阅读说明：本技术 一种基于二氧化铈和纳米银双增强苝四羧酸发光的电化学发光传感器的构建方法 (Construction method of electrochemical luminescence sensor based on cerium dioxide and nano-silver dual-enhanced perylene tetracarboxylic acid luminescence ) 是由 宋先震 魏琴 刘蕾 刘雪静 王雪莹 罗川南 任祥 于 2019-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种基于二氧化铈和纳米银双增强苝四羧酸发光的电化学发光传感器的构建方法。在本发明中,作为发光体的苝四羧酸PTCA直接负载在碳纳米管MWCNTs表面,形成PTCA@MWCNTs纳米复合材料。二氧化铈CeO<Sub>2</Sub>和纳米银AgNPs用作苝四羧酸-过硫酸钾PTCA-K<Sub>2</Sub>S<Sub>2</Sub>O<Sub>8</Sub>体系中新型共反应促进剂催化共反应剂K<Sub>2</Sub>S<Sub>2</Sub>O<Sub>8</Sub>产生更多的硫酸根自由基SO<Sub>4</Sub><Sup>·-</Sup>,极大增强了PTCA的发光强度。不同浓度的降钙素原PCT可结合不同量的二抗标记物金杂化的苝四羧酸-碳纳米管Ab<Sub>2</Sub>-Au-PTCA@MWCNTs,从而引起传感器发光强度变化,实现对PCT的检测。本发明对PCT检测的线性范围为50 fg/mL-100 ng/mL,检测限为16 fg/mL。(The invention discloses a construction method of an electrochemical luminescence sensor based on cerium dioxide and nano-silver dual-enhanced perylene tetracarboxylic acid luminescence. In the invention, the PTCA serving as a luminous body is directly loaded on the surface of the MWCNTs of the carbon nano tube to form the PTCA @ MWCNTs nano composite material. Cerium oxide CeO 2 And nano silver AgNPs as perylene tetracarboxylic acid-potassium persulfate PTCA-K 2 S 2 O 8 Novel co-reaction promoter in system for catalyzing co-reaction agent K 2 S 2 O 8 Produce more sulfate radical SO 4 •‑ The luminous intensity of PTCA is greatly enhanced. Procalcitonin PCT with different concentrations can be combined with different amounts of secondary antibody marker gold-hybridized perylene tetracarboxylic acid-carbon nanotube Ab 2 Au-PTCA @ MWCNTs, thereby causing a change in the sensor's luminescence intensity, enabling detection of PCT. Line for PCT detection of the inventionThe sex range is 50 fg/mL-100 ng/mL, and the detection limit is 16 fg/mL.)

一种基于二氧化铈和纳米银双增强苝四羧酸发光的电化学发 光传感器的构建方法

技术领域

本发明设计的一种基于二氧化铈和纳米银双增强苝四羧酸发光的电化学发光传感器的构建方法，具体是以PTCA为发光材料，[email protected]₂为共反应促进剂，制备一种检测PCT的双增强型电化学发光传感器，属于电化学发光检测技术领域。

背景技术

败血症是一种由细菌、真菌等感染引起的全身炎症反应，被看作全球性的威胁生命健康的疾病。研究表明，PCT反映了全身炎症反应的活跃程度，已被探索作为败血症可靠的预后和治疗指标。因此，开发一种新颖灵敏的免疫测定方法用于快速检测PCT是非常有意义的。

近年来，电化学发光ECL作为一种高灵敏度和高选择性的分析方法引起人们极大的研究兴趣。电化学发光是指通过电化学方法产生电生物质，然后这些电生物质之间或电生物质与其它物质之间反应产生的一种发光现象，它是化学发光方法与电化学方法相结合的产物。电化学发光分析具有灵敏度高，线性范围宽；分析速度快，应用范围广；有利于研究快速发光反应和发光反应机理等优势，已经发展为分析化学的一门分支学科。

