白

称取0.2mg生物素标记分子Sulfo-NHS-LC-Biotin，以50μL 10mmol/L磷酸盐缓冲液溶解。将Mdm2蛋白以10mmol/L磷酸盐缓冲液稀释至10μmol/L，之后将靶蛋白溶液与生物素溶液混合(1:5,v/v)，室温反应30min。使用蛋白纯化系统纯化标记后的蛋白，并定量备用。

2、噬菌体库的构建

使用噬菌粒(pCantab 5E)-辅助噬菌体(M13KO7)展示系统。合成C(X)₉C序列基因片段，其中X为随机氨基酸，利用NNK方式编码(N为脱氧核苷酸A、G、T或C，K为脱氧核苷酸G或C)。将DNA基因片段和pCantab 5E用SfiI/NotI双酶切后，将DNA文库和噬菌粒载体pCantab5E连接，并对文库***片段进行质量分析，最后将重组噬菌粒通过电转化的方式导入宿主菌TG1中，并进行库容量计算。

3、制备对数生长期大肠杆菌TG1

将储备的TG1甘油菌菌种从冰箱中取出，常温融化。取出经过37℃培养箱干燥的固体培养基平板，并用接种环蘸取少量菌种划线至培养基平板表面。正置至液体完全被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱，过夜培养。挑取单克隆菌落，并置于2YT液体培养基(20mL)中。将培养基放置于37℃摇床中，过夜培养。取培养液(20μL)稀释至2YT液体培养基(20mL)中，将培养基放置于37℃摇床中，培养至菌液OD600为0.3至0.5。

4、制备噬菌体库及纯化

取适量保存的噬菌体甘油菌储备库至2YT液体培养基(1.2L)中，使菌液的OD600约为0.1，将培养基放置于37℃摇床中，培养至菌液OD600为0.3至0.5。通过下式计算细菌数目：

TG1细菌个数(Colony-forming Units,cfu)＝OD600×109×V_{培养物(mL)}

将数目(Plaque-forming Units,pfu)为细菌数目(cfu)约20倍的辅助噬菌体M13KO7及氨苄青霉素加入到培养基中。体系中氨苄青霉素的终浓度为100μg/mL。将培养基放于37℃培养箱中培养30min，再放置于37℃摇床中，以转速(220rpm)培养30min，以使辅助噬菌体感染细菌。使用冷冻离心机，于4℃下以6000g离心菌液10min，之后将上清液去除保留沉淀。将沉淀分散于2YT-AK液体培养基(1.2L)，并放置于30℃摇床中，过夜培养。使用冷冻离心机，于4℃下以6000g离心菌液10min，取上清液至一个无菌烧杯中，并加入PEG/NaCl溶液(培养物:PEG/NaCl溶液＝5:1,v/v)混匀，之后冰浴2h。使用冷冻离心机，于4℃下以9000g离心10min，之后将上清液去除保留沉淀。加入磷酸盐缓冲生理盐水(10mmol/L,30mL)使沉淀重新分散。使用冷冻离心机，于4℃下以6000g离心10min，将上清液转移至一个无菌离心管中，在其中加入PEG/NaCl溶液(培养物:PEG/NaCl溶液＝5:1,v/v)混匀，之后冰浴2h。使用冷冻离心机，于4℃下以9000g离心10min以沉淀噬菌体，用磷酸盐缓冲生理盐水(10mmol/L,2mL)使噬菌体沉淀重新分散。使用针式过滤器，以0.22μm的无菌滤膜过滤，之后分装备用。

5、噬菌体滴度测定

将待测定的噬菌体母液(20μL)加入至装有2YT液体培养基(180μL)的1.5mL离心管中混匀，以此为噬菌体10^-1梯度。再取10^-1梯度的液体(20μL)稀释至另一管2YT液体培养基(180μL)中，此为噬菌体10^-2梯度。基于以上稀释操作依次将噬菌体稀释不同的梯度。

分别取各个梯度的噬菌体(20μL)稀释液至对数生长期的TG1菌液(180μL)中并混匀，放于37℃培养箱中静置培养30min。取各个梯度混合培养物(10μL)均匀铺开在2YT-Amp平板培养基表面。正置至液体完全被吸收后，倒置于37℃培养箱中培养过夜。通过下式计算噬菌体母液的滴度，其中N为10^-s梯度稀释液取10μL长出的菌落个数：