PTCA作为一种新兴的电化学发光试剂，由于其稳定的发光信号，正受到越来越多的关注。然而，PTCA自身不能产生足够强的ECL信号以满足痕量分析的需求，因此开发新型的共反应促进剂催化共反应剂以增强PTCA的ECL信号就尤为重要。CeO₂作为稀土元素的氧化物，因其在氧化还原反应中独特的性能而受到广泛关注，且其中的Ce³⁺/Ce⁴⁺氧化还原对可以快速可逆的转换，具有很高的催化活性和电子转移率。AgNPs具有良好的导电性，其可催化共反应剂K₂S₂O₈生成更多的SO₄ ^•-。本发明采用PTCA为发光体以获得稳定的发光信号，采用CeO₂和AgNPs为共反应促进剂来催化共反应剂，从而增强发光信号以满足痕量分析的需求，实现了二氧化铈和纳米银双增强苝四羧酸发光的电化学发光传感器的构建。

发明内容

本发明目的之一是合成信号稳定的发光材料和催化性能好的共反应促进剂。

本发明目的之二是构建基于CeO₂和AgNPs双增强苝四羧酸发光的电化学发光传感器。

本发明目的之三是通过构建的电化学发光传感器实现对PCT的高灵敏检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1. 使用抛光粉预处理直径为4 mm的玻碳电极得到镜状表面，超纯水冲洗干净；将处理好的电极浸入质量分数为1 %的HAuCl₄溶液中，以-0.2 V的恒定电压电沉积一层AuNPs，沉积时间为30 s；将8 μL 1-5 mg/mL的[email protected]₂溶液滴涂于电极表面，室温保存至干燥；将5 μL 1 mg/mL的Ab₁溶液滴涂于电极表面，4 ^oC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴涂于电极表面，以封闭Ab₁上非特异性活性位点，4 ^oC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；将6 μL不同浓度的PCT滴涂于电极表面，4 ^oC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；将8 µL 3-7 mg/mL的Ab₂[email protected]溶液滴涂于电极表面，4 ^oC冰箱保存至干燥，超纯水清洗，实现了二氧化铈和纳米银双增强苝四羧酸发光的电化学发光传感器的构建；本发明利用发光体PTCA稳定的发光信号和共反应促进剂CeO₂和AgNPs优异的催化性能制备了一种基于二氧化铈和纳米银双增强苝四羧酸发光的电化学发光传感器；在传感器制备过程中首先电沉积一层AuNPs，既可以增强发光效率，又可以更好的吸附[email protected]₂和Ab₁；将发光体PTCA作为二抗标记物合成Ab₂-Au-PT[email protected]，既可以负载更多发光体以增强发光信号，又能使传感器对PCT浓度变化反应更加灵敏，从而实现对PCT的高灵敏检测。

2. 将20 mL 10 mmol/L的柠檬酸钠溶液与85 mL 0.1 mol/L的尿素溶液混合，随后加入0.5 g CeCl₃和0.5 mL体积分数30 %的H₂O₂，搅拌1 h使其充分溶解，然后将溶解好的溶液加入聚四氟乙烯反应釜中，180 ^oC反应20 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，60 ^oC干燥，实现了CeO₂纳米材料的制备；本发明制备了CeO₂纳米材料作为共反应促进剂，其特有的Ce³⁺/Ce⁴⁺氧化还原对可快速进行可逆转换，具有很高的催化活性，可催化S₂O₈ ^2-产生更多的SO₄ ^•-，从而增强了构建传感器的发光强度；

将Na₂S、PVP、AgNO₃分别溶于乙二醇中，得到3 mmol/L的Na₂S溶液、20 mg/mL的PVP溶液、282 mmol/L的AgNO₃溶液；将30 mL乙二醇倒入圆底烧瓶中，150 ^oC下加热1 h，然后依次加入配制的Na₂S、PVP和AgNO₃溶液；逐滴滴加柠檬酸钠溶液至溶液颜色变为棕色，然后用冰水浴进行冷却反应；将溶液在4 ^oC下离心，乙醇和水交替洗涤，实现了AgNPs的制备；最后将制备的AgNPs分散到超纯水中，得到4 mg/mL的AgNPs 分散体；所述柠檬酸钠溶液以乙二醇为溶剂，柠檬酸钠溶液既能作为稳定剂防止AgNPs聚沉，其氧化物又可与AgNPs螯合使其带负电；本发明制备了AgNPs作为共反应促进剂，其AgNPs具有良好的导电性，其可催化共反应剂K₂S₂O₈生成更多的SO₄ ^•-，从而增强了构建传感器的发光强度；

将10 mg PTCDA溶于10 mL 1 mol/L的NaOH溶液中，加热至PTCDA完全溶解且溶液颜色变为黄绿色，然后逐滴滴加1 mol/L的盐酸HCl至溶液颜色由黄绿色变为红色，将所得溶液离心洗涤至PH为7.4，实现了PTCA纳米材料的制备；本发明制备了PTCA作为发光体，其发光信号稳定，特有结构既可以减少生物毒物，又可以增加疏水性，从而用作发光体增强了构建传感器的稳定性。

3. 将1 mL质量分数为1 %的PDDA溶液加入到2 mL制备的CeO₂溶液中，超声30 min使其充分混合，离心洗涤得到PDDA修饰的CeO₂沉淀；将离心所得沉淀溶于超纯水中，加入0.3 mL制备的AgNPs分散体，搅拌3 h得到[email protected]₂溶液；将[email protected]₂溶液离心洗涤，然后将离心所得沉淀再分散于超纯水中，实现了[email protected]₂溶液的制备，并在4 ^oC下保存备用；所述PDDA为阳离子聚合物电解质材料，其可与CeO₂结合使其带正电，故带正电荷的CeO₂可与带负电荷的AgNPs产生静电吸附得到[email protected]₂纳米复合材料；本发明将两个共反应促进剂复合在一起，[email protected]₂对发光体的发光信号增强效果更好，极从而大增强了构建传感器的发光强度。

4. 将0.05 g MWCNTs分散在50 mL超纯水中，超声1 h使其充分溶解，加入制备的PTCA纳米材料，继续超声2 h使PTCA和MWCNTs充分混合，得到[email protected]纳米复合材料；将50 mg制备的[email protected]纳米复合材料溶解在超纯水中，超声1 h使其充分溶解，随后将1mL质量分数为2 %的HAuCl₄和10 mg PVP加入到上述溶液中，搅拌6 h后加入4 mL 50 mmol/L的柠檬酸钠溶液和少量NaBH₄，继续搅拌6 h，最后磁性分离去除未结合的AuNPs，得到[email protected]纳米复合材料；将[email protected]分散在5 mL PH为7.4的PBS中，加入500μL 500 μg/mL的Ab₂，并在4 ^oC恒温震荡箱中培育12 h，然后加入100 μL质量分数为1 %的BSA以封闭非特异性活性位点，实现了Ab₂[email protected]溶液的制备，并在4 ^oC下保存备用；所述PBS，用1/15 mol/L的Na₂HPO₄和1/15 mol/L的KH₂PO₄配制；本发明制备了Ab₂[email protected]作为二抗标记物，MWCNTs具有大的比表面积和良好的导电性，可以负载更多的发光体，显著提高构建传感器的稳定性和发光效率。

5. 将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、构建传感器作为工作电极构建三电极体系，将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为-1.4-0V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用10-100 mmol/L的K₂S₂O₈溶液作为底液，利用三电极体系检测在不同浓度PCT下产生的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线；所述K₂S₂O₈溶液，pH为6.0-8.5，用10-100 mmol/L的K₂S₂O₈和100 mmol/L的KCl溶于PBS配制。

6. 在稀释的血清样品中加入不同浓度的PCT，采用标准加入法测定血清样品中PCT的相对标准偏差和平均回收率。由表1可以看出，血清样品中PCT的相对标准偏差为1.05-1.14 %，回收率为99.6-101 %，表明本发明可应用于实际生物样品的检测，且结果准确可靠。

本发明的有益成果

1. 本发明合成了[email protected]纳米复合材料，提高了传感器的灵敏度和发光效率；合成了催化性能优异的CeO₂和AgNPs，其作为新型的共反应促进剂与K₂S₂O₈反应产生更多的SO₄ ^•-，从而显著增强了PTCA的发光强度，满足了痕量分析的需求。

2. 本发明成功构建了一种基于二氧化铈和纳米银双增强苝四羧酸发光的电化学发光传感器。

3. 本发明通过构建的电化学发光传感器实现了对PCT的高灵敏检测，检测结果具有优异的重现性和稳定性，检测的线性范围为50 fg/mL-100 ng/mL，检测限为16 fg/mL。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，本发明保护范围不仅局限于实施例，该领域专业人员对本发明技术方案所作的改变均属于本发明保护范围。