母液的滴度＝N×20×100×10^S(pfu/mL)

实施例5

环化分子对噬菌体库的修饰效率测试

实验设置对照组(含非氮端半胱氨酸的16肽噬菌体库、N-乙酰-L-半胱氨酸及TCEP，图3中16AA without ADT-biotin)、对照组(含非氮端半胱氨酸的16肽噬菌体库、N-乙酰-L-半胱氨酸及生物素化分子，图3中16AA without TCEP)、对照组(含非氮端半胱氨酸的16肽噬菌体库、TCEP、N-乙酰-L-半胱氨酸及生物素化分子，图3中16AA experiment)、对照组(C(X)₉C噬菌体库、TCEP及N-乙酰-L-半胱氨酸，图3中C9C without ADT-biotin)、对照组(C(X)₉C噬菌体库、N-乙酰-L-半胱氨酸及生物素化分子，图3中C9C without TCEP)、对照组(环化后的C(X)₉C噬菌体库、TCEP、N-乙酰-L-半胱氨酸及生物素化分子，图3中C9C-ADTtreat with ADT-Biotin)、实验组(C(X)₉C噬菌体库、TCEP、N-乙酰-L-半胱氨酸及生物素化分子，图3中C9C experiment)。

以下步骤为实验组的过程，其他对照组在此基础上，根据前述条件进行适当修改。

图2为噬菌体库环化效率测试流程图，具体步骤如下：

1、取适量保存的噬菌体库，加入磷酸盐缓冲生理盐水(10mmol/L)并加入TCEP(终浓度1mmol/L)，之后放置于37℃摇床中，以转速(220rpm)反应30min。加入N-乙酰-L-半胱氨酸(终浓度2mmol/L)和生物素化分子(终浓度1mmol/L)并放置于室温25℃反应30min。之后加入PEG/NaCl溶液(培养物:PEG/NaCl溶液＝5:1,v/v)混匀并冰浴2h。使用冷冻离心机，于4℃下以9000g离心10min，之后将上清液去除保留沉淀。加入磷酸盐缓冲生理盐水(10mmol/L,30mL)使沉淀重新分散，得到噬菌体重悬液。

2、噬菌体重悬液用2YT培养基进行一系列梯度(10^-10)稀释，在最后一个稀释度里同时取出两份的噬菌体稀释液(10μL)至低吸附管里。其中一管作为捕捉前噬菌体，另一管作为捕捉后噬菌体。取链霉亲和素磁珠(20μL)，以结合缓冲液(Binding buffer,10mmol/LTris-Cl,150mmol/L NaCl,10mmol/L MgCl₂,1mmol/L CaCl₂,pH 7.4)洗涤两次，用结合缓冲液(50μL)重新分散磁珠，再加入封闭缓冲液(Blocking buffer,50μL)，充分混匀。同时取出来的捕捉后噬菌体(10μL)加入结合缓冲液(40μL,结合缓冲液加入0.3％v/v Tween-20and3％w/v BSA)及封闭缓冲液(50μL)在室温下同时封闭1h。将封闭好的噬菌体加入封闭好的磁珠中，室温下孵育15min，然后将低吸附管置于磁力架上，取上清液。磁珠用洗涤缓冲液(Washing buffer,结合缓冲液加入0.1％v/v Tween-20,100μL)洗涤，置于磁力架上，取上清液，并合并得到磁珠捕捉之后的噬菌体(200μL)，将之前取出的捕捉前噬菌体(10μL)也稀释至体积为200μL。

3、分别取捕捉前和捕捉后的噬菌体液(10μL)加到处于对数生长期的大肠杆菌TG1(90μL)培养液中，于37℃培养箱中静置培养30min。孵育完毕后分别从中取出培养物(10μL)均匀铺开在2YT-Amp平板培养基表面。正置至液体完全被吸收后，倒置于37℃培养箱中培养过夜。分别计数平板上捕捉前单克隆菌落个数(N_before)和捕捉后单克隆菌落个数(N_after)，并以下式计算捕捉效率：