实施例1

使用抛光粉预处理直径为4 mm的玻碳电极得到镜状表面，超纯水冲洗干净；将处理好的电极浸入质量分数为1 %的HAuCl₄溶液中，以-0.2 V的恒定电压电沉积一层AuNPs，沉积时间为30 s；将8 μL 1 mg/mL的[email protected]₂溶液滴涂于电极表面，室温保存至干燥；将5 μL1 mg/mL的Ab₁溶液滴涂于电极表面，4 ^oC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴涂于电极表面，以封闭Ab₁上非特异性活性位点，4 ^oC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；将6 μL不同浓度的PCT滴涂于电极表面，4 ^oC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；将8µL 3 mg/mL的Ab₂[email protected]溶液滴涂于电极表面，4 ^oC冰箱保存至干燥，超纯水清洗，实现了二氧化铈和纳米银双增强苝四羧酸发光的电化学发光传感器的构建。

实施例2

使用抛光粉预处理直径为4 mm的玻碳电极得到镜状表面，超纯水冲洗干净；将处理好的电极浸入质量分数为1 %的HAuCl₄溶液中，以-0.2 V的恒定电压电沉积一层AuNPs，沉积时间为30 s；将8 μL 3 mg/mL的[email protected]₂溶液滴涂于电极表面，室温保存至干燥；将5 μL1 mg/mL的Ab₁溶液滴涂于电极表面，4 ^oC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴涂于电极表面，以封闭Ab₁上非特异性活性位点，4 ^oC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；将6 μL不同浓度的PCT滴涂于电极表面，4 ^oC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；将8µL 5 mg/mL的Ab₂[email protected]溶液滴涂于电极表面，4 ^oC冰箱保存至干燥，超纯水清洗，实现了二氧化铈和纳米银双增强苝四羧酸发光的电化学发光传感器的构建。

实施例3

使用抛光粉预处理直径为4 mm的玻碳电极得到镜状表面，超纯水冲洗干净；将处理好的电极浸入质量分数为1 %的HAuCl₄溶液中，以-0.2 V的恒定电压电沉积一层AuNPs，沉积时间为30 s；将8 μL 5 mg/mL的[email protected]₂溶液滴涂于电极表面，室温保存至干燥；将5 μL1 mg/mL的Ab₁溶液滴涂于电极表面，4 ^oC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；将3 μL质量分数为1 %的BSA滴涂于电极表面，以封闭Ab₁上非特异性活性位点，4 ^oC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；将6 μL不同浓度的PCT滴涂于电极表面，4 ^oC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；将8µL 7 mg/mL的Ab₂[email protected]溶液滴涂于电极表面，4 ^oC冰箱保存至干燥，超纯水清洗，实现了二氧化铈和纳米银双增强苝四羧酸发光的电化学发光传感器的构建。

实施例4

将20 mL 10 mmol/L的柠檬酸钠溶液与85 mL 0.1 mol/L的尿素溶液混合，随后加入0.5 g CeCl₃和0.5 mL体积分数30 %的H₂O₂，搅拌1 h使其充分溶解，然后将溶解好的溶液加入聚四氟乙烯反应釜中，180 ^oC反应20 h；反应结束后，将所得溶液离心洗涤，60 ^oC干燥，实现了CeO₂纳米材料的制备；

将Na₂S、PVP、AgNO₃分别溶于乙二醇中，得到3 mmol/L的Na₂S溶液、20 mg/mL的PVP溶液、282 mmol/L的AgNO₃溶液；将30 mL乙二醇倒入圆底烧瓶中，150 ^oC下加热1 h，然后依次加入配制的Na₂S、PVP和AgNO₃溶液；逐滴滴加柠檬酸钠溶液至溶液颜色变为棕色，然后用冰水浴进行冷却反应；将溶液在4 ^oC下离心，乙醇和水交替洗涤，实现了AgNPs的制备；最后将制备的AgNPs分散到超纯水中，得到4 mg/mL的AgNPs 分散体；所述柠檬酸钠溶液以乙二醇为溶剂，柠檬酸钠溶液既能作为稳定剂防止AgNPs聚沉，其氧化物又可与AgNPs螯合使其带负电；