修饰效率＝(N_before-N_after)/N_before×100％

通过测试以上对照实验，如图3所示，表明环化反应分子对噬菌体具有良好修饰效果，可以针对噬菌体展示的多肽的氮端进行特异性地修饰，从而进一步达到环化多肽的目的。这也进一步反映，本方法比较温和，具有较好的生物体系相容性，可以用于其他的生物体系。

实施例6

噬菌体展示多肽的环化

使用前述方法制备及纯化的噬菌体库，向408.5μL滴度为10¹³pfu/ml的该噬菌体库中加入21.5μL TCEP(20mmol/L)。将离心管置于摇床中于37℃孵育30min。之后，将20μL N-乙酰-L-半胱氨酸(50mmol/L)及50μL(10mmol/L)环化反应分子加入至还原后的噬菌体库中。均匀混合后，将离心管置于摇床中于25℃孵育120min。之后，加入100μL冰的PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体，并置于冰中120min。通过离心得到噬菌体沉淀并以1×磷酸盐缓冲液重悬。将重悬的噬菌体稀释，并以前述方法测定滴度。最后，环化的噬菌体库溶液置于4℃冰箱中保存，以备筛选使用。

实施例7

对Mdm2蛋白进行筛选

取100μL的链酶亲和素包被磁珠至离心管中，以结合缓冲液洗涤3次，之后置于磁力架上1min，吸去上清。并用100μL结合缓冲液重悬磁珠，平分至两个离心管中。在其中一管中加入生物素标记的靶蛋白(2～10μg；第一轮筛选10μg，第二轮筛选5μg，第三轮筛选2μg)，此记为实验组。将离心管置于摇床上，室温孵育15min，之后置于磁力架上1min，吸去上清。并分别以结合缓冲液洗涤3次。在两管中分别加入300μL结合缓冲液及150μL封闭缓冲液。将离心管置于摇床上，室温孵育120min。同时在带筛选的噬菌体库中加入3mL结合缓冲液及1.5mL封闭缓冲液，将离心管置于摇床上，室温孵育120min。将噬菌体库平分，并分别加入有磁珠的离心管，将离心管置于摇床上，室温孵育30min。置于磁力架上1min，吸去上清。之后分别用洗涤缓冲液洗涤9次，最后用结合缓冲液洗涤2次。分别加入200μL淋洗缓冲液(Elution Buffer,50mmol/L glycine,pH 2.2)重悬磁珠，室温孵育5min，之后将上清转移到40μL中和缓冲液(Neutralization Buffer,1mol/L Tris-Cl,pH 8.0)中。将淋洗下的噬菌体稀释，以前述方法测定滴度、扩增及纯化。对于环化的噬菌体实验组，每轮筛选前进行使用环化分子进行展示多肽的环化。

表2

表2为筛选过程的富集度变化，随着筛选轮数的增加，环化实验组及二硫键实验组的噬菌体回收率都有了明显增长，表明筛选成功。挑选噬菌体单克隆抗体测序，并将测序结果翻译为氨基酸序列得到不同噬菌体单克隆上展示的多肽序列。图4为序列比对图，筛选的多肽都具有保守序列“F-W”，这与天然配体p53中的保守序列一致。图5为ELISA实验结果，实验中对比了所筛选出的多肽于线性、二硫键环化(Disulfide cyclized)、本发明方法(ADT-Cl1cyclized)环化状态时与目标蛋白的结合情况，从图中可见，通过本发明环化的多肽与目标蛋白都具有良好的亲和力，且相比二硫键的结果更好，说明环化为发现新的配体及药物提供了可能。

本发明基于硫烯醚化合物可对多肽和噬菌体库进行环化。实施例2中，对含有一个氮端半胱氨酸及一个链内半胱氨酸的线性多肽进行环化，可得到环化多肽。在实施例3中对环化方法的选择进行测试，该实施例说明本发明的环化方法，仅针对一个氮端半胱氨酸及一个链内半胱氨酸的多肽，不受其他高反应性的残基基团影响。在实施例4～7中，使用本发明的方法对噬菌体库进行翻译后修饰，得到了展示环化多肽的环化噬菌体库；使用该噬菌体库对Mdm2蛋白进行筛选，可以得到新的具有良好结合能力的环化多肽。综上，本发明为通过合成方法或生物定向进化方法(如噬菌体表面展示筛选技术)发现新的功能多肽提供了方法。