将10 mg PTCDA溶于10 mL 1 mol/L的NaOH溶液中，加热至PTCDA完全溶解且溶液颜色变为黄绿色，然后逐滴滴加1 mol/L的盐酸HCl至溶液颜色由黄绿色变为红色，将所得溶液离心洗涤至PH为7.4，实现了PTCA纳米材料的制备。

实施例5

将1 mL质量分数为1 %的PDDA溶液加入到2 mL制备的CeO₂溶液中，超声30 min使其充分混合，离心洗涤得到PDDA修饰的CeO₂沉淀；将离心所得沉淀溶于超纯水中，加入0.3 mL制备的AgNPs分散体，搅拌3 h得到[email protected]₂溶液；将[email protected]₂溶液离心洗涤，然后将离心所得沉淀再分散于超纯水中，实现了[email protected]₂溶液的制备，并在4 ^oC下保存备用；所述PDDA为阳离子聚合物电解质材料，其可与CeO₂结合使其带正电，故带正电荷的CeO₂可与带负电荷的AgNPs产生静电吸附得到[email protected]₂纳米复合材料。

实施例6

将0.05 g MWCNTs分散在50 mL超纯水中，超声1 h使其充分溶解，加入制备的PTCA纳米材料，继续超声2 h使PTCA和MWCNTs充分混合，得到[email protected]纳米复合材料；将50 mg制备的[email protected]纳米复合材料溶解在超纯水中，超声1 h使其充分溶解，随后将1 mL质量分数为2 %的HAuCl₄和10 mg PVP加入到上述溶液中，搅拌6 h后加入4 mL 50 mmol/L的柠檬酸钠溶液和少量NaBH₄，继续搅拌6 h，最后磁性分离去除未结合的AuNPs，得到[email protected]纳米复合材料；将[email protected]分散在5 mL PH为7.4的PBS中，加入500 μL 500 μg/mL的Ab₂，并在4 ^oC恒温震荡箱中培育12 h，然后加入100 μL质量分数为1 %的BSA以封闭非特异性活性位点，实现了Ab₂[email protected]溶液的制备，并在4 ^oC下保存备用；所述PBS，用1/15 mol/L的Na₂HPO₄和1/15 mol/L的KH₂PO₄配制。

实施例7

将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、构建传感器作为工作电极构建三电极体系，将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为-1.4-0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用10 mmol/L的K₂S₂O₈溶液作为底液，利用三电极体系检测在不同浓度PCT下产生的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线；所述K₂S₂O₈溶液，pH为6.0，用10 mmol/L的K₂S₂O₈和100 mmol/L的KCl溶于PBS配制。

实施例8

将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、构建传感器作为工作电极构建三电极体系，将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为-1.4-0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用50 mmol/L的K₂S₂O₈溶液作为底液，利用三电极体系检测在不同浓度PCT下产生的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线；所述K₂S₂O₈溶液，pH为7.4，用50 mmol/L的K₂S₂O₈和100 mmol/L的KCl溶于PBS配制。

实施例9

将银/氯化银Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、构建传感器作为工作电极构建三电极体系，将上述三电极连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起，光电倍增管高压设置为600 V，扫描电压设置为-1.4-0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；使用100 mmol/L的K₂S₂O₈溶液作为底液，利用三电极体系检测在不同浓度PCT下产生的电化学发光信号强度；根据所得电化学发光信号强度值与PCT浓度对数的线性关系绘制工作曲线；所述K₂S₂O₈溶液，pH为8.5，用100 mmol/L的K₂S₂O₈和100 mmol/L的KCl溶于PBS配制。

实施例10

在稀释的血清样品中加入不同浓度的PCT，采用标准加入法测定血清样品中PCT的相对标准偏差和平均回收率。由表1可以看出，血清样品中PCT的相对标准偏差为1.05-1.14 %，回收率为99.6-101 %，表明本发明可应用于实际生物样品的检测，且结果准确可靠。

表1：二氧化铈和纳米银双增强苝四羧酸发光的电化学发光传感器在血清样本中对PCT的检测结果。